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果蝇（Drosophila melanogaster）眼部-触角及翅成虫盘的小规模解剖与抗体染色

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DOI：

10.3791/70434

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2026年5月15日

 , 
1Department of Developmental and Cell Biology, Charlie Dunlop School of Biological Sciences, University of California, Irvine, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Irvine

本文内容

摘要

本文介绍了一种高效且节省试剂的成虫盘解剖与抗体染色方案，便于对少量成虫盘进行操作和处理。

摘要

Drosophila 的成虫盘长期以来被用作上皮发育、图式形成和再生研究的模型。通过抗体标记和成像技术对解剖得到的成虫盘进行观察，对于可视化蛋白表达模式、揭示发育和生理过程的标志物具有重要意义。该成虫盘解剖与标记方法最初由 Tomlinson 和 Ready 为眼-触角成虫盘的免疫电镜研究而建立。通过使用60孔微孔板，并采用转移组织而非更换溶液的方式，可在几乎不浪费试剂的情况下对每个组织样本进行独立操作。即使单个成虫盘也可被处理。该方法仅需少量抗体及其他试剂。作为该方法应用于其他小型组织的示例，本文还展示了如何采用相同方法对翅成虫盘进行解剖和标记。类似的方法可推广至任何尺寸相近的小型组织，也可用于除抗体染色外的其他组织化学和标记技术。

引言

Drosophila 成虫盘是胚胎发育过程中预留的前体组织，它们在幼虫体内生长但不分化，并在蛹期发育为成体的表皮结构1。对成虫盘的研究已为发育模式形成机制提供了诸多见解，其中眼成虫盘和翅成虫盘的研究尤为深入2,3,4,5,6。免疫组织化学技术在研究成虫盘中基因表达的时空模式以及细胞行为（如细胞分裂和细胞死亡）方面具有重要作用。

为了满足对抗体标记的果蝇眼成虫盘进行电子显微镜分析所提出的额外要求，Tomlinson 和 Ready 开发了一种小规模实验方案，该方法在试剂使用上尤为节省，并具有很高的可靠性与可定制性7。该方法已有书面描述，但尚无视频资料可供参考3,8,9。该方法可轻松修改，用于标记其他成虫盘（或其他组织），除眼-触角成虫盘外，也可应用于翅成虫盘。

果蝇Drosophila成虫盘的抗体标记遵循适用于任何组织的一般流程10（图1）。组织需先解剖并固定，然后与针对目标蛋白的特异性抗体孵育。洗去未结合的抗体后，加入标记过的（通常为荧光标记）二抗，该二抗与已结合在固定组织中目标蛋白上的初抗相结合。再经洗涤去除未结合的二抗后，可将组织封片用于显微镜观察，从而可视化目标蛋白。该过程已有多种通用描述，均可应用于成虫盘及其他果蝇Drosophila组织11。本文提供了一种适用于Tomlinson & Ready方法的实验方案，其中组织样本在微孔板的小型孵育孔之间逐个转移，并在每一步均通过体视显微镜进行观察（图2）。该方法最适合一次处理少量组织（数十个样本），而不适用于大批量样本（例如数百个）。该方法每个孔仅需13 µL的小体积溶液，因此抗体用量极少。由于组织损失极小，无最小样本量限制，甚至单个成虫盘也能被可靠地处理。

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方案

所用试剂和设备列于材料表中。

1. 制作转移工具

  1. 使用钳子截取约 2.5 cm 长、直径为 0.005” 的钨丝。用镊子将钨丝一端弯成钩状或环状（图 3）。将另一端插入持针器中。该工具用于转移琼脂片，且几乎不携带液体。两种形状中，环状可能更易操作，但钩状在溶液间转移的液体量更少。

