从感染登革热病毒2型的哺乳动物细胞中分离并表征富集外泌体的胞外囊泡

摘要

本文描述了从登革热2型感染细胞培养上清液中分离出富集外泌体的胞外囊泡的方法，随后对囊泡完整性和大小分布进行表征，并在特定实验条件下通过斑块分析评估是否检测到可检测的感染病毒。

摘要

富含外泌体的EV是从各种细胞类型释放到细胞外液体中的囊泡，如血浆、尿液、唾液、细胞培养基及其他体液。其直径范围为30纳米至150纳米。它们被认为与不同的细胞过程有关，包括细胞通讯和感染期间的免疫调节。基于这些效应，它们已被用于研究多种病毒的发病机制。利用现有纯化技术，从病毒感染的细胞上清液中分离出富含外泌体的电子辐射具有挑战性。这主要是因为某些病毒与富集外泌体EVs的体积重叠。我们旨在纯化登革热2型感染细胞培养上清液中的外泌体富集EVs。外泌体富集EV是通过商业外泌体分离套件分离出来的。对于该方案中分离的外泌体富集EVs，在测试条件下通过斑块检测未检测到传染性病毒。纯化的外泌体富集EV通过四司他素的西方墨迹、纳米粒子跟踪分析和透射电子显微镜确认尺寸进行了表征。我们证明了外泌体富集EV保持完整，且位于正常的外泌体直径范围30-150纳米范围内。总体而言，我们的方案提供了一种廉价的方法，用于从病毒感染的细胞培养上清液中纯化外泌体富集的电子化体，可用于下游功能性测定。

引言

富含外泌体的EV是身体每个细胞释放的纳米级囊泡。它们是源自内吞的细胞外囊泡（EV）亚型。外泌体富集的EV最早是在网状细胞^培养基中发现的。在过去几十年里，富含外泌体的EV已从多种体液中纯化出来，包括血液、尿液、唾液、母乳、精液和羊水2^、3、4、5。它们的直径范围为30纳米到150纳米^6。它们通过多囊体（MVBs）与细胞质膜融合释放到细胞外腔室。在感染和免疫反应的背景下，外泌体富集的EV已知会在哺乳动物细胞中引发特定反应。这些反应包括细胞因子的释放或感染易感性的变化 ^7,8,9。

外泌体富集EVs的含量受多种因素影响，最重要的是产生它们的细胞类型和状态^10,11。此外，其内容还决定了对天真受体细胞的影响。目前有多种方法用于从生物流体中分离富集外泌体的EVs。常用方法包括差动超离心、沉淀、免疫亲和力捕获、尺寸排除色谱、基于磁性分离和基于微流控的分离。

差动超速离心被认为是最^{常用的技术之一。}超速离心机纯化方法成本高昂，且需要相当高的技术熟练度。该方法还会导致多次超离心步骤导致EV的显著损失。最后，由于表型特性相似，产生的富集外泌体EVs并非完全没有活性病毒颗粒。这使得从病毒感染的细胞上清液中纯化外泌体富集EV变得具有挑战性。因此，开发优化方案以有效将登革热病毒（DENV）水平降至外泌体富集EV溶液中不可检测水平非常重要，因为病毒与外泌体的大小和密度^相似。

与其他常用技术相比，该方案具有多项优势，包括缩短纯化时间、依赖廉价且广泛可得的实验室设备，以及能够在无活病毒污染的情况下分离出富含外泌体的EVs。此外，尽管密度梯度离心和基于磁性隔离的方法具有提升产率和更高纯度等优势，但这些方法都需要先进行超离心步骤。本文旨在提出一种方法，在测试条件下通过斑块分析从感染上清液中分离出无可检测感染病毒的外泌体富集EVs。

方案

1. 制备无外泌体培养基

1. 在II类生物安全柜（BSC）内的接收器底座上安装一个0.1微米滤波器。
2. 无菌地将加热灭活的胎牛血清（FBS）倒在滤器上，并将其连接到BSC内的真空泵。
3. 再重复步骤1.2，配合流畅再做两次。
4. 准备完整培养基，包含10%的三重过滤FBS、1%青霉素/链霉素和1%的L-谷氨酰胺。
   注意：采用三重过滤方法以避免使用超速离心机等仪器。

2. 登革热感染哺乳动物细胞

1. 在组织培养箱内，37°C、_CO2浓度5%的T75 cm²培养瓶中，隔夜培养Vero细胞。
2. 次日，检查细胞汇聚度在70%至80%之间，并用0.1感染倍数（MOI）的DENV-2感染，5毫升全培养基感染细胞，并在37°C与5%二氧化碳共孵育2小时。
3. 2小时后，取出上清液，并用无菌磷缓冲生理盐水（PBS）清洗瓶子3次。
4. 将50毫升完整培养基加入瓶中，并在37°C、5%二氧化碳下培养4天（就在观察到细胞病理效应之前）。

