单细胞解离、RNA测序及分离老年泪腺和唾液腺的肌上皮细胞和成纤维细胞的方案

摘要

该方案描述了一种优化方法，用于解离老鼠泪腺，以获得可用于单细胞RNA测序的活性单细胞。顺序酶促消化和温和处理保持细胞完整性，产出适合细胞类型特异性分离和泪腺群衰老相关变化的转录组分析的高质量悬浮液。

摘要

泪腺（LG）衰老与泪液分泌减少和慢性炎症相关，进而导致干眼病。与年龄相关的LG变化包括免疫细胞浸润、细胞损伤、腺窝细胞脂质积累、细胞外基质沉积和导管扩张。单细胞RNA测序（scRNA-seq）为细胞异质性和衰老过程中转录变化提供了有力的方法;但由于纤维化增加、细胞脆弱和脂质积累，从老年LG组织中生成可行的单细胞悬浮物在技术上具有挑战性。本研究提出了一种优化且可重复的方案，用于高效解离老鼠LGs，并分离多种细胞类型，适用于下游scRNA-seq分析。重要的是，该方案同样适用于年轻的泪腺、结膜及其他外分泌组织。该流程采用分阶段酶解离策略，使用胶原酶IV、分散II和DNase I进行初步组织消化，随后用Accutase解离剩余细胞簇，最后通过DNase I处理以获得干净的单细胞悬浮液。为减少细胞损伤，所有塑料制品均预涂含有含牛血清白蛋白的PBS，组织处理在受控温度和搅拌条件下进行。红细胞溶解及多次滤网过滤进一步提升细胞纯度。通过报告小鼠系结合荧光激活细胞分选（FACS）实现细胞类型特异性分离。利用 Acta2^GFP 和 Pdgfra^EGFP小鼠，我们分别成功分离出EpCAM抗体免疫染色后的肌上皮细胞和成纤维细胞。FACS使EpCAM⁺/αSMA⁺的肌上皮群体得以分离，而Pdgfra^EGFP小鼠的EGFP⁺细胞代表成纤维母细胞群体。该方案能从老LGs中获得高质量、可存活的单细胞悬浮液，并可轻松适应其他需要温和解离和靶向细胞分离的纤维化或衰老外分泌组织。

引言

泪腺（LG）是一种外分泌的微管腺，负责分泌泪膜的水层。在一生中，角膜表面和泪腺都会暴露于细菌和病毒感染，可能导致上皮细胞的系统性破坏、慢性炎症反应的诱导、免疫细胞浸润到LG以及再生能力不足。衰老伴随着慢性炎症性疾病的发生率^增加1。其中，干眼病（DED）是全球十大视力障碍原因之一，也是老年人群独立性、行动能力和日常功能下降的主要^原因2。DED的主要原因是LG功能障碍³。

随着年龄增长，小鼠和人类LG会发生明显的结构和功能变化，包括腺皮萎缩、导管扩张、免疫细胞浸润、纤维化以及脂质沉积^4,5,6,7。这些退行性变化还伴随着LG的慢性炎症和组织纤维化3,5,8,9。尽管衰老与LG病理有明确关联，但驱动这些变化的分子和细胞机制仍不充分。

单细胞RNA测序技术使细胞群体及其转录变化在¹⁰岁老龄期能够全面剖析。该方法能够无偏地识别泪腺内不同细胞类型和状态，揭示衰老如何改变基因表达谱、免疫细胞浸润以及上皮-间充质相互作用。

目前，已有多种组织解离方法，包括机械解离法¹¹ 和涉及37°C温酶消化的方案，如胶原酶、分散酶或胰蛋白酶¹²。多种解离策略已被描述，涵盖肝脏、肺、肾脏、心脏及多种肿瘤类型^13、14、15。然而，由于纤维化增加和细胞脆弱性，从老年泪腺组织制备可行的单细胞悬浮物仍具技术挑战。此外，正如我们之前报道的，脆弱的腺腺细胞恢复具有挑战性，因为解离相关膜通透性变化可能增加这些大型分泌细胞的环境RNA释放，从而影响下游单细胞数据集的背景信号¹⁶。尽管多项研究报告了衰老泪腺的scRNA-seq图谱，但这些数据集的质量受限于不优的解离方法，导致上皮细胞产率低于基质群体。本文，我们提出了一个详细且优化的方案，用于高效解离老鼠LG及分离不同细胞群体，进行下游scRNA-seq和整体RNA-seq分析（见图1）。该方法为研究年龄相关泪腺功能障碍的分子机制提供了有力工具。

