本研究探讨了艾灸对类风湿关节炎大鼠模型中巨噬细胞极化与迁移的调控作用，重点分析T细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域蛋白3（TIM-3）在此过程中的作用，以阐明艾灸治疗该疾病的潜在机制。
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本研究探讨了艾灸对类风湿关节炎大鼠模型中巨噬细胞极化与迁移的调控作用，重点分析T细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域蛋白3（TIM-3）在此过程中的作用，以阐明艾灸治疗该疾病的潜在机制。
本研究旨在探讨艾灸对类风湿关节炎大鼠模型中巨噬细胞极化与迁移的调节作用，以及T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域蛋白3（TIM-3）在该过程中的作用。实验第0天，将Sprague–Dawley（SD）大鼠分为五组。通过向后足垫注射完全弗氏佐剂（CFA）建立类风湿关节炎模型。此外，通过慢病毒介导的Havcr2 RNA干扰（LV-Havcr2-RNAi）注射至后足垫以抑制TIM-3的表达。从第7天开始，大鼠接受艾灸治疗，治疗周期为连续6天治疗加1天休息，共完成三个完整周期。艾灸治疗结束后，通过组织学分析和足爪厚度测量评估炎症状态。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）和免疫荧光法检测M1和M2型巨噬细胞的表型标志物。通过实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）和蛋白质印迹法（Western blot）检测TIM-3的表达水平。此外，从额外的SD大鼠中分离腹腔渗出巨噬细胞（PEMs），并利用Transwell小室实验检测巨噬细胞的迁移能力。研究发现，注射CFA后，大鼠出现明显的足爪红肿以及巨噬细胞表型表达失衡。Transwell迁移实验进一步显示，与对照样本相比，CFA诱导的模型大鼠巨噬细胞迁移能力增强。然而，艾灸治疗可显著缓解上述变化。结果还表明，艾灸可上调TIM-3的表达水平；而在慢病毒干预后，TIM-3表达水平显著降低，导致炎症表现加重及巨噬细胞失衡。这些结果提示，TIM-3在艾灸调节巨噬细胞极化与迁移过程中发挥关键介导作用。
类风湿关节炎（RA）是一种常见的全身性自身免疫性疾病，临床表现为对称性炎症性关节炎。炎症主要累及滑膜、软骨和骨骼，导致组织破坏，最终引发不可逆的关节畸形1。目前对RA的药物治疗主要依赖于改善病情的抗风湿药（DMARDs）2，这些药物通常需要终身服用。然而，这些治疗药物常伴随多种不良反应。因此，大量患者寻求安全有效的补充疗法，以缓解临床症状，并可能减少对常规药物治疗方案的依赖。作为中医的重要组成部分，艾灸可能成为RA的一种有前景的补充疗法。其治疗作用通过全身性的抗炎和免疫调节机制实现3。证据表明，艾灸能够缓解症状并保护关节结构4。此外，与DMARDs可能带来的肝肾毒性、感染风险及高昂费用相比，艾灸具有更高的安全性且成本较低。然而，艾灸并非万能，不能完全替代DMARDs用于RA的管理。艾灸通常需要反复、长期的治疗才能见效。在RA急性加重期，艾灸可能无法迅速控制症状。此外，艾灸的疗效高度依赖操作者的技能和经验，存在一定的变异性。因此，应考虑将艾灸与DMARDs联合应用，以实现协同增效、减毒的“增效减毒”效应，从而为RA的长期管理提供一种可行的策略5。
尽管大量研究已证实艾灸在类风湿关节炎（RA）治疗中的疗效6,7,8，但其确切的作用机制仍不明确。本研究以T细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域蛋白3（TIM-3）为机制切入点，探讨艾灸对RA中巨噬细胞极化与迁移的影响。该研究旨在阐明艾灸发挥抗关节炎作用的潜在免疫调节通路。
作为关键的免疫细胞，巨噬细胞在类风湿关节炎（RA）的发病机制和疾病进展中发挥核心作用9,10。炎症发生时，组织驻留型巨噬细胞会释放多种细胞因子和趋化因子。这些信号分子作用于血管内皮细胞，促进循环单核细胞分化为巨噬细胞，并进一步招募至炎症组织11,12。这些浸润的巨噬细胞通过产生更多的炎症介质，进一步放大炎症反应，继而招募更多巨噬细胞，加剧组织浸润，从而形成炎症与组织浸润的恶性循环。
