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方法文章

用于氧气输送的分级多孔UiO-66纳米颗粒的合成、血红蛋白封装及生物正交PEG化

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DOI：

10.3791/70445

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2026年5月8日

 , 
1Department of Health Technology, Technical University of Denmark

本文内容

摘要

本方案详细描述了用于氧气递送的分级多孔UiO-66纳米粒子的合成、血红蛋白封装及表面聚乙二醇化。该方法结合缺陷工程与应变促进的生物正交偶联，以制备高通透性且生理稳定性良好的载体，适用于生物医学应用。

摘要

基于血红蛋白的氧载体（HBOCs）是缓解多种生物医学背景下缺氧状况的重要氧输送平台。然而，游离血红蛋白（Hb）在红细胞外不稳定且具有血管活性。本文介绍了一种可重复、可放大的分步实验方案，用于制备封装血红蛋白并由生物正交聚乙二醇（PEG）外壳稳定的分级多孔UiO-66纳米颗粒（HP-UiO-66 NPs）。通过十二烷酸调控及后续酸洗引入分级介孔结构，获得保持结晶性的HP-UiO-66-NH₂纳米颗粒，并呈现I型/IV型联合的N2吸附-脱附等温线。表面氨基被转化为叠氮基团（HP-UiO-66-N₃ NPs），从而实现无需催化剂的应变促进炔-叠氮环加成反应（SPAAC），生成Hb@HP-UiO-66-PEG纳米颗粒。该实验流程包括：i）UiO-66-NH₂纳米颗粒的缺陷工程，ii）调控剂去除，iii）叠氮基团引入，iv）在缓冲水相介质中装载血红蛋白，以及v）通过SPAAC介导的PEG化。每个步骤均详细说明了关键实验参数、常见失败模式及相应的解决方案，以提高实验室间的可重复性。该方案适用于每批次克级规模制备HP-UiO-66-NH₂纳米颗粒。在温和条件下实现约35%的封装效率（载药量约24 wt%），PEG化后获得可再分散、流体力学直径约140 nm、低多分散性的纳米颗粒。全面的理化表征验证了框架结构的完整性、介孔特征、表面化学修饰的成功实施，以及宽度达约12 nm的弥散性PEG冠层。功能实验表明，所封装的血红蛋白可逆地进行氧合与脱氧，说明其氧运输能力得以保留。PEG化显著提高了纳米颗粒在生理盐水、HEPES缓冲液和血清中的胶体稳定性和结构稳定性，避免了未PEG化样品在磷酸盐环境中发生的降解现象。通过整合详细的故障排查指导、关键步骤的视频可视化演示以及放大生产的考量，本模块化方案为基于金属有机框架的HBOCs提供了稳健且易于实施的制备路径。该策略可便捷地拓展至其他需要保护性且可及微环境以实现治疗递送的生物大分子或酶类。

引言

充足的氧合在多种生物医学环境中对有效治疗和组织修复至关重要1。在创伤和手术出血情况下，严重的缺氧可能危及生命，当供体血液不可获得时，安全的血液替代品显得尤为必要2。在肿瘤学中，缺氧的肿瘤区域会限制依赖氧气的治疗效果，而补充氧气输送可显著提高治疗疗效3,4,5,6。氧气在伤口愈合过程中也起着核心作用，增加氧气的可利用性可促进血管生成和组织修复7。同样，在缺血状态和器官移植中，氧载体可减轻缺氧性损伤，改善组织存活率和恢复能力8,9。

合成血红蛋白（Hb）类氧载体（HBOCs）是缓解缺氧的一种有前景的策略10。然而，红细胞（RBCs）外的血红蛋白本质上不稳定，会迅速解离为二聚体，这些二聚体可通过清除一氧化氮引发肾毒性、氧化损伤和血管收缩11。为应对这些挑战，已开发出包封策略，将血红蛋白稳定在生物相容性纳米载体中，例如脂质体12、聚合物囊泡13和聚合物纳米颗粒（NPs）14,15,16,17。尽管这些系统可提高血红蛋白的稳定性，但在保持天然氧结合功能的同时实现高包封效率仍具挑战性18。此外，氧化转化为高铁血红蛋白以及血红素泄漏可能损害其携氧能力19。快速清除和过早的血红蛋白泄漏进一步限制了循环时间及临床转化潜力20。

金属有机框架材料（MOFs）因其结晶结构、高比表面积和可调的孔隙率，近年来已成为药物和生物大分子递送的多功能纳米平台21。MOFs由金属节点与有机连接体配位构成，能够实现分子扩散和结构定制，因而适用于多种生物医学应用。然而，大多数MOFs主要具有微孔结构（<2 nm），严重限制了蛋白质、核酸或酶等大分子在合成后的负载22,23,24,25。克服这一限制的一种方法是原位仿生矿化法，即在MOF生长过程中利用生物分子作为成核中心，该策略已在ZIF-8和ZIF-90中得到验证26,27,28。尽管该方法有效，但其合成条件需保持温和，从而限制了可适用的MOF化学体系的范围29,30。

UiO-66 是一种基于锆的金属有机框架材料（MOF），由 Zr6O4(OH)4 八面体节点和 1,4-苯二甲酸（BDC）连接单元构成，以其卓越的化学稳定性和生物相容性而著称31。其坚固的框架在水相和生理环境中均能抵抗分解，因此非常适合用于生物医学应用32。然而，其固有的微孔结构限制了其在生物大分子封装方面的应用。血红蛋白（Hb）的分子尺寸约为 5 nm，无法进入原始 UiO-66 的内部孔道。因此，目前仅有少数研究探索了 UiO-66 在与 Hb 相关体系中的应用，且这些研究主要将 MOF 用于基于表面的 Hb 检测，而非框架内的封装33,34。因此，基于 UiO-66 的 Hb 封装平台仍相对缺乏发展。

