干法提取的鹰嘴豆蛋白浓缩物在3.0% w/v浓度下表现出高蛋白含量、良好的起泡性能以及对纳米乳液的有效稳定作用。结构与热分析表明其以无定形结构为主，残余结晶度低，分子柔韧性增强，证明其适合作为可持续的植物源功能性成分用于食品胶体体系。
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摘要
摘要
通过干法提取工艺获得鹰嘴豆蛋白浓缩物（CPC），并系统表征其组成、功能及结构特性，以评估其在纳米乳液（NE）应用中的适用性。干法提取的CPC蛋白含量为44.8%，表现出优异的 功能性能，包括61.1%的起泡能力和94.7%的高泡沫稳定性，反映出高效的界面吸附能力与内聚膜形成能力。使用3.0% w/v CPC作为乳化剂制备的NE体系，显著降低了液滴粒径，Z-平均粒径为152.7 nm，多分散系数为0.30，表明液滴尺寸分布细小且相对均匀，具有动力学稳定的胶体特性。对鹰嘴豆粉（CF）和CPC进行的差示扫描量热法（DSC）比较分析显示存在两个主要的吸热转变。两种样品均在68.4 °C出现与结合水释放相关的低温吸热峰，但CPC的焓变显著降低，表明干法提取后天然分子有序结构部分遭到破坏。用于NE体系的CPC的X射线衍射（XRD）图谱在2θ范围10°–30°内呈现宽泛的非晶晕，其间夹杂少量低强度的尖锐衍射峰。这些结果证实该浓缩物以非晶结构为主，同时含有部分结晶区域，整体结晶度约为15%。本研究描述了一种可重复、无溶剂的油包水纳米乳液制备方法，采用干法风选分离的CPC作为乳化剂，适用于教学示范及潜在的工业规模放大。
引言
豆类来源的蛋白质作为多功能成分，在设计结构稳定的食品乳液方面已受到广泛关注。在这些来源中，鹰嘴豆（鹰嘴豆) 尤为显著，因其全球产量极高（位居第三rd 全球种植最广泛的豆科作物），富含蛋白质（18%–24%），低致敏性，且必需氨基酸组成均衡1,2通常，蛋白质分离物经过额外加工以去除碳水化合物和脂肪，其蛋白质浓度较高（80%–90%）；而浓缩乳清蛋白（CPC，蛋白质含量50%–75%）则保留了膳食纤维及其他必需营养素。3这些营养和农艺优势凸显了鹰嘴豆蛋白作为传统植物性和动物性蛋白乳化剂的一种可行替代品。尽管传统低分子量表面活性剂被广泛使用，但其稳定的乳液在储存期间往往仍存在热力学不稳定的问题，容易发生聚结、絮凝和相分离。1相比之下，纳米乳液（NEs）通常具有低于200 nm的液滴直径，表现出更高的动力学稳定性、对包封生物活性成分的更好保护作用，以及在水相体系中更强的分散性。因此，纳米乳液技术已成为开发功能性食品的一种有效策略，可实现疏水性成分的可控释放并提高其生物利用度4.
