测量房水流出设施与眼球顺应性 离体 使用注射泵系统的小鼠眼部给药

摘要

整合已建立的压力控制灌注方法中的分析手段，优化了一种简单且低成本的注射泵系统，用于评估小鼠眼球的流出道功能和眼顺应性。

摘要

维持眼内压（IOP）在适宜且稳定的水平对眼部健康至关重要。小梁网（TM）、施莱姆管（SC）以及整个角巩膜壳的生物力学特性在眼内压稳态中起着关键作用。流出易度（C）是评估TM和SC引流房水效率的关键参数，而眼球顺应性（ϕ）则反映了角巩膜壳的弹性以及通过TM和SC的瞬时流出情况。此前已开发出一种简单且成本较低的注射泵系统用于评估C值。然而，使用简单的线性回归方法对活体（in vivo）数据进行分析在表征TM和SC功能方面存在局限性。本研究通过引入已建立的压力控制型眼灌注系统所采用的分析方法，对注射泵系统进行了优化。在离体（ex vivo）眼球中测得的C和ϕ值与先前发表的灌注系统数据进行了比较，结果处于已报道的数值范围内。综上所述，这种简便且低成本的注射泵系统有助于评估TM和SC的生物力学特性。

引言

维持适当且稳定的眼内压（IOP）对眼部健康至关重要¹。持续性的眼内压升高是青光眼的主要危险因素^2,3。数月或数年内的长期眼内压波动也会导致视力丧失^4,5。近期研究发现另一种眼内压波动形式，即由日常活动引起的短暂性波动，也可能加速青光眼的进展^6,7。例如，一名有20年揉眼史的46岁男性和一名有10年揉眼史的52岁男性均表现出视盘损伤的加速进展^8,9。这些发现凸显了及时采取适当措施应对眼内压变化以最大限度降低视力丧失风险的重要性。

眼内压（IOP）由房水（AH）的生成与排出之间的平衡所调节¹⁰。房水主要通过常规途径和葡萄膜巩膜途径离开眼球¹¹。在正常眼和青光眼眼中，常规途径（包括小梁网（TM）和施勒姆管（SC））是影响眼内压稳态的主要流出阻力来源^12,13,14。因此，小梁网和施勒姆管的生物力学特性对于眼球适应眼内压变化至关重要^15,16,17。

近年来的技术进步使得对房水外流的评估更加准确。已开发出一些侵入性方法，例如基于重力的灌注系统和注射泵系统，用于计算外流易度（C），该参数可反映小梁网（TM）和施莱姆管（SC）对稳态外流的调控作用^{18,19,20,21,22,23,24}。一些非侵入性方法，如眼压描记法²⁵和荧光光度法²⁶，已在临床上用于测定青光眼患者的外流易度（C）。然而，大多数方法无法特异性地评估小梁网和施莱姆管的功能。例如，在注射泵系统中，稳态下的流量和压力数据通过简单的线性回归进行拟合，其斜率被解释为压力依赖性的外流易度（C）。然而，这种在活体小鼠中计算得到的外流易度（C）并不能准确反映通过传统途径的房水外流能力，因为它受到房水分泌、葡萄膜巩膜外流以及巩膜上静脉压的影响，正如Goldmann方程所描述的那样。

为解决这一局限性，Millar 等人通过多次恒定流速测量，基于安乐死后房水流入为零、无巩膜上静脉压以及葡萄膜巩膜外流保持不变的假设，在同一只小鼠眼球中计算了房水流入量、传统外流和葡萄膜巩膜外流²²2016年，Sherwood等人报道葡萄膜巩膜外流为0 离体 在0 mmHg眼内压下观察眼睛，随后通过引入幂律模型并使用iPerfusion（一种压力控制灌注系统，下文简称灌注系统）来探讨同一问题²⁷方法学的进步阐明了小梁网（TM）和睫状肌（SC）的不同作用，加深了对其在维持房水稳态流出中生理功能的理解。

此外，小梁网（TM）和Schlemm管（SC）对眼内压（IOP）波动的瞬时反应对于维持眼内压稳态至关重要。为了追踪这种运动，Xin等人开发了相敏光学相干断层扫描技术（OCT），可在秒级时间尺度上实现观测²⁸。三维连续块面扫描电子显微镜可在超微结构水平上研究此类运动²⁹。然而，基于图像的方法仅能估算TM和SC的生物力学特性，无法获得房水（AH）瞬时引流的实际数值。2019年，Sherwood等人在开发iPerfusion系统后，将眼顺应性（ϕ）计算为评估角巩膜弹性以及TM和SC瞬时反应的关键指标³⁰。这一进展为评估TM和SC在眼内压波动下的瞬时行为提供了定量参数。