3. 基于kit的外泌体纯化

1. 将细胞培养基从瓶子转移到50毫升锥形管子中，并在室温下以200× 克 离心15分钟。
2. 将介质转移到新的锥形管上。加入125微升EV沉淀试剂，随后加入600微升树脂。涡旋10秒，然后让它在室温下静置10分钟。
3. 再进行10秒的涡旋，并在室温下以约450× 克 离心2分钟。转移到BSC，丢弃上清液，并向沉淀液施加600微升的悬浮缓冲液。
4. 漩涡孵化10秒，并在室温下孵育15分钟。
5. 再进行10秒的涡旋，室温下以约25× 克 离心2分钟。
6. 将上清液转移到滤离塔，并在室温下以约4,500× 克 离心1分钟。收集含有完整外泌体富集EV的流通，并在-80°C下储存，直到准备使用。
7. 通过进行斑块检测¹⁷确认外泌体富集EV无活病毒。
8. 利用电子显微镜对外泌体富集EV进行尺寸表征，并用纳米颗粒追踪分析尺寸分布和浓度¹⁸。

4. 通过western blot对外泌体富集EV的表征

1. 利用BCA等检测法测定外泌体富集EV的蛋白质浓度。
2. 混合等量的外泌体富集EV溶液和RIPA缓冲液，加入4倍LDS加载缓冲液（4：1）。
3. 使用4-12%的Bis-Tris凝胶分离富集的EV蛋白。
4. 将蛋白质转移到硝化纤维素膜上。
5. 用5%脱脂牛奶溶解在1个TBS-Tween缓冲液中，室温下块块1小时。
6. 用5%脱脂干牛奶稀释原一抗至1：1,1000，并在4°C下探测膜上的外泌体蛋白，如CD63和CD9，过夜。
7. 去除原抗体，用1个TBS-Tween缓冲液在摇杆上清洗5分钟。
8. 将二级抗体（抗兔子IgG HRP）与脱脂干牛奶稀释至1：5,000稀释，并在室温下与该溶液一起培养膜1小时。
9. 去除二级抗体，用1个TBS-Tween缓冲液在摇杆上清洗5分钟。
10. 使用ECL检测试剂显影膜，并使用化学发光成像设备检测蛋白质信号。

5. 通过透射电子显微镜对外泌体富集EV的表征

1. 将5微升外泌体样品加入200网格铜网格中，涂有福尔瓦尔和碳涂层，并在室温下自然风干。
2. 用1%水性醋酸铀酰染色网格60秒后自然风干。
3. 使用TEM在80 kV¹⁸下捕捉图像。

结果

我们按照协议描述，使用斑块检测分析分离出的富集外泌体EV，以确定是否能检测到混合物中的活性DENV-2颗粒。如 图1所示，在测试条件下与阳性对照组相比未检测到斑块。这些结果表明，该传染性病毒的检测阈值低于斑块检测的阈值。斑块检测采用生物三重标和技术复制品进行。通过BCA检测法测定了分离出的外泌体富集EV的蛋白质浓度。结果显示蛋白质浓度为989 μg/mL至1,300 μg/mL（见表1）。此外，对外泌体富集EV的西印迹分析显示存在CD63和CD9四单纯素，这两种是常见的外泌体标志物（见图2）。此外，还使用纳米粒子跟踪分析（NTA）来确定外泌体富集EV的大小和浓度。分析显示，外泌体富集EV的直径在80-110纳米范围内（见图3）。透射电子显微镜对纯化的外泌体富集EV进行最终分类显示，大部分外泌体富...

讨论

感染病研究的最新进展表明，病毒感染的初生细胞释放的富集外泌体EV在调节宿主^{免疫反应中}发挥关键作用^7,8,9。富含外泌体的EV要么通过促进适当的抗病毒反应来增强免疫防御，要么反过来通过抑制宿主防御机制促进病毒免疫逃避。

为了阐明这些相反效应，必须分离出完整且富含外泌体、不含污染病毒颗粒的EVs。目前用于外泌体富集体EV纯化的多种方法：12,13,14;然而，这些方法存在显著局限性，包括高设备成本、较长的处理时间、技术复杂性、材料损失大，以及难以将病毒与外泌体富集EVs^分离。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗兔IgG-HRP联结抗体	细胞信号传导	7074S	二级抗体
CD63	细胞信号传导	52090S	一级抗体
CD9	细胞信号传导	13174S	一级抗体
细胞培养基外泌体纯化套件	诺根	60600	外泌体净化套件
登革热病毒2型	空军交通管制委员会	VR-1584	病毒
DMEM	费舍尔科学	11-995-073	文化媒体
EMEM	空军交通管制委员会	30-2003	文化媒体
FEI Talos F200X 透射电子显微镜	Thermofisher 科学
胎牛鲈	神经力学	FBS002	媒体补充
纳米粒子追踪分析仪	粒子度量
Vero细胞	空军交通管制委员会	CCL-81	哺乳动物细胞系