该方案能够从老化的泪腺生成高质量、可存活的单细胞悬浮液，为全面的转录组分析提供可靠基础。它能够详细识别和分子特征分析多种细胞群体，包括肌上皮细胞、成纤维细胞及其他经历年龄相关变化的上皮和间质细胞类型。优化的工作流程保持细胞完整性，减少应激诱导的转录伪影，确保对体内细胞状态的准确表现。此外，该方法广泛适用，可适应其他外分泌腺体或纤维化组织，在这些领域，温和的组织解离和精确分离不同细胞群对后续单细胞研究至关重要。

方案

所有动物实验均按照斯克里普斯研究所机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的协议进行（协议号08-0123;2023年8月29日批准）。斯克里普斯研究所的动物护理获得国际实验动物护理评估与认证协会（AAALAC）的认证。小鼠在标准的12小时光照/12小时暗夜周期内进行，并可 随时提供食物和水。实验中使用 了Pdgfra^EGFP 和 Acta2^GFP 转基因小鼠系。关于小鼠系的详细信息见“材料表”部分。

1. 一般性考虑

1. 处理生物危害物质和动物组织时，请遵循NIH通用预防措施第¹⁷ 条。所有动物工作均应按照IACUC批准的协议和指定的动物生物安全级别进行。
2. 遵循标准实验室安全规范，避免用口移液，减少锐器使用，使用生物安全柜进行气溶胶生成程序，穿着适当的个人防护装备，将锐器丢弃在防刺容器中，并在处置前正确标记和消毒所有生物危害废物。
3. 定期使用适当的消毒剂（例如10%漂白剂）对工作表面和设备进行净化。
4. 在预冷冷离心机中，所有离心步骤均需在4°C下进行，以保持细胞存活性并最小化温度引起的应力。
5. 针对特定仪器配置优化流式细胞仪和细胞分选仪设置，并使用适当的对照样本调整每个抗体-荧光团偶联物的参数。在整个实验系列中使用同一细胞计和分选仪器，并保持固定且优化的设置，以最大限度减少变异性。
6. 选定溶液应提前一天准备，并在使用前妥善储存。所有溶液应在无菌条件下储存在生物安全柜中。
7. 将含Ca²⁺/Mg²⁺的溶液与含EDTA缓冲液分开，以防止酶促步骤中的螯合。所有该程序所需的试剂均见 材料表。

2. 塑料制品

1. 在无菌条件下，应在室温（RT）下预先涂抹1xPBS + 1% BSA的盘子、管子和注射器1小时。吸入并保持所有材料无菌直到使用。
2. 对移液器吸头进行预涂。每个吸头吸出并分注1支PBS + 1% BSA三次，涂覆内表面。将涂有涂层的吸头放回无菌吸头盒，并在无菌培养箱中晾干一夜。第二天在细胞分离过程中使用这些预涂喷头。