最近一项研究报道，鹰嘴豆蛋白（CPC） 在乳液形成方面表现出优异的界面和功能特性，包括较强的持水能力、显著的起泡性能以及稳定油水界面的能力。由于其乳化稳定性和清洁标签特性，CPC 还被评估为蛋黄在蛋黄酱型乳液中的潜在替代品1。除这些模型体系外，基于鹰嘴豆蛋白的纳米乳化剂在多种食品基质中也具有应用潜力，包括饮料（浑浊饮料、蛋白水、抗氧化饮料以及姜黄素、ω-3 多不饱和脂肪酸、类胡萝卜素和精油的纳米包埋）、植物基乳制品类似物、减脂配方以及烘焙或糖果馅料4。
尽管鹰嘴豆蛋白（CP）的乳化功能已有广泛报道5，但通过干法提取途径获得的纳米乳化体系却相对受到较少关注，尤其是在食品应用中的可重复性、结构完整性和可扩展性方面。与需要大量调节pH、离心和溶剂去除的传统湿法提取工艺不同，气流分选技术可在常温条件下实现快速的蛋白质富集，且无需使用水、化学品或过度的热处理3。因此，干法提取相较于湿法提取具有显著优势，能够在保持蛋白质功能的同时，降低环境负担和加工复杂性3,6。
然而，当前食品胶体研究中的一个关键未满足需求是，对干法提取如何改变蛋白质结构和热行为，以及这些变化如何影响纳米乳化性能和胶体稳定性的清晰机制性理解。特别是，需要系统评估涉及分子结构、界面活性和起泡行为的结构-功能关系，以推动基于CPC的食品胶体系统的应用7。
本研究的创新之处在于，展示了利用干法空气分级分离的酪蛋白酸钠（CPC）作为一种可重复、无溶剂的纳米乳化剂的应用，并将其组分富集程度与结构、热学及界面功能特性直接关联。因此，本研究旨在通过系统地将干法空气分级获得的CPC的组分富集与其结构、热学和界面性质相联系，证明其可作为有效的纳米乳化剂。研究特别强调对理化特性、起泡能力与稳定性以及X射线衍射（XRD）的分析，以阐明调控纳米乳液（NE）形成与稳定性的结构-功能关系。
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方案
样品制备
从鹰嘴豆粉（CF）中分离蛋白质
卡布里鹰嘴豆（Cicer arietinum L.），采收于2025年生长季，来源为中国东南部Türkiye地区，采用基于冲击的气流分级研磨系统进行加工，其中颗粒受到离心力作用，并反复与研磨盘和环形齿轮发生碰撞。经过初步预研磨后，粗颗粒进一步通过气流分级磨粉机研磨，制得鹰嘴豆粉（CF）。在冲击研磨过程中，气流速度为40–45 m3/h，分级轮转速为7,000–8,000 rpm，进料速率为200 kg/h，操作条件依据文献中已报道的运行参数及实验室内部优化方案8。
随后在室温下使用相同的气流分级系统，通过气流分级从鹰嘴豆粉（CF）中获得富含蛋白质的细粉组分。分级轮转速设定为 10,000 rpm，进料速率维持在约 200 kg/h，气流速率为 52 m³/h，具体操作如前所述8。该分离步骤基于颗粒的粒径、密度和空气动力学性质的差异，实现了蛋白质组分的选择性富集。
经过气流分级后，所得粉末表现出较细的粒径分布（d(0.9) = 20–22 µm）；因此未进行筛分步骤，以避免物料损失和不必要的机械应力。蛋白质富集组分直接分装于充氮聚乙烯袋（25 kg）中，并在 4 °C 下储存，以最大限度减少水分吸收并保持其功能特性，直至进一步加工处理。
纳米乳液的制备
以 CPC 作为唯一的乳化剂，制备目标终浓度为 3.0% w/v 活性蛋白的水包油（O/W）纳米乳液（NE）。该浓度的选择基于对 1.0% w/v、2.0% w/v 和 3.0% w/v CPC 的初步筛选结果，表明 3.0% w/v 能实现最显著的液滴尺寸减小以及最高的短期物理稳定性。根据 CPC 粉末实测的蛋白含量（44.8% w/w），计算得出所需粉末浓度为 6.67% w/v。CPC 作为连续水相中的乳化剂，而中链甘油三酯（MCT）油则以 5.0% v/v 的固定浓度单独用作分散油相，相当于每 100 mL 配方中含 5.0 mL 油。所有配方中均未使用任何小分子表面活性剂9。
