测量房水流出设施与眼球顺应性 离体 使用注射泵系统的小鼠眼部给药

摘要

整合已建立的压力控制灌注方法中的分析手段，优化了一种简单且低成本的注射泵系统，用于评估小鼠眼球的流出道功能和眼顺应性。

摘要

维持眼内压（IOP）在适宜且稳定的水平对眼部健康至关重要。小梁网（TM）、施莱姆管（SC）以及整个角巩膜壳的生物力学特性在眼内压稳态中起着关键作用。流出易度（C）是评估TM和SC引流房水效率的关键参数，而眼球顺应性（ϕ）则反映了角巩膜壳的弹性以及通过TM和SC的瞬时流出情况。此前已开发出一种简单且成本较低的注射泵系统用于评估C值。然而，使用简单的线性回归方法对活体（in vivo）数据进行分析在表征TM和SC功能方面存在局限性。本研究通过引入已建立的压力控制型眼灌注系统所采用的分析方法，对注射泵系统进行了优化。在离体（ex vivo）眼球中测得的C和ϕ值与先前发表的灌注系统数据进行了比较，结果处于已报道的数值范围内。综上所述，这种简便且低成本的注射泵系统有助于评估TM和SC的生物力学特性。

引言

维持适当且稳定的眼内压（IOP）对眼部健康至关重要¹。持续性的眼内压升高是青光眼的主要危险因素^2,3。数月或数年内的长期眼内压波动也会导致视力丧失^4,5。近期研究发现另一种眼内压波动形式，即由日常活动引起的短暂性波动，也可能加速青光眼的进展^6,7。例如，一名有20年揉眼史的46岁男性和一名有10年揉眼史的52岁男性均表现出视盘损伤的加速进展^8,9。这些发现凸显了及时采取适当措施应对眼内压变化以最大限度降低视力丧失风险的重要性。

眼内压（IOP）由房水（AH）的生成与排出之间的平衡所调节¹⁰。房水主要通过常规途径和葡萄膜巩膜途径离开眼球¹¹。在正常眼和青光眼眼中，常规途径（包括小梁网（TM）和施勒姆管（SC））是影响眼内压稳态的主要流出阻力来源

方案

所有实验均遵循《视力研究动物使用ARVO声明》以及青岛大学医学中心实验室动物护理和使用指南（QDU-AEC-2022069）进行。

1. 动物选择与处理

1. 使用5个月大、遗传背景为50% C57BL/6和50% BALB/c的小鼠。实验设计中无需考虑性别因素。
2. 将小鼠饲养在12小时光照/12小时黑暗循环条件下，温度保持在23 ± 2 °C，相对湿度为50 ± 5%。

2. 眼内压测量

1. 在密闭容器中使用2.5%异氟烷和80%（体积/体积）氧气麻醉小鼠，持续3.5分钟。
   注意：异氟烷为挥发性麻醉剂。应在通风良好的区域或适当的密闭系统中进行麻醉操作。
2. 将小鼠转移至手术平台，通过面罩维持麻醉状态，持续额外30秒。
3. 所有测量应在9:00至12:00之间进行。每只眼睛记录三次测量值，并计算每个数据点的平均值。

3. 系统设置（图1）

1. 将一个 100 µL 注射器连接至注射泵。
2. 将注射器连接至流通式压力传感器。
3. 将传感器连接至数据采集系统。
   注意：确保压力传感器与眼....

结果

通过将5月龄小鼠的C值和ϕ值与先前发表的压力控制型眼灌注研究结果进行比较，评估了优化后注射泵系统的性能。使用Shapiro–Wilk检验评估图2F中数据集的正态性，并采用双尾配对Student t检验进行统计学比较。

如图2A–C所示，眼内压（IOP）、C_r,eye 和 Φ_r,eye 分别为14.0 mmHg（95%置信区间：13.2–14.8 mmHg）、5.2 nL/min/mmHg（95%置信区间：4.1–6.4 nL/min/mmHg）和46.0 nL/mmHg（95%置信区间：40.6–51.3 nL/mmHg）。注射泵系统测得的流出易度值与灌注系统所得结果相当（图2D）^31,3.......

讨论

本研究提出了一种优化的注射泵系统，用于评估小鼠眼球的流出道通畅性及眼球顺应性，所得数值与采用压力控制型眼灌注系统报道的结果一致。该方法在保持实验装置简单且易于实现的同时，提高了基于注射泵测量的准确性。这种在方法学上的改进与操作便捷性的结合，可能有助于在缺乏更先进设备的实验室中更广泛地推广应用。

该系统的主要优势在于提高了数据准确性，从而能够识别与房水流出及眼生物力学相关的关键基因和分子通路。这一改进有助于针对青光眼的药物干预和基因操作，同时支持对细微的年龄相关性变化、早期疾病进展以及短期内治疗反应的监测。例如，对C的准确评估促进了力学敏感性靶点的发现，如TRPV4介导的钙内流在调控小梁网力学特性及影响房水流出中的作用³⁸，以及压力依赖性一氧化氮释放在线粒体收缩性和Schlemm管松弛中的重要作用³⁹。对ϕ的精确计算表明，眼部顺应性随年龄增长出现细微下降，提示角巩膜硬度增加可能提高发生青光眼损伤的易感性³⁶。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂	1× PBS缓冲液	Thermo Fisher Scientific	10010023
异氟烷	深圳市瑞沃德生命科技有限公司，中国	R640
材料	100 μL高精度移液器	Hamilton	1710
硼硅酸盐玻璃	Sutter, Novato, CA	BF100-50-10
一次性无菌注射器	江西丰林医疗器械有限公司，中国	10 ml
压力传感器	IcuMedical	PX26-015G
硅胶管	南京润泽流体科技有限公司，中国	N/A
透明PTFE管	南京润泽流体科技有限公司，中国	N/A
设备	火焰/布朗移液器拉制仪	Sutter, Novato, CA	P-97
手动显微操作器	世界精密仪器公司（WPI）	M3301
金属浴	贝沃生物，苏州，中国	2016C
微电极烧制仪	Narishige科学仪器实验室，东京，日本	MF830
微电极研磨仪	MPInstrument有限公司，武汉，中国	KDG-02
PZMIII体视变倍双目显微镜	世界精密仪器公司（WPI）	PZMIII
注射泵	世界精密仪器公司（WPI）	AL-1000