最近，我们开发了一种具有分级多孔结构的UiO-66纳米颗粒（HP-UiO-66 NP），通过引入可容纳血红蛋白（Hb）的介孔区域，克服了孔径尺寸受限的问题，从而拓展了UiO-66在血红蛋白氧载体（HBOC）开发中的功能应用范围35。分级孔隙结构是通过缺陷工程实现的，具体方法是在合成过程中使用长链单羧酸（如十二烷酸（DA））作为调节剂36,37。该调节剂会与BDC配体竞争与Zr4+的配位，从而导致缺陷形成并扩大介孔孔径。随后去除调节剂后，即可获得同时具有微孔和介孔结构域的HP-UiO-66纳米颗粒，其孔径大小可通过调节剂的浓度或碳链长度进行调控36。

尽管引入介孔结构可提高分子可及性，但在含磷酸盐的缓冲液中可能损害骨架完整性。磷酸根离子可与锆（Zr）簇配位，导致部分或完全的结构解体38,39。因此，必须采用表面稳定化策略，以在生理条件下维持胶体和化学稳定性40。通常，金属有机框架（MOF）的表面稳定化可通过非共价相互作用（如范德华力和氢键）41、与暴露金属位点的配位作用42，或与有机连接基团的共价连接43来实现。在各类连接基团中，聚乙二醇（PEG）因其广泛可得性和较低的合成复杂性而尤为引人关注44。重要的是，PEG表面修饰（通常称为PEG化）赋予药物递送系统多种有利特性，包括优异的生物相容性、减少非特异性蛋白吸附，以及降低免疫识别和巨噬细胞摄取45,46。总体而言，这些效应可降低免疫原性反应并延长系统循环时间47。

传统的聚乙二醇化（PEGylation）技术通常依赖于碳二亚胺或马来酰亚胺化学方法，这些方法通常需要催化剂或反应性中间体，可能损伤血红蛋白（Hb）等敏感生物分子。为克服这一局限，我们采用应变促进的炔烃-叠氮化物环加成反应（strain-promoted alkyne-azide cycloaddition, SPAAC），这是一种无催化剂、具有生物正交性的反应，发生在叠氮化物与二苯并环辛炔（DBCO）功能化分子之间，可在温和的水相条件下实现位点特异性的偶联35,48。该方法可在不损害包封Hb功能的前提下，实现高效的表面修饰。

在我们先前报道的HP-UiO-66纳米颗粒35基础上，本研究此前侧重于结构设计与生物功能验证，而本实验方案则通过提供参数范围明确、关键操作注意事项清晰的详细分步实验流程，强调方法的透明性与可重复性。针对合成、血红蛋白（Hb）包封以及通过SPAAC化学进行聚乙二醇化（PEGylation）等关键步骤，本方案提供了相应的故障排除指导，最终获得稳定的Hb@HP-UiO-66-PEG纳米颗粒（见图1）。

该工作流程包括：(i) 使用DA作为调节剂进行缺陷工程，合成氨基修饰的HP-UiO-66-NH2纳米颗粒；(ii) 对表面氨基进行叠氮功能化；(iii) 在温和的水相条件下包封血红蛋白（Hb）；(iv) 通过SPAAC反应实现共价PEG偶联。

对于每个主要步骤，本方案均指出了常见的实验挑战，例如颗粒聚集、孔隙坍塌或表面功能化效率低下，并提供了实用的故障排除策略，以提高实验室间的可重复性。重要的是，本文充分证明了HP-UiO-66纳米颗粒的合成具有良好的可扩展性，能够实现每批次稳定的克级生产。

最终的聚乙二醇化纳米载体在生理盐水、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）和血清中表现出高度的胶体稳定性，同时保持血红蛋白（Hb）的氧结合与释放能力35。傅里叶变换红外光谱（FTIR）、核磁共振（NMR）、粉末X射线衍射（PXRD）、氮气（N2）吸附、泽塔（ζ）电位分析、动态光散射（DLS）、扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）等分析方法证实了化学结构的转变、框架完整性、孔隙率、纳米级形貌以及表面功能化的成功实现。

通过强调可重复性、可扩展性以及操作的清晰性，并结合对技术敏感步骤的视频可视化展示，该方法为制备稳定的基于金属有机框架（MOF）的载氧体提供了一条可重复、稳健且易于实现的途径。重要的是，该策略具有模块化特点，可便捷地拓展应用于其他需要在受保护且透氧的微环境中维持功能的生物大分子或酶。因此，Hb@HP-UiO-66-PEG 纳米颗粒代表了在开发高效输氧且能在生物液体中抵抗降解的血红蛋白基氧载体（HBOC）方面迈出的有前景的一步。

从实际应用的角度来看，只要其他生物大分子具备以下一个或多个特性，且尺寸小于约 20 nm（对应于最大可及的介孔尺寸），该策略便可拓展应用于血红蛋白（Hb）以外的生物大分子：（i）对苛刻的化学条件敏感，因而更适用于温和的合成与表面修饰；（ii）需要一个含水且允许氧气渗透的微环境以维持其功能活性；（iii）易受磷酸盐诱导的金属有机框架（MOF）降解影响，因而需要表面稳定化。该方法依赖适度的缺陷密度，以在介孔可及性与框架完整性之间实现平衡。当需要在无催化剂条件下进行位点特异性的表面修饰以保持生物分子功能时，基于SPAAC反应的聚乙二醇化（PEGylation）具有明显优势。因此，本实验方案非常适合在生理条件下实现高效的生物大分子负载、功能保持以及长期的胶体稳定性；而对于尺寸显著更大的生物分子，或需要极高热稳定性或酸稳定性的体系，则可能需要采用其他类型的MOF平台。