3. 解与缓冲

1. DNase I 现装（5 mg/mL）
   1. 从5M NaCl库存中制备150 mM NaCl，并对溶液进行无菌过滤。
   2. 向过滤后的150 mM NaCl溶液中加入1 M CaCl₂，得到最终5 mM CaCl₂浓度。
   3. 将100 mg DNase I重新悬浮于20毫升150 mM NaCl / 5 mM CaCl₂缓冲液中，得到5 mg/mL的DNase I库存溶液。
   4. 准备500微升分量，储存于−20°C，最长可达6个月。避免反复冻融循环，以防止酶活性丧失。
2. 消化介质
   1. 实验前一天，将DMEM/F12与0.5% BSA混合，准备介质基底混合物并过滤。
   2. 向基质DMEM/F12 / 0.5% BSA中加入1M HEPES和1M CaCl₂，分别得到15 mM和3 mM的最终浓度。
   3. 使用前添加以下所有酶：胶原酶IV（1 mg/mL;125 U/mL）、分散酶II（2.5 mg/mL;1.25 U/mL）和DNase I（20 U/mL;0.05 mg/mL，来自5 mg/mL高汤）。
3. 阻挡介质1（BM1）
   1. 将1M HEPES和0.5M EDTA加入1xHBSS中，分别得到15 mM和3 mM的最终浓度。
4. 阻挡介质2（BM2）
   1. 向DMEM/F12添加FBS和1M HEPES，分别获得10%和15 mM的最终浓度。
5. DNase处理培养基
   1. 实验前一天，将1xHBSS混合0.5% BSA并过滤，准备基础培养基。
   2. 在基础培养基中加入1M HEPES、1M CaCl₂和1M MgCl₂，分别得到10 mM、1.5 mM和2 mM的最终浓度。
   3. 使用前，将DNase I（200 U/mL;5 mg/mL高汤中的0.5 mg/mL）加入预制混合物中。
6. 阻挡中介3（BM3）
   1. 使用相同的过滤碱基1倍HBSS / 0.5% BSA，加入1M HEPES和0.5M EDTA，分别获得10 mM和1 mM的最终浓度。
7. 阻挡中介质4（BM4）
   1. 使用相同的过滤基质1x HBSS / 0.5% BSA，并加入1M HEPES，最终浓度为10 mM。
8. FACS缓冲区
   1. 实验前一天，将1xDPBS与0.5% BSA混合，准备基础培养基并过滤。
   2. 将1M HEPES和0.5M EDTA加入1倍DPBS / 0.5% BSA，分别获得最终25 mM和1 mM浓度。
9. scRNA测序（MSC）培养基
   1. 实验前一天，将1xDPBS与0.4% BSA混合后过滤培养液。

4. 组织采集与显微解剖（~ 40 - 50 分钟）

1. 使用异氟醚麻醉小鼠，并按照IACUC机构指南通过宫颈脱位安乐死。
2. 用细镊子和剪刀切开眼和耳朵之间的皮肤，然后轻轻拉开，露出泪腺。
3. 要隔离腺体，使用钝尖产钳轻轻抬起，并以圆周运动轻轻分离周围结缔组织。泪腺的边界清晰可见，便于与邻近组织（包括腮腺）分离。
4. 将泪腺（每个腺体约重10-25毫克，取决于小鼠体重、性别和年龄）转移到一个35毫米的培养皿中，内含2毫升冷的1xPBS冰镇。在解剖显微镜下，用两根镊子小心剥离结缔组织囊膜。
5. 通过荧光显微镜检查小组织片段并验证预期的报告子或荧光信号，确认细胞标记，然后再进行酶促消化。
6. 将一个无菌的35毫米培养皿放入冰块上，并在培养皿中央加入800-1000微升冷的1x巴氏菌素（根据腺体大小调整体积）。将一个泪腺转移到1倍PBS中。
7. 使用两把无菌手术刀，将腺体细碎成小块，直到达到柔软的糊状质地。确保组织碎片在整个切碎过程中浸泡在PBS中，但不要让它们自由漂浮在盘子上。
8. 在洗碗盘一侧采集组织碎片，抽取残留PBS，并用1毫升新鲜冷PBS清洗碎片。
9. 将洗涤后的组织碎片转移到一个6孔板，每孔含有2毫升预热消化介质。在所有样本处理完毕前，将板块冰藏保存。

5. 第一次酶消化（~1.5 - 2小时）

1. 将平板浸泡在37°C、60转/分钟的摇晃水浴中孵育30分钟。
2. 用宽口径1毫升的尖端轻轻搓洗组织15次，然后将平板放回37°C、60转/分钟的摇水浴中，再浸泡30分钟。
3. 用普通1毫升的试针轻轻研磨样品10次，然后将平板放回37°C、60转/分钟的摇晃水浴中，再加热30分钟。
4. 轻柔地研磨样品10次，并将细胞悬浮液转移到2毫升Dolphin微离心管中。
5. 在平板的每个凹槽中加入1毫升冷的BM1，收集含有残留细胞的剩余消化培养基。将平板冰放在冰上，直到下一步。
   注意：如果此阶段仍观察到大细胞簇或组织碎片，每个孵育步骤应额外延长10-20分钟。避免超过指示的研磨次数（最多10-15次轻度过滤），因为额外的机械应力将影响细胞存活能力。

