果蝇（Drosophila melanogaster）眼部-触角及翅成虫盘的小规模解剖与抗体染色

摘要

本文介绍了一种高效且节省试剂的成虫盘解剖与抗体染色方案，便于对少量成虫盘进行操作和处理。

摘要

Drosophila 的成虫盘长期以来被用作上皮发育、图式形成和再生研究的模型。通过抗体标记和成像技术对解剖得到的成虫盘进行观察，对于可视化蛋白表达模式、揭示发育和生理过程的标志物具有重要意义。该成虫盘解剖与标记方法最初由 Tomlinson 和 Ready 为眼-触角成虫盘的免疫电镜研究而建立。通过使用60孔微孔板，并采用转移组织而非更换溶液的方式，可在几乎不浪费试剂的情况下对每个组织样本进行独立操作。即使单个成虫盘也可被处理。该方法仅需少量抗体及其他试剂。作为该方法应用于其他小型组织的示例，本文还展示了如何采用相同方法对翅成虫盘进行解剖和标记。类似的方法可推广至任何尺寸相近的小型组织，也可用于除抗体染色外的其他组织化学和标记技术。

引言

Drosophila 成虫盘是胚胎发育过程中预留的前体组织，它们在幼虫体内生长但不分化，并在蛹期发育为成体的表皮结构¹。对成虫盘的研究已为发育模式形成机制提供了诸多见解，其中眼成虫盘和翅成虫盘的研究尤为深入^2,3,4,5,6。免疫组织化学技术在研究成虫盘中基因表达的时空模式以及细胞行为（如细胞分裂和细胞死亡）方面具有重要作用。

为了满足对抗体标记的果蝇眼成虫盘进行电子显微镜分析所提出的额外要求，Tomlinson 和 Ready 开发了一种小规模实验方案，该方法在试剂使用上尤为节省，并具有很高的可靠性与可定制性⁷。该方法已有书面描述，但尚无视频资料可供参考^3,8,9。该方法可轻松修改，用于标记其他成虫盘（或其他组织），除眼-触角成虫盘外，也可应用于翅成虫盘。....

方案

所用试剂和设备列于材料表中。

1. 制作转移工具

1. 使用钳子截取约 2.5 cm 长、直径为 0.005” 的钨丝。用镊子将钨丝一端弯成钩状或环状（图 3）。将另一端插入持针器中。该工具用于转移琼脂片，且几乎不携带液体。两种形状中，环状可能更易操作，但钩状在溶液间转移的液体量更少。

2. 解剖并固定眼-触角成虫盘

1. 用约7.5 mL 0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 7.2）在培养皿（直径60 mm）中冲洗幼虫，以去除果蝇培养基或其他碎屑。若需解剖翅成虫盘而非眼-触角成虫盘，请参见步骤6。这两种成虫盘均位于虫体前部图4).
   注意：在步骤 2.1–2.3 中，也可使用 PBS 代替磷酸盐缓冲液。
2. 将幼虫转移至含有新鲜缓冲液的培养皿中。
   注意：一些研究人员倾向于在60 mm培养皿中的单个缓冲液滴内解剖单个幼虫；另一些则使用凹玻片。
3. 在体视显微镜下观察时，用镊子夹住幼虫体部约一半位置。用另一对精细镊子夹住口钩并轻轻拉出，眼-触角成虫盘将随口器一同被拉出。脑组织也可能附着在眼成虫盘上。

结果

Tomlinson 和 Ready 实验方案通常可获得优异的抗体染色结果。此处展示了三重标记的眼、触角和翅成虫盘图像。图 5A 显示一个三龄幼虫期眼-触角成虫盘，进行了三重标记以检测转录因子 Senseless（蓝色）、神经前体细胞标志物 Elav（红色），以及表达针对 Ocho 转录本的 RNAi 细胞克隆的抗-GFP 标记（绿色）。图 5B 显示一个三龄幼虫期翅成虫盘，使用 TIE-DYE 系统进行标记，该系统可分别通过抗-GFP（绿色）、抗-ß-半乳糖苷酶（蓝色）以及 RFP 蛋白的内源性荧光（红色）独立地标记克隆谱系¹⁴。此类研究已被用于分析多种基因型对细胞生长和命运决定的影响，例如参见 Blanco 等人¹⁵。

讨论

采用 Tomlinson 和 Ready 方法，使用 60 孔锥形孔板对 Drosophila 组织进行抗体染色，结果优异且高度可靠，因为在每一步操作过程中均可在解剖显微镜下追踪每个成虫盘。该方法仅需少量抗体试剂，且由于样品转移时携带的液体极少，每一步的溶液更换更为彻底。该方法特别适用于处理数量较少的样品，避免在批量处理方法中因每一步骤无法单独观察而导致样品丢失或损伤。该方法在以下情况尤其有用：（1）只能获得少量样品，例如，（i）目标基因型难以获得，或（ii）幼虫接受了某种实验处理从而限制了其数量；（2）样品必须单独处理，例如，使用不同抗体标记同一个体的左右成虫盘，或标记同一个体的眼-触角盘和翅盘；（3）需平行处理多个样品，例如，每个孔板可同时处理多达六种基因型，或以六种不同方式标记同一种基因型；（4）洗涤步骤必须精确控制。例如，用针对 Enhancer-of-split 家族 bHLH 蛋白的单克隆抗体孵育的标本，洗涤时间只能约为 2 分钟，否则信号将减弱¹⁶。