根据不同的环境刺激，巨噬细胞可通过极化为不同的功能表型而表现出显著的可塑性，主要分为M1型（经典活化）和M2型（替代性活化）状态13。在生理条件下，巨噬细胞极化在M1和M2表型之间维持动态平衡。然而，在类风湿关节炎（RA）中，这种平衡被打破，表现为M1极化增强，并释放更多的促炎介质，如干扰素（IFN）-γ和诱导型一氧化氮合酶（iNOS），从而加剧炎症反应。与此同时，M2极化减弱，伴随抗炎因子如白细胞介素（IL）-4和CD206的释放减少，导致其抑制T细胞活化和增殖的能力受损，进而加重疾病进展14。多项研究表明，调节M1/M2巨噬细胞的平衡可能有助于缓解RA的进展15,16。
TIM-3是一种T细胞表面糖蛋白，广泛表达于多种免疫细胞，包括T细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞，通过与特定配体结合发挥免疫调节功能17。TIM-3信号通路对巨噬细胞炎症性细胞因子的表达及极化具有明确影响。值得注意的是，TIM-3在M2型巨噬细胞中高表达，可促进M2表型并抑制M1表型。相反，研究表明，抑制TIM-3会产生相反效应，驱动M1极化并减弱M2极化18,19,20。此外，有证据表明TIM-3是调控巨噬细胞迁移行为的关键因子21,22。因此，靶向TIM-3以调控巨噬细胞极化与迁移动态的治疗干预策略，在类风湿关节炎（RA）治疗中展现出显著潜力。
基于上述原理，本研究旨在增进对艾灸治疗类风湿关节炎（RA）作用机制的现有科学认识。
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伦理声明与安全注意事项
所有动物实验均已获得成都中医药大学伦理委员会（2024029）的批准。在所有注射操作过程中，包括注射CFA和慢病毒时，操作人员必须穿戴个人防护装备（PPE），包括一次性手套、护目镜和实验服。这些操作必须在生物安全柜内或通风良好的环境中进行。所有接触过试剂的锐器必须立即丢弃至指定的锐器容器中。在艾灸治疗过程中，操作人员需密切监测动物的反应，及时更换艾炷，以防止皮肤烫伤。此外，应远离燃烧的艾炷放置易燃物品，以消除火灾隐患。
1. 建立类风湿关节炎模型
将30只雄性SD大鼠（体重：200 ± 20 g），6周龄（许可证编号：SCXK 2020-030），随机分为五组（n = 6）：对照组、类风湿关节炎模型组（RA模型组）、RA + 艾灸治疗组（Mox组）、RA + TIM-3慢病毒干扰组（RA + TIM-3–组）和RA + TIM-3慢病毒干扰 + 艾灸治疗组（RA + TIM-3– + Mox组）。实验前，大鼠在温度为22–24 °C、湿度为20%、自然光照/黑暗循环的环境中适应性饲养7天，自由摄食和饮水。实验第23天，从同一家公司额外购买5只3周龄雄性SD大鼠，在相同的饲养条件下适应5天后用于PEM提取。总结实验流程的示意图及代表性操作照片见 图1。
在实验的第0天，除对照组大鼠外，其余大鼠均在后肢足垫注射0.5 mL/kg的完全弗氏佐剂（CFA）以诱导类风湿关节炎（RA）。对照组大鼠在相同部位注射等体积的生理盐水。足爪厚度被用作评估RA模型是否成功建立的指标23。
2. 慢病毒注射
RA + TIM-3- 组和 RA + TIM-3- + Mox 组的大鼠在实验第1天于后足垫注射 LV-Havcr2-RNAi（94435-1）（3.5 × 107 TU/mL；每足垫10 µL）。其余所有大鼠在相同解剖部位注射等量生理盐水24。
3. 艾灸
在实验的第7天，电针组和RA + TIM-3- + 电针组的大鼠接受电针治疗。 为便于操作，将BL23和ST36穴位周围约1 × 1 cm区域的毛发剃除（其余各组大鼠也进行了相同处理）。在电针治疗过程中，使用两条弹性带将每只大鼠轻轻固定于一块略大于其体形的木块上，以充分暴露治疗区域（其他组大鼠也采用相同方式固定）。随后，将米粒状艾炷置于两个穴位上。为确保个体间热刺激的一致性，每个艾炷（直径：2 mm；高度：5 mm；艾绒含量：60%）均采用标准化的5 mg艾绒制成。每天对身体一侧的两个穴位各施灸五壮，次日交替至对侧进行治疗。该交替治疗方案持续三周，每第七天休息一天。
经过3个周期的艾灸治疗后，使用异氟烷（4%诱导，2%维持，吸入）对大鼠进行麻醉，从腹主动脉采集5 mL动脉血。离心（2,000 × g，15分钟，4 °C）后，将上清液血清转移至微量离心管中，并在−20 °C保存。采血后，通过颈椎脱位处死大鼠。仔细解剖踝关节并用4%多聚甲醛固定。滑膜组织和脾脏使用液氮迅速冷冻，并在−80 °C保存。
4. 大鼠足垫厚度的测量
使用防水标记笔标记大鼠后足的中点，以确保测量位置的一致性。在建模前、成功建模后以及每次治疗间隔期间（实验第 0、7、14、21 和 28 天），使用游标卡尺测量足爪厚度。
5. 组织学分析