2. 解剖并固定眼-触角成虫盘

  1. 用约7.5 mL 0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 7.2）在培养皿（直径60 mm）中冲洗幼虫，以去除果蝇培养基或其他碎屑。若需解剖翅成虫盘而非眼-触角成虫盘，请参见步骤6。这两种成虫盘均位于虫体前部图4).
    注意：在步骤 2.1–2.3 中，也可使用 PBS 代替磷酸盐缓冲液。
  2. 将幼虫转移至含有新鲜缓冲液的培养皿中。
    注意：一些研究人员倾向于在60 mm培养皿中的单个缓冲液滴内解剖单个幼虫；另一些则使用凹玻片。
  3. 在体视显微镜下观察时，用镊子夹住幼虫体部约一半位置。用另一对精细镊子夹住口钩并轻轻拉出，眼-触角成虫盘将随口器一同被拉出。脑组织也可能附着在眼成虫盘上。
  4. 使用金属丝工具将解剖后的组织转移至一个含有约3 mL固定液的小型培养皿（直径35 mm）中，固定液可为0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 7.2）中稀释的3.7%甲醛溶液，该溶液通过将37%甲醛储备液用缓冲液稀释制得。
    注意：请遵循当地批准的甲醛处理安全规程。3.7% 甲醛是一种简单的固定剂，在许多情况下已足够适用，但某些抗原可能需要其他更优的固定剂。PBS 或 PEM（0.1 M PIPES pH 7.0，2 mM MgSO₄）4, 1 mM EGTA）可代替0.1 M磷酸钠作为固定缓冲液，或者通过溶解固体多聚甲醛来配制甲醛溶液，而非使用浓缩储存液。固定剂多聚甲醛-赖氨酸-高碘酸盐（PLP）结合了较温和的蛋白质固定与碳水化合物交联作用，能更好地保存膜结构12。该 黑腹果蝇 例如，糖蛋白 Scabrous 在 PLP 固定后仍保持抗原性，而在甲醛固定后则失去抗原性。请按以下步骤新鲜配制 PLP：（1）在通风橱中，将 2 g 多聚甲醛粉末加入 25 mL 去离子水中，置于锥形瓶内，低温加热搅拌；（2）将移液管浸入 50% 氢氧化钠储备液中，蘸取极微量液体（远少于一滴）加入上述混合液中。多聚甲醛应在数分钟内溶解，过程中溶液不得煮沸。在冷却 8% 甲醛溶液的同时，将 0.36 g 赖氨酸溶于 10 mL 去离子水、7.5 mL 0.1 M 磷酸钠缓冲液（pH 7.2）和 2.5 mL 0.1 M Na2HPO4 并置于冰上保存。取15 mL预冷的缓冲赖氨酸溶液，加入5 mL新鲜的8%甲醛溶液和50 mg高碘酸钠于50 mL螺口离心管中，涡旋混匀，现配现用。
  5. 室温下放置15–20分钟后，将解剖后的组织转移至另一含有0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 7.2）的培养皿中。
    注意：也可使用 PBS 替代磷酸盐缓冲液。对于某些抗原，或当需要对组织中表达的 GFP 或 RFP 的内源性荧光进行成像时，建议在冰上固定。PLP 固定始终在冰上进行，时间为 45 分钟。

3. 封闭并用一抗孵育

  1. 将组织转移至含有约 3 mL NSG 抗体洗涤缓冲液的 35 mm 培养皿中进行封闭。将培养皿置于冰上孵育至少 15 分钟。NSG 为 0.1 M 磷酸钠缓冲液（pH 7.2）、0.1% 皂苷、5% 正常山羊血清。洗涤缓冲液储备液经滤膜除菌后于 4 °C 保存。
    注意：不同抗体可能需要使用不同的洗涤缓冲液。例如，皂苷是一种温和的非离子型去污剂，主要溶解质膜；而检测核内抗原时，可能更适合使用其他去污剂。再如，Jarman 等人13开发的针对核蛋白 Atonal 的抗体，在含有 NP40 作为去污剂的缓冲液中免疫反应性最强。替代性洗涤缓冲液（PDT、PBT 或 NSG）的配方见《材料表》。当使用正常血清作为封闭蛋白时，理想情况下应选择与二抗来源物种相同的血清，例如，若使用山羊来源的二抗，则选用正常山羊血清；若使用驴来源的二抗，则选用正常驴血清。但在实际操作中，这种差异影响甚微。
  2. 在封闭过程中，使用精细镊子清除眼-触角成虫盘上除口钩以外的多余组织。暂时保留口器部分，以便后续转移操作。
    注意：额外组织（如脑组织）也可保留至载玻片封片步骤（步骤 5.4），只要其不影响染色效果或观察即可。
  3. 封闭期间，用 NSG 缓冲液将 mAb40-1a 抗体溶液稀释至 1:100，例如将 1 µL 抗体加入 100 µL NSG 中。通过移液器吹打混匀，切勿涡旋震荡。
    注意：mAb40-1a 是一种针对 β-半乳糖苷酶的单克隆抗体。最佳抗体稀释比例和洗涤缓冲液的选择取决于所用的具体抗体。
  4. 在 60 孔微型培养板第一列的最多六个孔中，每孔加入 13 µL 抗体溶液。为保证光学清晰度，应使用侧壁直立的锥形微孔。若需使用超过六个孔，可另起一个新的微型培养板。
  5. 使用金属丝环或钩逐个将眼-触角成虫盘（最好仍连同口器）转移至一抗溶液中。
    注意：每孔可添加的成虫盘数量取决于抗体种类。组织过多可能导致某些抗体被耗尽，从而降低标记效率。通常每孔放置 5 对成虫盘较为合适。因此，使用 6 行 × 60 孔的微孔板可轻松完成约 60 个成虫盘的标记。不同行可使用不同的抗体。抗体溶液是否可重复使用需根据具体情况进行实验验证；本实验室通常不重复使用。
  6. 盖上培养板盖，并用封口膜密封以减少蒸发。于冰上或 4 °C 孵育 4 小时至过夜。无需摇动。
    注意：抗体孵育的最佳时间和温度取决于具体抗体。多数情况下，室温孵育 1–2 小时已足够；但某些抗体在 4 °C 孵育后效果更佳，且常可选择在 4 °C 过夜孵育以提高便利性。极少数情况下，一抗孵育时间长达 2–3 天可能更优。仅当孵育时间超过约 4 小时时，才需要对微孔板盖进行密封。