基于这些在评估小梁网和睫状体功能方面的进展，本研究通过引入用于计算 C 的幂律模型，并整合新的方法来计算 ϕ，从而改进了注射泵系统。这些测量结果与使用灌注系统获得的已发表数据进行了比较，以评估优化后的注射泵系统是否适用于测量房水外流设施和眼球顺应性 离体 小鼠眼睛

方案

所有实验均遵循《视力研究动物使用ARVO声明》以及青岛大学医学中心实验室动物护理和使用指南（QDU-AEC-2022069）进行。

1. 动物选择与处理

1. 使用5个月大、遗传背景为50% C57BL/6和50% BALB/c的小鼠。实验设计中无需考虑性别因素。
2. 将小鼠饲养在12小时光照/12小时黑暗循环条件下，温度保持在23 ± 2 °C，相对湿度为50 ± 5%。

2. 眼内压测量

1. 在密闭容器中使用2.5%异氟烷和80%（体积/体积）氧气麻醉小鼠，持续3.5分钟。
   注意：异氟烷为挥发性麻醉剂。应在通风良好的区域或适当的密闭系统中进行麻醉操作。
2. 将小鼠转移至手术平台，通过面罩维持麻醉状态，持续额外30秒。
3. 所有测量应在9:00至12:00之间进行。每只眼睛记录三次测量值，并计算每个数据点的平均值。

3. 系统设置（图1）

1. 将一个 100 µL 注射器连接至注射泵。
2. 将注射器连接至流通式压力传感器。
3. 将传感器连接至数据采集系统。
   注意：确保压力传感器与眼杯支架处于同一高度，以避免产生压力伪影。
4. 用 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）填充系统，去除所有气泡。
5. 将眼球置于带有圆形凹槽（直径 4–6 mm）的支架中，确保穿刺过程中眼球保持稳定。将压力传感器与眼杯支架调节至同一高度。
   注意：位置错位可能导致压力测量误差。定制眼杯支架的 STL 设计文件作为补充文件 1提供。

4. 软件操作

1. 压力传感器校准
   1. 打开数据采集软件。加载 校准设置文件。选择 校准 功能。
   2. 将系统连接至两个已知高度的水储液罐。
   3. 使用以下换算关系输入测量压力和实际压力：
      1 cm H₂O = 0.735 mmHg
2. 泵的设置
   1. 打开模块设置。加载 调节器配置文件。
   2. 选择泵设备。输入 最大流速 和 注射器直径。
3. 数据记录
   1. 开始记录。
   2. 每次压力变化后停止记录。
   3. 输入下一个压力值。
   4. 重新开始记录。

5. 针头准备

1. 根据既定方案拉制玻璃微电极⁸。
2. 将尖端研磨至内径为 80–100 µm，并对针尖进行抛光处理。
   注意：操作玻璃针时应小心，避免造成伤害。
3. 将针固定在显微操作器上，并将针连接至压力传感器。
4. 用 PBS 填充针管。
5. 调整针尖位置，使其与压力传感器处于同一高度。
6. 阻力测量
   1. 施加 1 mmHg 的压力，记录流速。
   2. 计算针管阻力：
      
   3. 使用阻力在 0.01 至 0.5 mmHg/(µL/min) 范围内的针管。

6. 系统设施与合规性

1. 系统通透性测量
   1. 用 PBS 灌注系统，并使用三通阀密封系统。
   2. 施加 6、8、10、12、14 和 16 mmHg 的压力梯度。
   3. 在每个压力梯度下记录 P 和 Q 持续 10 分钟，取最后 5 分钟的数据计算平均值。
   4. 进行线性回归分析，将斜率解释为系统的通透性。
2. 验证
   1. 重复测量 3 次。
   2. 确认系统通透性小于 0.2 nL/min/mmHg。
3. 顺应性测量
   1. 将一段 35 cm 的硅胶管引入系统中。
   2. 测量有和无聚四氟乙烯（Teflon）管时的顺应性。
   3. 采用离散体积法计算体积变化¹⁴。
   4. 确定系统顺应性为 4 nL/mmHg。
4. 灵敏度检查
   1. 确认可检测到的系统顺应性大于 9.9 nL/mmHg。

7. 去核

1. 使用流速为 0.7 L/min 的 CO₂ 处死小鼠，持续 3 分钟。
   注意：CO₂ 处死必须遵循机构指南，以确保人道终点。
2. 使用无菌器械解剖眼外肌和视神经。摘除眼球。
3. 立即将一只眼球在 35.5 °C 下安装至固定装置中。
4. 将对侧眼球储存在 4 °C 环境中。
5. 使用同一系统测量双眼。