6. 酶活性终止和初级洗涤（~ 15分钟）

1. 将含有细胞悬浮液的管子在300× 克 下离心，4°C离心5分钟。
2. 丢弃上清液。将初始板每个孔（含残留细胞）的BM1转移到相应的管子中，并轻柔地重新悬浮细胞沉淀。
3. 用额外600微升冷BM1冲洗每个孔，并与相应的管子混合洗涤液，收集所有剩余细胞。
4. 轻轻重新悬浮细胞悬浮液，再次以300× 克 离心，4°C离心5分钟，然后丢弃上清液。

7. Accutase和DNase处理（~ 30 - 35分钟）

1. 向细胞沉淀中加入1毫升Accutase，轻柔地重新悬浮。在37°C、60转/分钟下孵育管仅5-10分钟。
   注意：培养过程中将管子侧放，以防止细胞沉积并粘附在底部。
2. 用1毫升移液器尖端轻轻研磨10次。
3. 加入1毫升冷的BM2，通过稀释Accutase终止酶反应。
4. 在300 × g 离心，4°C离心5分钟，然后丢弃上清液。
5. 将细胞重新悬浮在培养基中进行DNase处理，将管子填满至顶部。
6. 在RT下孵育10分钟，5分钟后轻柔地重新休养一次。
7. 同时，将一个70微米的细胞滤器与1毫升的BM3置于15毫升锥形管上，预润湿。
8. 把细胞悬浮液转移到滤网上。
9. 用1毫升BM3冲洗原始收集管，然后将冲洗液转移到同一个滤网上。
10. 用额外5毫升BM3清洗滤网。

8. 细胞计数与存活性检验

1. 取10微升过滤过的细胞悬浮液在BM3中，与10微升的锥蓝混合。利用锥蓝排除法确定细胞浓度和活性，并通过手动计数或自动细胞计数器（如Countess 3自动细胞计数器）进行定量。只有当活性达到下游应用所需的阈值（通常为≥70-80%）时，才可继续进行。
   注意：计算产率时考虑15毫升管内的总体积~7-9毫升。
2. 根据下游应用进行。关于scRNA测序，请继续至第9节。对于基于流式细胞术的细胞分选，请继续至第10节。
   注意：scRNA测序流程包括红细胞裂解和磁性死细胞去除，以减少碎屑和环境RNA并提升数据质量。然而，这些步骤可能偏向细胞类型表征，优先影响脆弱或稀有的上皮群体，包括腺皮细胞。对于基于流式细胞术的分选，省略了这些步骤以最大化恢复率并保留细胞表面表位。因此，工作流程选择应以实验目标为指导，优先考虑scRNA-seq或细胞恢复的数据质量，以及分选和后续应用的可行性。