用4%多聚甲醛固定后，将大鼠踝关节置于含有足量脱钙液（10%甲酸）的离心管中。将离心管固定于摇床上，在室温下轻柔振荡30小时。在此期间，定期更换脱钙液，并监测组织状态，以防止过度脱钙。随后，将组织转移至5%硫代硫酸钠溶液中，中和6小时，再用流动自来水彻底冲洗4小时25。然后对组织进行脱水并包埋于石蜡块中。将切片横向切成5 µm厚度。脱蜡并水化后，切片用苏木精染色3分钟，用水冲洗，短暂分化（5秒），再次冲洗，并蓝化5秒，随后用流动自来水彻底冲洗。接着，切片在95%乙醇中脱水1分钟，用伊红复染15秒。最后，切片再次脱水、透明化，并加盖盖玻片，用于光学显微镜观察。经此染色后，细胞核呈蓝色，而细胞质、胶原纤维和红细胞则呈现不同深浅的粉红色；角化层通常染成鲜红色。
6. 酶联免疫吸附测定（ELISA）
根据制造商的说明书，将每份血清样品（预先稀释1:2）100 µL加入指定的孔中，同时平行设置空白孔和标准品孔。封板后，于37 °C孵育90分钟。洗涤一次后，加入检测抗体，于37 °C孵育60分钟。再次洗涤后，加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶（streptavidin–HRP）结合物。充分洗涤后，加入底物溶液显色，并通过加入终止液终止反应。在450 nm处测定吸光度（OD₄₅₀）。通过标准曲线插值确定IL-4和IFN-γ的样品浓度，并乘以相应的稀释倍数计算最终浓度。
7. qRT-PCR
采用TRIzol试剂并根据改良方案从血清样本中提取总RNA。简言之，将100 µL血清通过剧烈吹打与1 mL TRIzol试剂充分匀浆。随后加入100 µL氯仿，剧烈振荡15秒，室温孵育3分钟。将样品在4 °C条件下以12,000 × g离心15分钟，实现相分离。小心转移上层水相至新离心管，加入0.5 mL异丙醇，室温孵育10分钟。随后在4 °C条件下以12,000 × g离心10分钟，沉淀总RNA。所得RNA沉淀用1 mL 75%乙醇洗涤一次（在4 °C条件下以8,000 × g离心5分钟），空气干燥后溶于适量溶液。提取的RNA使用cDNA合成试剂盒进行逆转录。采用实时定量PCR系统软件进行基因表达分析。以β-actin作为内参基因用于标准化。TIM-3 mRNA的相对表达量通过2−ΔΔCt法计算。引物详细信息见表1。
8. 蛋白质印迹
取出的脾脏用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次，切成小块，加入裂解缓冲液进行裂解，裂解液体积为组织体积的十倍。使用匀浆管进行匀浆。将匀浆液置于冰上裂解30分钟，期间涡旋振荡5至6次，以确保组织充分破碎。样品在4 °C下以12,000 × g 离心10分钟，收集上清液作为总蛋白提取物。根据试剂盒说明书，采用双辛可宁酸（BCA）法测定目标蛋白浓度。
采用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，将提取的蛋白质样品转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用含5%脱脂奶粉的吐温-20 Tris缓冲盐溶液（TBST）在室温下封闭膜1小时，随后在4 °C与一抗孵育过夜。充分洗涤后，在37 °C与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育2小时。最后，使用化学发光成像系统采集图像，并利用ChemiScope分析软件对灰度强度进行分析。一抗和二抗的具体信息列于表1中。
9. 免疫荧光检测
提取的滑膜组织经4%多聚甲醛固定、脱水后，包埋于石蜡中，并切成5 µm厚的切片。切片依次在二甲苯I、二甲苯II和二甲苯III中脱蜡（每次10分钟），随后用无水乙醇洗涤三次（每次5分钟），最后用蒸馏水冲洗。
在乙二胺四乙酸（EDTA）中进行抗原修复后，将切片在磷酸盐缓冲液（PBS）中洗涤三次，每次5分钟，轻柔振荡。随后，切片在室温下用3%牛血清白蛋白（BSA）封闭30分钟。封闭后，加入一抗，包括抗诱导型一氧化氮合酶（iNOS）（1:500）和抗CD206（1:400），于4 °C孵育24小时。
经过三次每次5分钟的PBS洗涤后，切片在37 °C避光条件下与二抗（Cy3标记的山羊抗兔IgG，1:300）孵育50分钟。核染色步骤为：将切片用PBS洗涤三次（每次5分钟），随后加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液，在室温避光孵育10分钟。最后在荧光显微镜下观察图像。
10. PEMs 的分离
颈椎脱位处死大鼠后，将其置于75%乙醇中消毒10分钟，随后转移至无菌生物安全柜中。用无菌剪刀剪开腹部皮肤，然后使用注射器向腹腔内注射15 mL磷酸盐缓冲液（PBS）。轻轻按摩腹部后，将腹腔液体重新吸入注射器，转移至离心管中，以获得巨噬细胞悬液。