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方案

1. 血红蛋白提取（预计耗时：2 天）

注意：血红蛋白（Hb）的提取使用商业来源的牛血（SSI Diagnostica A/S，Hillerød，DK），操作步骤遵循我们先前报道的方案49。

  1. 将牛血（通常每次提取使用10 mL）转移至50 mL锥形离心管中。加入等体积的0.9%（w/v）生理盐水溶液以稀释血液并降低黏度。轻轻倒置数次，直至获得均匀的悬浮液。
  2. 将稀释后的血液在4 °C条件下以1,500 × g离心20分钟。离心后，上层为清晰的黄色上清液（血浆），下层为致密的红色沉淀（红细胞，RBCs）。若沉淀不完全，可根据需要继续离心。
  3. 小心倾去并弃除血浆层，避免扰动沉淀。加入新鲜生理盐水（10 mL），通过轻轻倒置重悬红细胞沉淀，并在相同条件下重复离心步骤。共进行两次洗涤，以去除血浆蛋白和血小板。
    注意：洗涤过程对于获得不含血浆污染物的纯净红细胞至关重要，这些污染物可能干扰后续的甲苯提取步骤。
  4. 第二次洗涤后，弃去上清液，并将清洗后的红细胞沉淀重悬于甲苯、超纯水和生理盐水按体积比1:0.4:1组成的混合液中。例如，在加入沉淀前，先在50 mL分液漏斗中混合10 mL甲苯、4 mL超纯水和10 mL生理盐水。
  5. 密封分液漏斗，轻轻倒置数次以混合各相。将漏斗置于4 °C环境中静置过夜（约12–16小时），以实现完全的相分离。甲苯相将提取脂质膜，留下富含血红蛋白（Hb）的清晰水相。
  6. 次日，使用分液漏斗的活塞小心收集下层水相。该层呈透明深红色。
  7. 将水相中的Hb溶液转移至离心管中，在4 °C条件下以8,000 × g离心20分钟，以去除残留的细胞碎片或乳化物质。
  8. 使用真空过滤装置，通过硅藻土滤板过滤上清液。仅施加轻微真空（避免高负压导致起泡或蛋白质变性）。
  9. 收集含有无基质血红蛋白（stroma-free Hb）的滤液。若立即使用，可将该原液置于冰上保存；如需长期储存，则分装（约1 mL）后于−80 °C冷冻保存。
    注意：Hb分装样品可在冷冻条件下保存数月而无明显降解。
  10. 采用双辛可宁酸（bicinchoninic acid）蛋白定量法，按照试剂盒说明书测定Hb浓度，并以纯牛Hb作为标准品进行校准。将最终Hb原液调整至所需工作浓度（通常为HEPES缓冲液中20 mg mL-1，pH 7.4）。
    注意：预期得到无细胞成分的澄清红色Hb溶液。
  11. 可选步骤：测定提取Hb的紫外-可见吸收光谱（375–700 nm），以评估其结合与释放氧气的能力。记录初始紫外-可见光谱。加入连二亚硫酸钠后通入N2气体10分钟以释放氧气，记录脱氧Hb的光谱。随后通入空气10分钟使其再氧合，并重新记录光谱。
    注意：分别在通入空气和N2后观察到氧合Hb（Soret带约412 nm；Q带约541 nm和577 nm）与脱氧Hb（Soret带约430 nm；Q带约557 nm）的特征吸收峰，表明Hb仍保持功能活性（补充图1）。
    警告：操作甲苯时应在通风橱中进行，并穿戴适当的个人防护装备，包括实验服、护目镜和手套。本研究中所有含甲苯的废液均被收集，并按照丹麦环境部的指南，作为有机化学液体废物（C类）存放在标有"toluene and mixture,"的指定容器中。相应的废弃物处理文件见补充文件1。

2. HP-UiO-66-NH2 纳米颗粒的制备（预计耗时：3天）

警告：盐酸（37%）具有腐蚀性；需在通风橱内操作，并穿戴实验服、耐酸手套和适当的护目装备。应缓慢加入酸液，并避免吸入其蒸气。

  1. 称取 ZrCl4 （400 mg，1.715 mmol）加入250 mL圆底烧瓶中。缓慢加入DMF（80 mL），超声处理5分钟，使ZrCl完全溶解4加入DA（12 g，60 mmol），超声处理额外30分钟，直至获得澄清的均一溶液。使用量筒测量溶液总体积，并根据需要添加DMF，调节最终体积至100 mL。DA作为竞争性调节剂，可引入可控的晶格缺陷。
    注意：溶解 ZrCl 时应缓慢加入 DMF4，由于配位过程为放热反应，可能产生轻微烟雾；所有操作均需在通风橱中进行。考虑到DA加入后引起的体积增加，溶解ZrCl时应使用80 mL DMF作为初始体积4 以及DA，待完全溶解后，再调整终体积至100 mL，以确保浓度精确可控。
  2. 加入2-氨基对苯二甲酸（BDC-NH₂）2, 155 将mg（0.857 mmol）加入同一烧瓶中，再超声处理30分钟。继续操作直至得到均一的淡黄色溶液。
  3. 将混合物转移至一个150 mL聚四氟乙烯内衬的高压反应釜或适用于溶剂热合成的圆底耐压容器中。密封后，放入预热至120 °C的马弗炉中反应18 h。加热过程中切勿扰动反应器，以避免发生不可控的成核过程。
  4. 反应结束后，关闭炉子，让反应容器自然冷却至室温（约 2 h）。观察到培养基中均匀出现细小的黄色悬浮物。
  5. 通过离心收集产物（11,000 x g，10 分钟，室温）后弃去上清液。用 DMF（100 mL）洗涤沉淀物三次，每次均采用相同的离心条件，以去除过量配体和未反应的 DA。若产物未能完全沉淀，可根据需要延长离心时间。
  6. 配制酸去除溶液：将0.5 mL浓盐酸（37%）加入100 mL DMF中。将洗涤后的沉淀物完全浸入该溶液中，置于马弗炉内90 °C加热12 h。此步骤可去除DA调节剂，从而在结构中形成介孔。
  7. 12 小时后，离心（11,000 x g，5 分钟，室温）并弃去上清液。使用含有 0.5 mL 盐酸的新配 DMF 溶液重复酸处理步骤，以确保完全去除 DA。若产物未完全沉淀，可根据需要延长离心时间。
  8. 依次用 DMF、丙酮和乙醇（各 100 mL，11,000 × g）洗涤沉淀 g，5 分钟，室温）以去除任何残留的酸和溶剂。如果沉淀未完全成团，可根据需要延长离心时间。每次洗涤之间，通过涡旋振荡或轻度超声处理轻轻重新分散沉淀。
  9. 在真空烘箱中干燥产物（140 °C） 在通风橱内常温干燥过夜。最终材料（HP-UiO-66-NH₂）2 NPs呈细黄色粉末状，典型产量约为428 mg。
  10. 确认PXRD在2θ = 7.3°、8.4°、25.7°处的峰仍保持尖锐（图2A)，表明保留了结晶性UiO-66拓扑结构。通过 1碱性处理（D 中 2 M KOH）后的氢核磁共振谱2O）消化（在1.2 ppm处无亚甲基峰）（图2B).
  11. 通过N表征孔隙率2 77 K下的吸附-脱附50曲线显示为I型/IV型复合等温线，并带有滞后环（图2C），证实介孔的形成。
    注意：高温干燥不完全或样品质量不足会导致使用 N 测量孔隙率时结果不准确2 吸附-脱附等温线；在140 °C下重复真空干燥过程，若需测定布鲁诺-埃米特-泰勒（BET）比表面积，则确保样品质量超过100 mg < 1,000 m2 g-1.
  12. 可选：使用扫描电镜（SEM）评估纳米颗粒的形貌。HP-UiO-66-NH₂2 纳米颗粒呈球形形貌，粒径分布均一，约为100 nm（图2D).
    注意：预期得到 HP-UiO-66-NH2 具有微孔和介孔结构的纳米颗粒，适用于后续血红蛋白的包封。
  13. HP-UiO-66-NH 的合成2 纳米颗粒（NPs）可通过按比例增加步骤2.1至2.9中使用的所有试剂和溶剂，并进行多个平行的溶剂热反应实现放大生产。通过保持相同的摩尔比、浓度、反应温度和反应时间，并将试剂和溶剂用量增加1.5倍，可同时运行两个或多个150 mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜或圆底耐压容器，从而实现HP-UiO-66-NH的克级制备。2 纳米颗粒（NPs）图3).
    注意：在通风橱内操作所有有机溶剂，并穿戴实验服、耐酸手套和适当的护眼装备。收集所有含二甲基甲酰胺（DMF）的废液，并将其作为有机化学液体废物置于标有“C组”的指定容器中处置 "DMF 和混合物" 根据丹麦环境部的指南进行处理。含有微量 ZrCl 的废液4 以及 HCl 均已按相应规定处理。相应的废弃物处理文件见于 补充文件 1.