9. 细胞制备用于scRNA测序（~ 1 - 1.5小时）

1. 通过用毫厘水重构10x红细胞溶液，制备1x红细胞溶液。
2. 将装有细胞悬浮液的15毫升管子以400× 克 离心5分钟，4°C，然后丢弃上清液。
3. 将细胞沉淀重新悬浮于5毫升1x红细胞缓冲液中，并在RT下培养5分钟。
4. 再次以300× 克 离心，4°C离心5分钟，然后丢弃上清液。
5. 将细胞沉淀重新悬浮在2毫升冷的BM4中。
6. 取10微升过滤后的细胞悬浮液在BM4中，与10微升的Trypan Blue混合，以评估细胞浓度和存活能力。
7. 先用1毫升1倍硬核超速过滤器预润MACS 30微米滤网，并将细胞悬浮液过滤至滤网中的15毫升管中。
8. 用2毫升冷的BM4冲洗之前的采集管，然后用同一个滤网过滤洗涤液进入15毫升管。
9. 用额外10毫升冷BM4清洗滤网。
10. 将15毫升管在400× 克 下离心5分钟，温度为4°C，完全去除上清液。
11. 轻柔地将沉淀重新悬浮于100微升MACS微珠中，并在RT下培养15分钟。
12. 同时，用无菌双蒸馏水从死细胞去除套装中准备1个结合缓冲液（BB）。
13. 用500微升1倍BB洗涤MACS质谱柱至平衡。
14. 向样品中加入400微升BB，用微珠重新悬浮细胞，并将整个体积涂在平衡的MS柱上。将流动液收集到15毫升的管子中。
15. 用500微升BB清洗四次，收集所有流过分数。
16. 以400× 克 离心分离收集的流动液，在4°C下5分钟，然后丢弃上清液。
17. 将细胞重新悬浮在400微升MSC缓冲液中，并将悬浮液转移到1.5毫升的管子中。
18. 用700微升MSC缓冲液冲洗前一管，并与样品混合冲洗液。
19. 在400× 克 下离心5分钟，4°C，然后丢弃上清液。
20. 使用宽口径的顶端将细胞沉淀重新悬浮在MSC缓冲液中，最终体积约为1.5 mL。
21. 再次以400× 克 离心，4°C离心5分钟，然后丢弃上清液。
22. 留下~100微升上清液，轻柔地重新悬浮沉淀，然后通过将6微升细胞与6微升的锥蓝混合，再次计数细胞。
23. 用MSC缓冲液调整最终体积，达到700-1200细胞/μL，并重新计数细胞以确认细胞浓度。
24. 在加载10倍铬加工（铬单细胞3'溶液V3）前，确保红细胞裂解和死细胞去除后细胞存活率≥70%（通常为70-95%）。
25. 应用基本的scRNA-测序质量控制标准：nUMI>为500，n基因>200，线粒体基因分数为<15%）。采用允许的线粒体阈值（15%）以保留代谢活性较高的上皮群体。下游分析仅包含符合所有质量控制标准的细胞。
    注意：这些QC阈值代表来自我们数据集（补充图1）的示例值，并已在我们之前的出版物¹⁸中报告。

10. 细胞准备用于流式细胞分选（~ 1 - 1.5小时）

1. 在基于流式细胞术的MECs和成纤维细胞分离中，分别使用 了Pdgfra^EGFP 和 Acta2^GFP 报告小鼠系，以实现对每个群体的精确鉴定。
2. 将15毫升管子与细胞悬浮液在400× 克 下离心5分钟，4°C，然后丢弃上清液。
3. 将细胞沉淀重新悬浮于冷的FACS缓冲液中，最终浓度为每100微升5 x 10⁵至2 x 10^6个细胞 。
4. 准备FACS补偿所需的对照：负对照——野生型小鼠的未染色细胞，背景荧光对照—— Acta2^GFP 和 Pdgfra^EGFP 小鼠的未染色细胞，单染色对照——野生型小鼠细胞，分别用实验中使用的每种抗体染色。
   注意：每个对照样品至少使用1×10⁵细胞，并重新浮入100微升FACS缓冲液中。
5. 加入FcBlock（1：100），冰上孵育5分钟。
6. 添加CD326（EpCAM）-APC单克隆抗体（1：100）或CD140a（PDGFRα）单克隆抗体（1：100）。在冰上培养45分钟，避免光照保护。
7. 抗体培养期间，每15分钟轻柔地将细胞重新悬浮一次。
8. 将每根管子装满冷的FACS缓冲液，并在4摄氏度下以300× 克 离心机加热5分钟。
9. 在FACS缓冲区中准备FxCycle工作溶液（1：1000）。
10. 将样品重新悬浮于1毫升，并用FxCycle在500微升冷FACS缓冲液中进行对照。
11. 将所有样本转移到FACS管中，并冰藏保存，避免光照。
12. 立即前往流式细胞术核心进行分选。根据后续应用，将分选后的细胞收集到FACS缓冲液、培养基、裂解缓冲液或RNA缓冲液中。
    注意：仪器设置（如喷嘴大小和压力）及事件速率取决于分选机配置和目标单元群;因此，建议先进行初步试验，以确定每个实验的最佳参数。

结果

由于脂质积累和大量ECM沉积，解离老化外分泌腺具有挑战性。老化腺体表现出明显的淋巴细胞浸润和明显的导管扩张，反映出结构和炎症变化，这些变化使组织解离变得复杂。泪腺是一个外分泌器官，由三种主要上皮细胞类型组成：腺皮细胞、导管细胞和肌上皮细胞。腺体细胞产生泪膜中的水性和蛋白质成分，维持角膜水分，并提供抗菌和伤口愈合功能。在老年LGs中，慢性炎症与上皮损伤、免疫细胞浸润、腺皮细胞内脂质积累、细胞外基质沉积增加和导管扩张相关，这些都会损害泪液分泌并进一步增加组织异质性（见图2）。尽管如此，我们的方案有效解离了LG，并识别出年轻（2个月）和老年（20个月）腺体中的所有主要细胞簇。UMAP分析显示了代表性较强的上皮和基质群体，包括MECs和成纤维细胞（见图3A-C），以及多样化的免疫细胞（见图3A，B）。...