4. 清洗并用二抗孵育

  1. 向每个抗体孔后的接下来三列孔中各加入13 µL NSG缓冲液，因为样品将被洗涤三次。依次将样品转移至各洗涤孔中，每孔洗涤5分钟。
  2. 洗涤时，用NSG缓冲液配制1:200–400稀释的荧光标记二抗溶液，例如将0.5 µL抗体加入100 µL NSG缓冲液中。通过移液混匀，避免涡旋振荡。稀释前，将二抗原液在最大转速下离心60 s，以去除可能非特异性结合组织表面的抗体聚集体。
    注意：最佳二抗稀释比例可能因生产商而异。可提供经交叉吸附处理的 Alexa 或 Cyanine 偶联抗体，以适用于多种物种的多重标记。
  3. 加入13 µL二抗溶液至下一个（5th孔板中的列
  4. 使用接种环或钩子将样本转移至二抗中。
  5. 用盖子盖好培养板，并用封口膜密封以减少蒸发。在冰上孵育4小时至过夜。
    注意：抗体孵育的最佳时间和温度取决于具体的抗体。在许多情况下，室温孵育1–2小时已足够，但某些抗体在4 °C孵育时效果更佳，且通常可选择在4 °C过夜孵育以方便实验安排。仅当孵育时间超过约4小时时，才需要密封微孔板盖。

5. 显微镜观察前的组织洗涤与封片

  1. 在二抗孵育孔之后，用 13 µL NSG 准备接下来的三列孔。将样品逐孔转移，每孔孵育 5 分钟。
  2. 将样品转移至第 9个孔中进行最终洗涤，加入 13 µL 0.1 M 磷酸钠缓冲液（pH 7.2）。当洗涤缓冲液中含有在封片剂中会沉淀的成分时，此缓冲液洗涤步骤是必要的。
  3. 向最终的（第 10个）孔中加入 13 µL 封片剂。封片剂的配制方法为：将 2% 正丙基没食子酸酯溶解于 75% 甘油和 25% 0.1 M 磷酸钠缓冲液（pH 7.2）中。每周新鲜配制，将各组分在旋转平台上混合均匀。使用前让其中的气泡完全消失。
    注意：市面上也可购买到商业化的封片剂。
  4. 用移液器吸取 20 µL 封片剂滴加到洁净的显微镜载玻片上。将样品转移至载玻片上的封片剂中。这是去除不需要组织的最后机会。必须从眼-触角原基中去除口器角质层结构。
  5. 为防止盖玻片压下时样品漂移，可用金属丝工具将样品从主液滴中轻轻拖出。用镊子小心地将一块洁净的 #1.5 厚度、22 mm × 40 mm 的盖玻片缓缓放下，覆盖在样品上，避免引入气泡。
  6. 将载玻片置于纸板载玻片盒中静置 1 小时，使封片剂 充分沉降。在此期间避免移动载玻片，因为脆弱的样品在盖玻片移动时可能受损。
  7. 待盖玻片完全沉降后，用指甲油密封边缘。操作时切勿移动或按压盖玻片。密封后至少静置 1 小时，待指甲油完全干燥后再进行成像。
    注意：遗憾的是，目前大多数化妆品用指甲油所含溶剂在玻璃载玻片上无法均匀铺展，因而不适用，必须使用专用于科研的指甲油。
  8. 将载玻片储存于 4 °C。样品通常可在数月内多次成像和重复成像。
    注意：载玻片也可储存于 -20 °C。