3. HP-UiO-66-NH2 纳米颗粒的叠氮功能化（HP-UiO-66-N3 纳米颗粒）（预计耗时：1 天）

警告：三甲基硅基叠氮化物（TMSN₃）和叔丁基亚硝酸酯（tBuONO）具有毒性且易挥发。所有操作步骤均须在通风橱中进行，并穿戴实验服、腈类手套和护目装备。

  1. 将HP-UiO-66-NH2纳米颗粒（50 mg）准确称量至25 mL圆底烧瓶中。加入THF（10 mL），超声处理5分钟，以充分分散颗粒。悬浮液变为不透明但均匀。
    注意：超声后纳米颗粒的均匀分散对于与反应物有效接触至关重要。若分散不完全，可增加溶液体积并重复超声处理。
  2. 将烧瓶置于磁力搅拌器上的冰水浴（0 °C）中。使用玻璃注射器在5分钟内逐滴加入tBuONO（0.4 mL），同时保持温度低于5 °C。
  3. 在相同低温条件下立即逐滴加入TMSN₃（0.35 mL）。可能出现轻微冒泡现象，表明亚硝化反应正在进行。用铝箔包裹反应浴，避免反应暴露于光线下。
  4. 在冰水浴中继续搅拌反应混合物过夜（约16小时），以使MOF表面的氨基基团完全被叠氮基取代。
  5. 移除冰浴，使悬浮液升至室温。离心（11,000 × g，5分钟，室温）收集改性后的纳米颗粒。若沉淀未完全沉降，可根据需要延长离心时间。
  6. 用THF（10 mL）彻底洗涤沉淀三次，每次洗涤后均通过离心（11,000 × g，5分钟，室温）收集沉淀。随后用丙酮（10 mL）再洗涤三次，每次均在相同条件下离心，以去除残留试剂和副产物。若沉淀未完全沉降，可根据需要延长离心时间。
  7. 将产物（HP-UiO-66-N3 纳米颗粒）先在通风橱内干燥，再于真空条件下在烘箱中（140 °C）干燥过夜。典型产率约为45 mg。
  8. 通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）验证化学转化：在约2122 cm-1处出现尖锐的不对称叠氮伸缩振动峰（图4A）。该吸收带强度与表面取代效率相关。
    注意：转化不完全可能影响后续的点击偶联反应。若叠氮峰较弱，可使用两倍量的tBuONO和TMSN₃重复功能化步骤。预期获得具有保留结晶性和介孔结构的叠氮封端HP-UiO-66-N3纳米颗粒（图4B-D），可用于血红蛋白包封及SPAAC聚乙二醇化。
    警告：所有含TMSN₃的废液（包括与其他试剂如tBuONO和THF的混合物）均须按照丹麦环境部的指南，收集至指定的O类危险废物容器中。所有容器必须明确标注含有TMSN₃及其混合物。相关废物处理文件详见补充文件1。