细胞悬液用PBS洗涤三次，然后接种于含10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中。细胞在37 °C、5% CO₂的湿化气氛中培养24小时。此孵育阶段后获得的贴壁细胞被鉴定为巨噬细胞。
11. Transwell
迁移实验采用24孔板进行。巨噬细胞经血清饥饿处理24小时后，将4 × 104个细胞悬浮于300 µL含1%胎牛血清（FBS）和1%抗生素（50 U/mL青霉素、50 µg/mL链霉素）的DMEM培养基中，加入上室；下室中加入700 µL含10% FBS和1%抗生素的DMEM培养基。细胞在加入前用不同大鼠组别的血清预处理24小时。随后，将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育24小时。经结晶紫染色后，用棉签擦去上室中未迁移的细胞。在光学显微镜下随机选取四个视野，通过人工计数定量迁移的细胞数量。
12. 统计分析
采用 SPSS 25.0 版本进行统计分析。首先对数据集进行正态性与方差齐性检验。当满足参数检验的前提假设时，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行最小显著性差异（LSD）事后检验。对于不满足上述假设的数据，则采用非参数的 Kruskal–Wallis 检验，随后进行 Mann–Whitney U 检验，并对多重比较进行适当校正。所有数值均以均值 ± 标准差表示，P < 0.05 被认为具有统计学意义。
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数据可用性
本研究产生的原始数据可在 Figshare 仓储中获取（https://doi.org/10.6084/m9.figshare.31550197）
艾灸治疗后大鼠关节病理变化及足爪厚度
注射CFA后的大鼠出现明显的足爪肿胀和红肿。苏木精-伊红染色显示，对照组关节结构完整，滑膜组织光滑且排列有序，无明显炎性细胞浸润。相比之下，类风湿关节炎（RA）组表现出明显的滑膜充血、水肿、大量炎性细胞浸润以及血管扩张。在艾灸组中，滑膜充血和水肿减轻，炎性细胞浸润和血管扩张程度也有所下降（图2A）。
与这些组织学发现一致，足爪厚度测量结果显示，与对照组相比，RA组的足爪肿胀显著增加。在Mox组中，多个时间点的足爪厚度较RA组有所降低（图2B
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目前类风湿关节炎（RA）的治疗主要依赖于改善病情抗风湿药（DMARDs）。然而，这些药物通常价格昂贵，且可能带来不可忽视的不良反应，包括肝肾功能损害和严重感染2，给患者个人及医疗系统带来显著负担。相比之下，作为外治法的艾灸具有良好的安全性，系统性毒性的报道风险极低。其操作技术相对简便，患者经适当培训后有望实现自我施治。这一特点有助于提高患者的参与度和自我管理效能，而这两者对慢性病管理至关重要。此外，由于艾灸成本低廉且对基础设施要求极少，特别适用于资源有限的地区，或长期使用生物制剂而面临经济困难的患者。而且，多项研究已表明艾灸在缓解RA症状方面具有疗效，使其成为一种颇具前景的补充疗法。
艾灸治疗类风湿关节炎（RA）的确切机制尚未完全阐明。既往研究已探讨了多种作用途径，包括通过调节TGF-β1缓解RA相关的心功能障碍26，以及通过调控Wnt/β-catenin信号通路实现关节保护27。艾灸还可通过抑制PI3K/Akt/mTOR级联激活，减轻RA...
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作者无任何利益冲突需要披露。
本工作得到国家自然科学基金（项目编号：82374587）和四川省自然科学基金（项目编号：2024NSFSC2113）的资助。感谢成都中医药大学提供实验设施和技术支持。特别感谢针灸推拿学院在艾灸实验方案方面给予的指导。同时感谢动物饲养团队在大鼠模型维护过程中提供的协助。最后，向所有参与组织学和分子分析工作的同事表示诚挚的谢意。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 完全弗氏佐剂’完全弗氏佐剂（CFA） | Sigma-Aldrich | F5881 | 用于诱导大鼠类风湿关节炎（RA）模型 |
| 慢病毒（TIM-3 RNAi） | 上海，GenChem生物技术公司 | 3.5×107 TU/mL | 用于沉默 TIM-3 基因表达 |
| 麦粒大小艾炷 | 传统中医药供应商 | N/A | 用于在 BL23 和 ST36 穴位进行艾灸 |
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