6. 解剖并固定翅成虫盘

  1. 若要解剖翅成虫盘而非眼-触角成虫盘，请按照以下步骤替代上述步骤 2.3–2.5。
  2. 在解剖显微镜下，用精细镊子夹住幼虫口器。使用显微解剖剪从幼虫前端向下约 30%–40% 处将幼虫剪为两段。
  3. 用另一对镊子撑开幼虫被剪开的前端切口，将头部和口器向内推入，使幼虫前段翻转，类似于将袜子内翻。
  4. 用镊子将翻转后的幼虫前段转移至含有约 2.5 mL 固定液的小培养皿（直径 35 mm）中，固定液例如为 0.1 M 磷酸钠缓冲液（pH 7.2）中配制的 3.7% 甲醛，可通过将 37% 甲醛储备液用 PBS 稀释获得。
    注意：如有需要，可将翻转后的幼虫残体转移至微量离心管中含 400 µL 固定液的溶液中，以便在通风橱内完成固定。适用于眼成虫盘固定的固定液选项同样适用于翅成虫盘固定（参见步骤 2.4 的注释）。用于标记眼-触角成虫盘的最佳固定条件通常也适用于翅成虫盘。
  5. 室温固定 15–20 分钟后，将解剖得到的组织转移至另一含有 0.1 M 磷酸钠缓冲液（pH 7.2）的培养皿中。
    注意：适用于眼成虫盘固定的洗涤缓冲液选项同样适用于翅成虫盘固定（参见步骤 2.4 的注释）。用于标记眼-触角成虫盘的最佳洗涤缓冲液通常也适用于翅成虫盘。
  6. 使用精细镊子从幼虫体内取出翅成虫盘。若仍附着，较小的平衡棒成虫盘和足成虫盘可在此时一并去除，或保留在翅成虫盘上以方便后续转移。
    注意： 翅成虫盘在残体中可能不易观察，直至脂肪体或其他组织被移除（移除任何组织前务必先准确识别）。翅成虫盘是最大的成虫盘，附着于体壁，紧邻气管，呈泪滴状，轮廓类似南美洲1（图 4）。
  7. 继续执行上述步骤 3–5。

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结果

Tomlinson 和 Ready 实验方案通常能获得优异的抗体染色结果。此处展示了三重标记的眼、触角和翅成虫盘图像。图 5A 显示了三龄幼虫期眼-触角成虫盘的三重标记，用于检测转录因子 Senseless（蓝色）、神经前体细胞标记物 Elav（红色），以及表达针对 Ocho 转录本的 RNAi 细胞克隆的抗-GFP 标记（绿色）。图 5B 显示了三龄幼虫期翅成虫盘使用 TIE-DYE 系统进行标记，该系统可分别通过抗-GFP（绿色）、抗-ß-半乳糖苷酶（蓝色）以及 RFP 蛋白的内源性荧光（红色）独立标记克隆谱系14。此类研究已被用于分析多种基因型对细胞生长和命运决定的影响，例如参见 Blanco 等人15。

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讨论

采用 Tomlinson 和 Ready 方法，使用 60 孔锥形孔板对 Drosophila 组织进行抗体染色，结果优异且高度可靠，因为在每一步操作过程中均可在解剖显微镜下追踪每个成虫盘。该方法仅需少量抗体试剂，且由于样品转移时携带的液体极少，每一步的溶液更换更为彻底。该方法特别适用于处理数量较少的样品，避免在批量处理方法中因每一步骤无法单独观察而导致样品丢失或损伤。该方法在以下情况尤其有用：（1）只能获得少量样品，例如，（i）目标基因型难以获得，或（ii）幼虫接受了某种实验处理从而限制了其数量；（2）样品必须单独处理，例如，使用不同抗体标记同一个体的左右成虫盘，或标记同一个体的眼-触角盘和翅盘；（3）需平行处理多个样品，例如，每个孔板可同时处理多达六种基因型，或以六种不同方式标记同一种基因型；（4）洗涤步骤必须精确控制。例如，用针对 Enhancer-of-split 家族 bHLH 蛋白的单克隆抗体孵育的标本，洗涤时间只能约为 2 分钟，否则信号将减弱16。

该方法最适合用于处理少量幼虫以进行成虫盘标记（1–1...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