该方法最适合用于处理少量幼虫以进行成虫盘标记（1–1.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸氢二钠	Fisher	7558-79-4	Na2HPO4 — 无水磷酸氢二钠。可使用其他水合状态的试剂，但分子量会有所不同
镊子：Dumont #5 生物学镊子	精细科学工具	11252-20	型号：#5
			尖端形状：直型
			长度：11cm
			可高压灭菌：是
			尖端类型：生物学用途
			尖端尺寸：
			0.05 × 0.02 mm
			合金/材料：Inox
甲醛	Fisher	BP531-500	分子生物学级，37% 甲醛溶液，500ml
甲醛固定液	Fisher	BP531-500	将37%甲醛原液稀释，配制成0.1M 磷酸钠缓冲液（pH 7.2）中含3.7%甲醛的固定液
甘油	Fisher Bioreagents	BP229-1
冰	用户自选
L-赖氨酸，98%	Thermoscientific	J62225.22
mAb40-1	DHSB	40-1a-s	抗β-半乳糖苷酶抗体
微量离心管	USA scientific	1615-5520	1.5mL 管，用于样品保存
显微解剖剪	精细科学工具	15003-08	切割刃长5mm，直头尖端，全长8.5cm
磷酸二氢钠	Fisher	7558-80-7	NaH2PO4 — 无水磷酸二氢钠。若使用水合形式，配制0.1M溶液所需的重量将发生变化
封片剂			在0.1M 磷酸钠缓冲液（pH 7.2）中配制75%甘油溶液，并加入2.5%正丙基没食子酸酯。通过倒置混匀以减少气泡
NSG			0.1M 磷酸钠缓冲液（pH 7.2），含0.1%皂苷和5%正常山羊血清（NGS）
正丙基没食子酸酯	MP Biomedicals	210274780
指甲油	Ted Pella，购自 Fisher	NC0381432	用于封固载玻片
持针器	Fisher	NC0099380	用于显微解剖针。空心不锈钢材质；手柄长度：4 3/4"
Nunc 微孔迷你托盘	Thermo Scientific	12565155	适用于血清学应用的 MicroWell 迷你托盘，共60孔
Parafilm 封口膜	StatLab	PM996	StatLab ParaFilm M 自密封柔性薄膜
多聚甲醛	Polysciences, Inc.	00380-250
10x PBS	用户自选		在合适容器中加入800 mL 蒸馏水。
			向溶液中加入1.37M 氯化钠。
			向溶液中加入26.8mM 氯化钾。
			向溶液中加入101mM 磷酸氢二钠。
			向溶液中加入18.0mM 磷酸二氢钾。
			调节溶液至所需pH值（通常pH ≈ 7.4）。
			加入蒸馏水至总体积为1 L。
PBT	用户自选		0.1M 磷酸钠缓冲液（pH 7.2），含0.1% 牛血清白蛋白和0.2% Triton X-100
PDT	用户自选		0.1M 磷酸钠缓冲液（pH = 7.2），含0.3% 脱氧胆酸钠和0.3% Triton X-100
培养皿	Falcon	Corning 351007	培养皿；直径60mm；未处理
培养皿	Falcon	Corning 351008	培养皿；直径35mm；未处理
钳子	用户自选
PLP	n/a		含2%多聚甲醛和1.35%赖氨酸的0.05M 磷酸钠缓冲液（pH 7.2）
二抗	Jackson ImmunoResearch	715-545-151	0.5mg Alexa Fluor 488 标记的驴抗小鼠IgG
盖玻片	VWR	48393-172	VWR #1.5 盖玻片 22×40（整箱）
载玻片	Fisher	125442	Fisher 玻璃载玻片 10片/盒
脱氧胆酸钠	Thermo Fisher Sci	89904	脱氧胆酸钠去污剂；5mg
高碘酸钠	Sigma Aldrich	71859-25G	高碘酸钠 – 25克
磷酸钠缓冲液			0.1M NaPO4 缓冲液（pH 7.2）。将28ml 0.1M 无水磷酸二氢钠储备液（11.998g NaH2PO4 溶于1L蒸馏水）与72ml 0.1M 无水磷酸氢二钠储备液（14.196g Na2HPO4 溶于1L蒸馏水）混合，得到100ml 0.1M NaPO4 缓冲液。也可使用PBS替代
钨丝	Ted Pella	27-11	直径 .005”
Triton X-100	Thermo Fisher Sci	A16046AE
涡旋振荡器	用户自选