通过在800 rpm的连续磁力搅拌下，将计算量的CPC粉末溶于超纯水中1800秒，制备CPC水相分散液，以确保蛋白质充分水合和均匀分散。通过观察无可见颗粒或沉淀确认水合完全。
然后在持续搅拌下将油相缓慢加入水合的 CPC 溶液中，随后在 12,000 rpm 条件下进行 240 秒的高剪切均质化，形成粗乳液（常规乳液），其外观均匀不透明，无可见油相分离，可肉眼识别。选择这些条件是为了避免蛋白质聚集，同时确保充分的液滴破碎。
随后通过探头超声法对粗乳液进行处理，超声条件为30%的振幅下持续180秒，并在冰水浴中进行以保持样品温度低于30 °C，防止蛋白质聚集。超声过程中间歇监测温度。初步优化实验（数据未显示）评估了60秒、120秒和180秒的超声时间，最终选择180秒作为最佳条件，因其可重复形成粒径小于200 nm且多分散系数（PDI）较低的纳米乳液（NEs）。因此，本研究中报道的所有纳米乳液均采用180秒的优化超声时间制备。
稳定的微乳液形成表现为静置1,800秒后形成稳定、略带乳光的分散体系，且无相分离现象。出现明显分层或相分离的样品被排除在进一步分析之外。所有样品在进行理化表征前均平衡至室温（25 ± 2 °C）9。
警告：高能设备（均质机和超声波破碎仪）的操作均按照机构实验室安全规程进行。超声处理过程中使用了听力保护装置和防溅屏蔽装置。乳液制备过程中未使用任何酸或碱，因此无需进行化学中和或危险废物处理。
鹰嘴豆粉（CF）与鹰嘴豆蛋白浓缩物（CPC）的营养与理化特性表征
组成分析
采用美国官方分析化学家协会（AOAC）的官方分析方法测定CF和CPC样品的营养组成。粗纤维含量依据AOAC 991.43方法测定，总灰分依据AOAC 923.03，粗脂肪依据AOAC 920.39，粗蛋白依据AOAC 984.13，氮-蛋白换算系数采用N × 6.25。所有样品的总碳水化合物含量通过差值法计算，即从100%中减去水分、蛋白质、脂肪和灰分百分比之和3。
颜色分析
采用台式测色仪在反射模式下测定样品的颜色参数。测量前，使用制造商提供的黑白校准标准对仪器进行标准化校正。为确保测量结果的均匀性和可重复性，将 5.0 g 粉末样品轻轻装入圆形玻璃比色皿（内径 64.0 mm）中，形成平整均匀的表面。施加足够厚度的样品层（≥ 50.0 mm），以最大限度减少基底和背景效应的影响，并在反射条件下使半透明粉末呈现有效不透明状态。所有测量均在室温下以反射模式进行。
颜色坐标以CIELAB颜色空间表示，其中L*代表明度（0 = 黑色，100 = 白色），a*代表红绿轴，b*代表黄蓝轴。其他颜色参数，包括总色差（ΔE*）、色度（C*）、色调角（H°）和色度指数（CI），根据文献11中描述的公式（公式1–4）计算如下：
(公式 1)
（方程 2）
（方程 3）
（公式 4）
pH 分析
使用配备玻璃电极的数字pH计测定CF和CPC样品的pH值，将电极直接插入样品分散液中，在25.0 ± 2.0 °C条件下进行测量。测量前，采用标准缓冲溶液（pH 4.0和7.0）对pH计进行校准。所有测量均重复三次（n = 3），以确保分析结果的可重复性。
水分含量
在受控加热条件下，使用快速水分分析仪测定 CF 和 CPC 样品的残留水分含量。所有测定均进行三次重复（n = 3），以确保分析结果的可重复性。
Structural and functional characterization of CPC
XRD analysis
采用配备 Cu-Kα 辐射源（λ = 1.5406 Å）的实验室 X 射线衍射仪对 CPC 进行 XRD 分析。衍射图谱在 2θ 范围为 10°-90° 内以 2.5° min⁻¹ 的扫描速率记录。-1在40 mA电流和45 kV电压下运行，遵循先前报道的实验步骤。12.