4. 血红蛋白加载与定量（预计耗时：2 天）

  1. 将HP-UiO-66-N3纳米颗粒（5 mg）转移至2 mL离心管中，加入0.5 mL HEPES缓冲液（20 mM，pH 7.4），超声处理约2分钟。随后加入0.5 mL含血红蛋白（Hb，20 mg mL-1）的HEPES缓冲液，轻轻翻转离心管数次，使纳米颗粒充分分散。
  2. 将离心管置于恒温振荡器中，在室温（22–25 °C）下以1,000 rpm振荡孵育2小时。
  3. 孵育结束后，在室温下以13,500 × g离心5分钟，收集Hb@HP-UiO-66-N3纳米颗粒沉淀。小心收集上清液，用于定量未包封的Hb。若沉淀未完全沉降，可根据需要延长离心时间。
  4. 用1 mL超纯水轻轻吹打洗涤沉淀，以去除松散吸附的Hb，重复洗涤两次。每次洗涤后均小心收集上清液，用于未包封Hb的定量。将最终沉淀重悬于0.5 mL超纯水中用于表征。将样品保存于冰箱（4 °C）中，防止氧化。
  5. 采用十二烷基硫酸钠（SLS）-Hb法测定收集的上清液中未包封的Hb含量51。取10 µL各上清液加入96孔微孔板中，加入100 µL SLS试剂（0.6 mg mL-1，溶于超纯水）。室温避光孵育5分钟，随后使用紫外-可见分光光度计在412 nm处测定吸光度。
  6. 使用HEPES缓冲液配制Hb标准溶液（0–10 mg mL-1），绘制标准曲线，将吸光度值转换为浓度。
  7. 按以下公式计算包封率（EE）和载药量（LC）：
    EE (%) = [(初始Hb量 - 上清液中Hb量) / 初始Hb量] × 100
    LC (%) = [(包封Hb量) / (包封Hb量 + 纳米颗粒质量)] × 100
  8. 为放大Hb包封过程，将100 mg纳米颗粒与20 mL Hb溶液（10 mg mL⁻¹）进行孵育。为评估包封后的孔隙率，将所得纳米颗粒浸入乙醇中24小时，随后在140 °C真空烘箱中干燥过夜，并记录N2吸附-脱附等温线以评估孔隙结构。粉末呈现红色表明Hb成功包封（图5A），N2吸附量显著降低表明Hb成功填充介孔（图5B）。
  9. 使用Zetasizer Nano ZS测定ζ电位。表面电荷由HP-UiO-66-N3纳米颗粒的约+40 mV降低至Hb@HP-UiO-66-N3纳米颗粒的约+20 mV，与Hb吸附现象一致（图5C）。
  10. 可选：获取扫描电子显微镜（SEM）图像（图5D）和粉末X射线衍射（PXRD）图谱（图5E），以确认纳米颗粒的形貌完整性和结构稳定性。
  11. 记录紫外-可见吸收光谱（375–700 nm），以评估纳米颗粒的可逆氧结合能力。加入连二亚硫酸钠后通入N2 10分钟以释放氧气，记录光谱；随后通入空气10分钟使氧气重新结合，再次记录光谱（图5F）。
    注意：通入空气后出现氧合Hb的特征Soret带（~412 nm）和Q带（~541 nm和~577 nm），通入N2后出现脱氧Hb的特征Soret带（~430 nm）和Q带（~557 nm），表明Hb仍保持功能活性。
  12. 预期获得均匀的红色Hb@HP-UiO-66-N3纳米颗粒，其中含有功能活性的Hb，并表现出可逆的氧合行为。

5. Hb@HP-UiO-66-PEG 纳米颗粒的制备：通过SPAAC反应进行PEG化（预计耗时：2天）

  1. 准备一个2 mL离心管，其中含有分散于0.5 mL超纯水中的Hb@HP-UiO-66-N₃ NPs（10 mg）。加入DBCO-PEG（Mw ~2,000，20 mg溶于0.5 mL超纯水），使PEG与NPs的质量比达到2:1（w/w）。轻轻涡旋振荡至充分混合。
  2. 在室温下将混合物置于恒温振荡器中，以1,000 rpm孵育1小时，随后转移至冰箱（4 °C）中过夜反应（约16小时）。该无催化剂的SPAAC点击反应可使DBCO与叠氮基团共价偶联，形成稳定的三唑键。
  3. 以 12,000 x g 离心 g 室温下离心5分钟，使PEG化的Hb@HP-UiO-66-PEG纳米颗粒沉淀。若沉淀未完全沉降，可酌情延长离心时间。弃去含有未反应PEG的上清液。
  4. 将沉淀物在相同离心条件下用超纯水洗涤三次（每次2 mL，通过反复吹打混匀），以确保去除游离的聚乙二醇链和小分子副产物。
  5. 将纯化的 Hb@HP-UiO-66-PEG 纳米颗粒重悬于 2 mL 超纯水中，4 °C 保存。
    胶体呈现均匀且略带乳光，表明具有良好的分散稳定性。
  6. 通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）确认PEG化反应成功图6A）：2122 cm⁻¹ 处叠氮基特征峰的消失-1 以及聚乙二醇衍生的亚甲基（−CH2−）和醚键（−O−）信号，分别位于 2883 和 1097 cm⁻¹-1分别。
  7. 通过验证 1H NMR（图6B) 在 2 M KOH/D 中碱性消化后2O；PEG修饰的样品在δ = 3.53 ppm处显示出一个额外的信号，对应于PEG的氧乙烯质子。
  8. 通过动态光散射法（DLS）测量流体动力学直径和多分散指数（PDI）图6C).
    粒径从约115 nm（PDI 约0.1）增加至约140 nm（PDI 约0.17），证实表面已包覆一层薄聚合物层。
  9. 可选：使用 Zetasizer Nano ZS 测定表面ζ电位，以验证表面聚乙二醇化对表面电荷的影响可忽略不计（图6DPEG化后表面电荷发生轻微变化（从约+20 mV变为约+17 mV），表明对表面电荷的影响极小。
  10. 通过透射电子显微镜观察形态图6E透射电子显微镜（TEM）显示，颗粒边缘周围存在一层弥散的约10-12 nm宽的环状结构，代表PEG冠层。
  11. 使用氧电极进行释氧实验图6F以证明在 PEG 化后 Hb 功能保持完整，与非 PEG 化形式相似。预期获得稳定的、呈红棕色分散的 Hb@HP-UiO-66-PEG 纳米颗粒，具有良好的胶体稳定性并保留氧结合能力，适用于长期生理学测试。
  12. 可选：对游离血红蛋白及封装于Hb@HP-UiO-66-PEG纳米颗粒中的血红蛋白进行氧解离曲线（ODC）测定，以确定血红蛋白氧饱和度为50%时的氧分压（p50）和Hill系数（Hill-n）图7).