8. 插管

1. 进针
   1. 以45°角将针头穿过中央角膜插入。
   2. 将针头向前推进至前房内0.3–0.5 mm深度。
2. 验证
   1. 稳定系统，确认在最后5分钟内压力波动≤0.4 mmHg。

9. 眼部 C_r

1. 将眼压稳定在 8 mmHg，持续 30 分钟。
2. 依次施加 6、8、10、12、14 和 16 mmHg 的压力梯度。
3. 最后再次施加 8 mmHg 的压力步骤。
4. 数据采集
   1. 将最大流速设置为 4 µL/min。
   2. 在每个压力水平下记录 10 分钟的 P 和 Q 值。
5. 分析
   1. 绘制 P–T 和 Q–T 曲线，取最后 5 分钟的数据计算平均值。
   2. 将数据拟合至幂律模型²⁷：
      
6. 将（扣除系统背景值后的）C_r 定义为眼内流出设施。
7. 设定 P_r = 8 mmHg。
8. 将 β 定义为非线性系数。

10. 眼部 Φ_r

1. 在压力递增过程中分析 P–T 和 Q–T 曲线。识别流量增加至 Q_max 以及随后的减速过程。
2. 使用离散体积法³⁰计算 t_p 与 t_max 之间的体积变化。
3. 将数据拟合至修正的 Friedenwald 方程³⁰：
   
4. 设定 P_r = 13 mmHg。将 Φ_r （扣除系统顺应性后）定义为眼顺应性 Φ_r,_eye，γ 定义为材料参数。

结果

通过将5月龄小鼠的C值和ϕ值与先前发表的压力控制型眼灌注研究结果进行比较，评估了优化后注射泵系统的性能。使用Shapiro–Wilk检验评估图2F中数据集的正态性，并采用双尾配对Student t检验进行统计学比较。

如图2A–C所示，眼内压（IOP）、C_r,eye 和 Φ_r,eye 分别为14.0 mmHg（95%置信区间：13.2–14.8 mmHg）、5.2 nL/min/mmHg（95%置信区间：4.1–6.4 nL/min/mmHg）和46.0 nL/mmHg（95%置信区间：40.6–51.3 nL/mmHg）。注射泵系统测得的流出易度值与灌注系统所得结果相当（图2D）^31,3...

讨论

本研究提出了一种优化的注射泵系统，用于评估小鼠眼球的流出道通畅性及眼球顺应性，所得数值与采用压力控制型眼灌注系统报道的结果一致。该方法在保持实验装置简单且易于实现的同时，提高了基于注射泵测量的准确性。这种在方法学上的改进与操作便捷性的结合，可能有助于在缺乏更先进设备的实验室中更广泛地推广应用。

该系统的主要优势在于提高了数据准确性，从而能够识别与房水流出及眼生物力学相关的关键基因和分子通路。这一改进有助于针对青光眼的药物干预和基因操作，同时支持对细微的年龄相关性变化、早期疾病进展以及短期内治疗反应的监测。例如，对C的准确评估促进了力学敏感性靶点的发现，如TRPV4介导的钙内流在调控小梁网力学特性及影响房水流出中的作用³⁸，以及压力依赖性一氧化氮释放在线粒体收缩性和Schlemm管松弛中的重要作用³⁹。对ϕ的精确计算表明，眼部顺应性随年龄增长出现细微下降，提示角巩膜硬度增加可能提高发生青光眼损伤的易感性³⁶。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂	1× PBS缓冲液	Thermo Fisher Scientific	10010023
异氟烷	深圳市瑞沃德生命科技有限公司，中国	R640
材料	100 μL高精度移液器	Hamilton	1710
硼硅酸盐玻璃	Sutter, Novato, CA	BF100-50-10
一次性无菌注射器	江西丰林医疗器械有限公司，中国	10 ml
压力传感器	IcuMedical	PX26-015G
硅胶管	南京润泽流体科技有限公司，中国	N/A
透明PTFE管	南京润泽流体科技有限公司，中国	N/A
设备	火焰/布朗移液器拉制仪	Sutter, Novato, CA	P-97
手动显微操作器	世界精密仪器公司（WPI）	M3301
金属浴	贝沃生物，苏州，中国	2016C
微电极烧制仪	Narishige科学仪器实验室，东京，日本	MF830
微电极研磨仪	MPInstrument有限公司，武汉，中国	KDG-02
PZMIII体视变倍双目显微镜	世界精密仪器公司（WPI）	PZMIII
注射泵	世界精密仪器公司（WPI）	AL-1000