NEB感谢Andrew Tomlinson分享该方法，感谢Lucy Firth对方法的优化。感谢Abhishek Bhattacharya贡献了图5A。感谢Joyner Cruz、Jonathan Gonzalez、Chelsea Nguyen和Jensen Northrup的贡献。作者实验室的研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）基金（GM120451和CA284362）资助。图2和图4使用Biorender绘制。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
磷酸氢二钠Fisher7558-79-4Na2HPO4 — 无水磷酸氢二钠。可使用其他水合状态的试剂，但分子量会有所不同
镊子：Dumont #5 生物学镊子精细科学工具11252-20型号：#5
          尖端形状：直型
            长度：11cm
          可高压灭菌：是
          尖端类型：生物学用途
         尖端尺寸：
         0.05 × 0.02 mm
          合金/材料：Inox
甲醛FisherBP531-500分子生物学级，37% 甲醛溶液，500ml
甲醛固定液FisherBP531-500将37%甲醛原液稀释，配制成0.1M 磷酸钠缓冲液（pH 7.2）中含3.7%甲醛的固定液
甘油Fisher BioreagentsBP229-1
冰用户自选
L-赖氨酸，98%ThermoscientificJ62225.22
mAb40-1DHSB40-1a-s抗β-半乳糖苷酶抗体
微量离心管USA scientific1615-55201.5mL 管，用于样品保存
显微解剖剪精细科学工具15003-08切割刃长5mm，直头尖端，全长8.5cm
磷酸二氢钠Fisher7558-80-7NaH2PO4 — 无水磷酸二氢钠。若使用水合形式，配制0.1M溶液所需的重量将发生变化
封片剂在0.1M 磷酸钠缓冲液（pH 7.2）中配制75%甘油溶液，并加入2.5%正丙基没食子酸酯。通过倒置混匀以减少气泡
NSG0.1M 磷酸钠缓冲液（pH 7.2），含0.1%皂苷和5%正常山羊血清（NGS）
正丙基没食子酸酯MP Biomedicals210274780
指甲油Ted Pella，购自 FisherNC0381432用于封固载玻片
持针器FisherNC0099380用于显微解剖针。空心不锈钢材质；手柄长度：4 3/4"
Nunc 微孔迷你托盘Thermo Scientific12565155适用于血清学应用的 MicroWell 迷你托盘，共60孔
Parafilm 封口膜StatLabPM996StatLab ParaFilm M 自密封柔性薄膜
多聚甲醛Polysciences, Inc.00380-250
10x PBS用户自选在合适容器中加入800 mL 蒸馏水。
          向溶液中加入1.37M 氯化钠。
           向溶液中加入26.8mM 氯化钾。
           向溶液中加入101mM 磷酸氢二钠。
         向溶液中加入18.0mM 磷酸二氢钾。
         调节溶液至所需pH值（通常pH ≈ 7.4）。
         加入蒸馏水至总体积为1 L。
PBT用户自选0.1M 磷酸钠缓冲液（pH 7.2），含0.1% 牛血清白蛋白和0.2% Triton X-100
PDT用户自选0.1M 磷酸钠缓冲液（pH = 7.2），含0.3% 脱氧胆酸钠和0.3% Triton X-100
培养皿FalconCorning 351007培养皿；直径60mm；未处理
培养皿FalconCorning 351008培养皿；直径35mm；未处理
钳子用户自选
PLPn/a含2%多聚甲醛和1.35%赖氨酸的0.05M 磷酸钠缓冲液（pH 7.2）
二抗Jackson ImmunoResearch715-545-1510.5mg Alexa Fluor 488 标记的驴抗小鼠IgG
盖玻片VWR48393-172VWR #1.5 盖玻片 22×40（整箱）
载玻片Fisher125442Fisher 玻璃载玻片 10片/盒
脱氧胆酸钠Thermo Fisher Sci89904脱氧胆酸钠去污剂；5mg
高碘酸钠Sigma Aldrich71859-25G高碘酸钠 – 25克
磷酸钠缓冲液0.1M NaPO4 缓冲液（pH 7.2）。将28ml 0.1M 无水磷酸二氢钠储备液（11.998g NaH2PO4 溶于1L蒸馏水）与72ml 0.1M 无水磷酸氢二钠储备液（14.196g Na2HPO4 溶于1L蒸馏水）混合，得到100ml 0.1M NaPO4 缓冲液。也可使用PBS替代
钨丝Ted Pella27-11直径 .005”
Triton X-100Thermo Fisher SciA16046AE
涡旋振荡器用户自选

参考文献

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