6. 纳米颗粒稳定性的评估（预计耗时：7 天）

  1. 将 Hb@HP-UiO-66-PEG 纳米颗粒（约 5 mg）分装至七个 2 mL 离心管中。每管分别加入 2 mL 以下介质：超纯水、生理盐水（0.9% NaCl）、HEPES（20 mM）、小鼠血清、人血浆、杜氏改良伊格尔培养基-高糖（DMEM）和磷酸盐缓冲液（PBS）。确保离心管盖紧密闭合，以防止孵育过程中介质蒸发。CD-1 小鼠血清和人血浆购自 Innovative Research（Novi, MI, US）。
  2. 将样品在 37 °C 下以 1,000 rpm 在恒温振荡器中孵育，最长 7 天。
  3. 在第 3 天和第 7 天，通过离心（12,000 g，10 分钟，室温）收集颗粒，用超纯水洗涤一次，并干燥用于 PXRD 分析（图 8A）。若沉淀未完全成团，可根据需要延长离心时间。
  4. 在 0、24、72 和 168 小时时，取出等分试样（约 50 µL），稀释 20 倍后进行动态光散射（DLS）分析（粒径和 PDI）（图 8B）。
  5. 可选：在 PBS 中孵育 48 小时后制备 SEM 样品，以直观检查形貌（图 8C）。
    注意：将纳米颗粒悬浮液（在 PBS 中）用超纯水稀释对 SEM 分析至关重要，因其可减少缓冲液组分带来的背景干扰，有助于清晰成像纳米颗粒。
  6. 在相同条件下与未 PEG 修饰的 Hb@HP-UiO-66-N3 纳米颗粒进行比较；特征性晶体衍射峰迅速消失并出现宽泛的非晶散射特征，表明无 PEG 涂层时稳定性差。
    注意：在所有介质中，PEG 修饰的样品在 7 天后仍保持结构完整，而未修饰的样品在 PBS 或 DMEM 中 24 小时内即发生分解。