讨论

本研究中，我们优化并评估了一种显著改进的单细胞悬浮液生成方案，重点关注泪腺。利用该方法，我们从老旧和年轻LGs中生成了干净、高质量的单细胞悬浮液，适用于单细胞测序及其他后续应用。

尽管已有多种组织解离方案，我们仍需修改和优化它们，以高效恢复分离过程中最脆弱的细胞群体。由于特定细胞群体的脆弱性，加上难以分离的上皮和间充质群体同时存在，我们排除了最初仅基于非酶促机械解离的方案^21,22。冷酶解离依赖于从低温（0-10°C）下具有高催化活性的精神嗜色生物衍生的蛋白酶，允许在低温条件下进行组织解离，从而最大限度地减少应激诱导的转录激活伪物（^16,23）。然而，这种方法需要显著更长的分离过程，增加了后续步骤，如及时制备细胞以进行scRNA测序或FACS分析。由于操作限制，这些步骤不能长时间推...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>材料<强>
BSA	西格玛-奥尔德里奇	A4919
CaCl2（1 M 解）	生物视界	B1010-100
胶原酶IV	西格玛-奥尔德里奇	C5138
死细胞清除套件	Miltenyi 生物技术	130-090-101
死细胞清除套件	Miltenyi 生物技术	130-090-101
消散二号	罗什	C756V28
DNase I	西格玛-奥尔德里奇	DN25-100MG
DPBS	Gibco，赛莫·费舍尔科学	14190-144
胎儿牛血清，超低IgG。	吉布科	# 16250078
汉克的平衡盐溶液（HBSS）	康宁（Thermo Fisher Scientific）	21-022-CV
HEPES（1 M 解）	西格玛-奥尔德里奇	H0887
异氟醚溶液	科弗图斯	# 11695067772
MACS及reg;SmartStrainers（30 & micro;m)	Miltenyi 生物技术	130-098-458
MACS及reg;SmartStrainers（70 和微型;m)	Miltenyi 生物技术	130-110-916
中型/F12（DMEM/F12）	米利波尔	东风-042-B
MgCl2 1M	西格玛-奥尔德里奇	M1028-100ML
MS列	Miltenyi 生物技术	130-042-201
NaCl（5M库存）	Invitrogen与贸易;	AM9759
磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）片剂	西格玛-奥尔德里奇	P8920-500ML
红细胞溶解液（10次以上）	Miltenyi 生物技术	130-094-183
StemPro Accutase	Gibco，赛莫·费舍尔科学	A1110501
锥蓝溶液，0.4%	Gibco，赛莫·费舍尔科学	15250061
超纯EDTA（0.5M，pH 8.0）	Invitrogen	15575020
<强>抗体<强/强力抗体>
CD140a（PDGFRA）单克隆抗体（APA5），APC-eFluor及trade;780，大鼠/IgG2a，河童	电子生物科学	47-1401-82;RRID：AB_2784706
FcBlock（CD16/CD32 FC阻断器）	BD生物科学	553141;RRID：AB_394656
FxCycle™紫罗兰污渍	赛莫飞世尔科学	F10347
大鼠CD326（EpCAM）-APC单克隆抗体（G8.8），大鼠IgG2a，κ	电子生物科学	17-579182;RRID：AB_2716944
<强壮>老鼠<强壮>
Acta2GFP <......嗯>	伊沃·卡拉日奇博士的慷慨赠礼	PMID：18571490
PdgfraEGFP - B6.129S4-Pdgfratm11（EGFP）Sor/J	杰克逊实验室	RRID：IMSR_JAX：007669
<强壮>装备
Invitrogen与贸易; 伯爵夫人与贸易;3 自动单元计数器	费舍尔科学	A49862;RRID：SCR_026963