7. 理化性质表征（预计耗时：约15天）

注意：本节描述了用于确认纳米颗粒（NPs）形态、组成、孔隙率以及血红蛋白（Hb）完整性的分析方法。这些表征技术共同验证了合成与修饰过程的可重复性。

  1. PXRD
    1. 将每种纳米颗粒样品约5 mg在冷冻干燥机中干燥过夜，以去除吸附的水分，然后进行测量。
    2. 将样品加载到平坦的零背景硅片样品台上，用干净的玻璃片轻轻压平，形成一层薄而均匀的样品层。
      注意：避免用力过猛，以免引起择优取向效应。
    3. 使用配备Cu Kα辐射源（λ = 1.5418 Å）的台式衍射仪记录PXRD图谱。扫描参数设置为：2θ = 4–50°，步长 = 0.02°，每步停留时间 = 1 s。
    4. 将获得的图谱与使用 Mercury 软件基于先前报道的晶体数据模拟生成的 UiO-66 结构进行比较317.3°、8.4° 和 25.7° 处出现尖锐峰表明具有晶体完整性。
  2. N2 吸附-脱附（BET比表面积与孔径分布）
    1. 使用 Micromeritics Smart VacPrep 系统，在真空条件下以超高纯度氮气吹扫，于 140 °C 对每种纳米颗粒样品脱气约 100 mg，持续 24 小时2.
    2. 立即将脱气后的样品转移至 Micromeritics Tristar 比表面积分析仪的分析口。记录 N2 77 K 下相对压力（P/P₀）范围为 0–1 的等温线
    3. 使用BET方法并依据扩展的Rouquerol准则计算比表面积52使用 Micromeritics 软件中实现的非局部密度泛函理论计算孔径分布。
    4. 使用 Origin 2022 生成吸附/脱附等温线及孔径分布图。将吸附/脱附数据导入软件中，以相对压力（P/P₀）为 X 轴，N₂ 吸附体积为 Y 轴2 在Y轴上。
    5. 以孔径宽度为横轴，以增量孔体积为纵轴绘制孔径分布数据。将结果表示为 "线与符号" 图表。使用软件的默认设置执行所有分析。
  3. 傅里叶变换红外光谱法
    1. 使用洁净的玛瑙研钵将每份约5 mg的干燥样品研磨成细粉。将粉末置于ALPHA-P Bruker光谱仪的ATR晶体上53.
    2. 在 4,000–400 cm⁻¹ 范围内采集光谱-1 2厘米范围-1 分辨率
    3. 识别特征峰：N的出现3 在约 2122 cm 处伸展-1 确认叠氮化物的形成（图4A）。聚乙二醇化后，观察—CH2− 和约 2883 cm⁻¹ 处的 C-O-C 键吸收峰-1 和 ~1097 cm-1，同时伴随着N的消失3 拉伸图6A）。预期叠氮基团特征峰消失，并出现PEG来源的亚甲基（−CH₂−）峰2−）和醚键（−O−）信号表明SPAAC反应已完全。
    4. 使用 Origin 2022 绘制 FTIR 曲线。将原始数据以 X（波数）和 Y（透射率）值的形式导入软件。生成图表 "线" 使用软件的默认设置进行格式化。
  4. 1H NMR
    1. 将约 10 mg 的 NPs 加入 0.5 mL 的 2 M KOH 溶液中2将O置于玻璃小瓶中，80 °C加热1-2小时以消化框架。
    2. 离心机（12,000 × g） g，室温下离心10分钟，以沉淀未溶解的残渣。将上清液转移至5 mm核磁共振管中。
    3. 记录 1在400 MHz Bruker Avance核磁共振波谱仪上测定氢谱。
    4. 指定BDC-NH的特征化学位移，包括芳香族质子2 （δ = 6-8 ppm）和 PEG 信号（δ = ~3.53 ppm， 图6B），使用 MestReNova 软件。利用该软件的 NMR 处理模块及其默认设置分析 NMR 数据。
  5. 扫描电子显微镜
    1. 将约5 µL的NP悬浮液滴加到硅片上，在无尘柜中自然风干。若出现充电现象，用5 nm金进行溅射镀膜。
    2. 在 FEI Quanta 200 扫描电镜下以 10–20 kV 加速电压成像。
    3. 使用 ImageJ 分析图像。将包含嵌入式比例信息的原始 TIFF 图像导入软件中，仅调整亮度和对比度以用于可视化，不得应用任何可能影响尺寸信息的额外处理。利用软件的 Analyze 功能生成比例尺。
  6. 透射电子显微镜
    1. 将约 5 µL NP 分散液置于铜网支持的 lacey-carbon 载网上（300 目）。用滤纸吸去多余液体，并在常温条件下干燥。
    2. 在 FEI Tecnai T20 G2 透射电子显微镜下以 200 kV 电压观察。
    3. 使用 ImageJ 分析图像。图像处理遵循第 节中描述的步骤 7.5.3.
  7. DLS 和 ζ-电位
    1. 将纳米颗粒在超纯水中稀释约20倍，用于粒径和PDI分析；用于ζ电位测定时，在HEPES缓冲液（20 mM，pH 7.4）中稀释。
    2. 使用Zetasizer Nano ZS在25 °C下进行测量。制备至少三个独立样品（n = 3），每个样品重复测量三次。
    3. 使用 Origin 2022 绘制 DLS 和 ζ-电位数据。以强度加权的粒径分布形式呈现 "线与符号" 图表和ζ电位结果作为 "柱" 图表。数据以均值 ± 标准差（n = 3）表示。所有分析均使用软件的默认设置进行。
  8. 紫外-可见光谱法用于血红蛋白功能分析
    1. 将3 mg游离血红蛋白或相应量的纳米颗粒（即含有等量包封血红蛋白的纳米颗粒）分散于3 mL超纯水中。将悬浮液转移至石英比色皿中。使用UV-2600紫外-可见分光光度计在375–700 nm范围内记录紫外-可见吸收光谱。
    2. 向血红蛋白溶液或纳米颗粒悬液中加入少量连二亚硫酸钠，并用 N₂ 鼓泡2 10分钟以去除样品中的氧气。记录Soret带从412 nm红移至430 nm以及Q带合并的现象。通过通入空气10分钟使样品重新氧合，观察上述现象的逆转。图5F 和 补充图1).
    3. 使用 Origin 2022 绘制数据。以谱图形式呈现结果 "线" 以波长为横轴、吸光度为纵轴的图谱。
  9. 释放氧气的定量分析
    1. 分散1 mg游离血红蛋白或相应量的Hb@HP-UiO-66-N3 以及含有等量包封血红蛋白的 Hb@HP-UiO-66-PEG 纳米颗粒溶于 600 µL 超纯水中。将悬浮液转移至 2 mL 玻璃小瓶中，并用橡胶塞密封。
    2. 小心地将氧电极的针式探头穿过橡胶塞插入悬浮液中，以使用针型氧电极监测溶解氧水平2 米
    3. 快速添加 K3[Fe(CN)6使用注射器针头向悬浮液中加入溶解液（10 wt% 溶于 100 µL 超纯水中），并持续记录氧气水平的变化。
    4. 通过减去K之后观察到的最大值来计算释放的氧气量3[Fe(CN)6] 加入前的初始值。将获得的数值归一化为相同量的游离 Hb 释放的氧气量（图6F使用 Origin 2022 进行数据分析。每组游离血红蛋白或每种纳米颗粒（NP）至少测定三个独立样本（n = 3）。
      注意：Hb@HP-UiO-66-N3 Hb@HP-UiO-66-PEG NPs 表现出与游离血红蛋白相当的释氧能力，各自释放的氧气量约为游离 Hb 释氧量的 60%。
  10. ODCs 的测定及 p50 和 Hill-n 的计算
    1. 制备游离牛血红蛋白或 Hb@HP-UiO-66-PEG 纳米颗粒，终浓度约为 1 mg mL⁻¹-1 在3 mL HEPES-生理盐水缓冲液（20 mM HEPES，0.9% (w/v) NaCl，pH 7.4）中溶解。将样品转移至配有磁力搅拌子的石英比色皿中。
    2. 将比色皿放入Hemox分析仪中。将测量温度设置为37 °C，并在持续搅拌下使系统平衡，直至获得稳定的基线。
    3. 在1–148 mmHg的氧分压范围内，通过逐步脱氧法记录氧解离曲线（ODCs）。使用预装的Hemox分析仪软件测量ODCs，并采用默认分析设置计算p50和Hill系数（Hill-n）。每份样本测定三个独立样本（n = 3）。
    4. 导出处理后的数据，并使用 Origin 2022 默认设置绘制氧解离曲线（ODCs） "线" 图表格式

8. 可重复性与统计分析

  1. 本方案中描述的所有实验步骤均需独立重复至少三次。结果以这些重复实验中观察到的典型结果进行报告。关键实验参数（如反应时间和温度）应控制在合理范围内，以确保其他使用者能够获得可重复且可靠的结果。
  2. 结构表征数据（PXRD、N2 吸附-脱附、FTIR、1H NMR、SEM、UV-vis）作为代表性数据呈现，用于定性确认，无需进行统计分析。
  3. 定量测量结果（DLS、ζ-电位、p50、Hill-n）以均值 ± 标准差（mean ± SD，n ≥ 3）表示。根据情况采用非配对双尾 Welch t 检验或单因素方差分析（one-way ANOVA）确定统计学显著性。显著性水平标注如下：ns（无显著性差异），* = p < 0.05，** = p < 0.005，*** = p < 0.001，**** = p < 0.0001。

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结果

通过PXRD验证了HP-UiO-66-NH2 NPs的成功合成（图2A），其在2θ = 7.3°、8.4°和25.7°处显示出特征衍射峰，与模拟的UiO-66结构高度一致36。相对于模拟图谱的轻微峰展宽归因于颗粒的纳米级尺寸，并证实了合成后晶体结构的完整性得以保持54。通过碱性消解后的1H NMR光谱确认了DA的完全去除，表现为1.2 ppm处DA特征亚甲基质子信号的消失（图2B）。N2吸附-脱附等温线呈现出I型与IV型的组合特征，在P/P₀ = 0.8–1.0范围内观察到滞后环（图2C），表明微孔和介孔结构共存55。在最佳条件下，HP-UiO-66-NH2 NPs应表现出700–800 cm3g-1...

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讨论

本方案提供了一种稳健且可重复的方法，用于合成、功能化及表征专为血红蛋白（Hb）包封和氧输送应用设计的HP-UiO-66纳米颗粒（NPs）。通过采用由内而外的工程化策略，本研究建立了一个可广泛推广的框架，用于设计适用于生物医学领域的金属有机框架（MOF）纳米颗粒，包括生物大分子和药物递送系统。尽管该材料的基本概念和功能性能此前已有报道，但本方案通过强调操作的清晰性、可重复性及可扩展性，显著拓展了先前的研究。文中提供了详细的处理步骤、对敏感环节的故障排除指导以及克级规模合成的实用操作说明，以促进在不同实验室间的可靠实施。如下所述，若干步骤对于获得结构和功能特性均最优的稳定纳米颗粒尤为关键。

HP-UiO-66-NH2 纳米颗粒的缺陷合成
缺陷工程策略依赖于引入DA作为调节剂，使其与主要连接体BDC-NH2竞争与Zr4+节点的配位。这种竞争有意产生"缺失连接体"缺陷，随后在去除调节剂后转化为可及...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

我们衷心感谢欧洲研究理事会（European Research Council）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划（资助编号：101002060）下的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-氨基-1,4-苯二甲酸 默克生命科学 A/S (Søborg，DK381071-25G
4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸默克生命科学公司（Søborg，丹麦H3375-100G
丙酮（99%）VWR 国际（Søborg，DK23J244030
二辛可宁酸蛋白质测定 赛默飞世尔科技（罗斯基勒，丹麦）23235
牛血 SSI Diagnostica A/S（Hillerød）ød，DK77667
离心管
离心机 赛默飞世尔科技公司（美国马萨诸塞州）75009903Megafuge ST Plus 系列 
重水默克生命科学 A/S (Søborg, DK151882
二苯并环辛炔-聚乙二醇BroadPharmBP-23949
十二烷酸 默克生命科学 A/S (Søborg, DKL556-1KG
杜尔贝科’改良型伊格尔培养基’s 培养基−高葡萄糖 默克生命科学 A/S (Søborg，丹麦）11965092
乙醇（100%）VWR 国际（Søborg，丹麦24L044013
傅里叶变换红外光谱法 布鲁克（Billerica，美国）
血氧分析仪 TSC Scientific Crp（宾夕法尼亚州，美国）
人枸橼酸抗凝血浆TebuBioSER-PLP25
盐酸（37%）默克生命科学公司（Søborg，丹麦320331-500ML
ImageJ 软件美国国立卫生研究院版本 1.47t
Lacey碳膜铜网（300目）Agar Scientific Ltd.，（英国埃塞克斯郡斯坦斯特德）AGS166-3H
磁力搅拌器IKA-Werke GmbH & Co. KG（德国）识别编号：0010011496
MestReNova 软件Mestrelab Research（西班牙）版本 12
Micromeritics Tristar 比表面积分析仪赛默飞世尔科技公司ASAP 2020 Plus
小型离心机Eppendorf Nordic (Hørsholm, DK货号 5452000010
小鼠血清Innovative Research（美国密歇根州诺维）IGMSCD1SER10ML
马弗炉 Nabertherm GmbH (Bremen, DE)马弗炉 LE 6/11
N,N′-二甲基甲酰胺（99.9%）VWR International (Søborg，DK250131a008
Nanodrop 2000c 仪器 Thermo Fisher
核磁共振 布鲁克（Billerica，美国）
O2 米 PreSens（德国雷根斯堡）
Origin 2022 软件OriginLab Corporation (MA, USA)版本 2022 
氧气传感器PreSens（德国雷根斯堡）OXY-1 ST 痕量
磷酸盐缓冲液 默克生命科学 A/S (Søborg，丹麦P4417-50TAB
酶标仪Tecan集团有限公司  （Männedorf, CH
六氰合铁(II)酸钾默克生命科学 A/S (Søborg，丹麦60299-100G
氢氧化钾默克生命科学公司（Søborg，DK221473-500G
粉末X射线衍射 马尔文帕纳科有限公司，（英国马尔文）型号：Malvern Panalytical Aeris Research 600W X射线衍射仪，用于粉末测量（发布于2020年）
圆底压力容器 默克生命科学 A/S (Søborg，丹麦SYNP170004-1EA
扫描电子显微镜 FEI 公司（Hillsboro，美国）双束 FEI Helios Nanolab 600
氯化钠 默克生命科学 A/S (Søborg，丹麦71376
连二亚硫酸钠 默克生命科学 A/S (Søborg，丹麦71699-250G
十二烷基硫酸钠 默克生命科学 A/S (Søborg, DKL4509-100G
Synthware™ 圆底压力容器默克生命科学 A/S (Søborg, DKSYNP170003
叔丁基亚硝酸酯 默克生命科学 A/S (Søborg，DK20370-100ml-F
四氢呋喃（99.7%）VWR 国际（Søborg，DK201022A004
恒温混匀仪Grant Instruments (Cambridge) Ltd (英国)PHMT-PSC18 (01012015020119)
透射电子显微镜技术 FEI 公司（Hillsboro，美国）FEI Tecnai T20
三甲基硅基叠氮化物 默克生命科学 A/S (Søborg，DK155071-10G
TSC HEMOX 数据采集系统TSC Scientific Crp（宾夕法尼亚州，美国）Hemox分析仪软件 
超声波破碎仪 Branson Ultrasonics Corporation（美国丹伯里）货号：2410240003
紫外-可见分光光度计 岛津（京都，日本）
真空烘箱 赛默飞世尔科技公司（美国马萨诸塞州）
Zetasizer Nano ZS马尔文帕纳科有限公司，（英国马尔文）序列号 MAL1188530
四氯化锆默克生命科学 A/S (Søborg，丹麦357405-100G

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