使用标准XRD分析软件进行峰识别、背景扣除和曲线拟合。结晶度按文献13所述方法计算，即结晶反射峰的积分面积与衍射图谱总面积之比，如公式(5)所示：
（公式 5）
采用谢乐公式（方程6）对最强衍射峰进行分析，根据XRD数据估算表观结晶粒尺寸（D）：
（公式 6）
其中 D 为表观晶粒尺寸（nm），K 为形状因子（取 0.9），λ 为 X 射线波长，β 为所选衍射峰的半高宽（FWHM，单位为弧度），θ 为布拉格角。
差示扫描量热法（DSC）分析
采用实验室差示扫描量热仪对鹰嘴豆粉（CF）和鹰嘴豆蛋白浓缩物（CPC）进行差示扫描量热法（DSC）分析。准确称取约10.0 ± 0.1 mg样品，密封于带穿孔盖的凹形铝坩埚中，以空铝坩埚作为参比。测试在氮气氛围（20 mL/min）下进行，以减少氧化效应。样品从 0 °C 至 400 °C 以恒定的加热速率 5 °C 分钟-1 在动态扫描条件下进行。分析前完成温度和灵敏度校准，以确保测量的准确性和可重复性。
通过测定每种转变的起始温度（To）、峰值温度（Tp）、终止温度（Te）以及相应的焓变（ΔH）来表征热转变特性。此外，根据公式（7）和（8）分别计算吸热峰宽度（EPW）和峰高指数（PHI）：
EPW = (Te − Tp) （公式 7）
PHI =ΔH/(Tp− To) (Eq. 8)
起泡能力（FC）与泡沫稳定性（FS）
在 pH 7.0 条件下测定 CPC 水分散液（3.0 g/L）的起泡能力（FC）和泡沫稳定性（FS），必要时使用 0.1 N 盐酸（HCl）调节 pH。取 30 mL 蛋白质分散液加入 50 mL 聚丙烯离心管中，采用高速匀浆机在 11,000 rpm 条件下匀浆 120 秒以生成泡沫。匀浆后通过样品体积迅速增加以及立即形成稳定的泡沫层，可直观确认泡沫的形成。
起泡能力（FC）通过均质后体积的百分比增加量来计算，而泡沫稳定性（FS）则根据均质后 600 秒、1,800 秒、3,600 秒和 7,200 秒时保留的泡沫体积来确定。所有测量均重复三次（n = 3），FC 和 FS 值分别根据公式（9）和公式（10）计算14：
（公式 9）
(公式 10)
注意：稀盐酸的操作需遵循适当的实验室安全规范，包括佩戴手套和眼部防护装备。废液应按照机构的化学品安全指南进行处理。
鹰嘴豆蛋白浓缩物（CPC）及基于CPC的纳米乳液的理化稳定性
平均粒径与粒径分布
采用动态光散射法（DLS）测定样品的粒径分布和Z-平均流体动力学直径。记录Z-平均流体动力学直径和多分散性指数（PDI），分别用于表征乳滴的平均尺寸及粒径分布的均匀性15,16。
测量前，将样品与蒸馏水按 1:100 (v/v) 的比例稀释，以尽量减少多重散射效应，确保光散射测量的可靠性。所有分析均在 25 ± 2 °C 的受控温度下进行。PDI 用作液滴尺寸分布均匀性的指标，较低的 PDI 值对应于更窄的尺寸分布。测量在制备当天（新鲜制备的纳米乳）和储存 7 天后进行，以评估纳米乳体系的短期物理稳定性。16在测量前出现明显分层、沉淀或相分离的样品被排除在动态光散射分析之外。
颗粒的ζ电位
采用电泳光散射法（ELS）测定样品的ζ电位，以评估乳滴的净表面电荷及静电稳定性，实验方法参照先前报道的方案15,16。测量在25.0 ± 2 °C的恒定温度下进行，使用未稀释的样品以保持纳米乳液原有的离子环境。
为评估乳液的静电相互作用和胶体稳定性，计算了各样品的平均ζ-电位值及其相应的标准偏差。所有测量均以水作为分散剂进行，遵循已建立的
内部标准操作规程15。在进行ζ电位测量前，若样品已出现可见的相分离或分层现象，则将其排除在检测之外。
方法验证与预期结果
通过评估关键的理化参数（包括Z-平均流体动力学直径、PDI、ζ-电位以及在胁迫条件下的物理稳定性）完成方法验证。成功实施该方案的标志是可重复地形成粒径小于200 nm、PDI ≤0.30的纳米乳液（NE）。为进一步验证其稳定性而不仅限于常规储存测试，还进行了在4,000 rpm下离心900秒的胁迫试验。离心后未观察到明显的相分离或奶油化现象，同时在7天储存期间ζ-电位和pH值保持稳定，这些结果共同证明了CPC具有较强的乳化能力，以及所提出方案的可重复性。
统计分析
成分和功能测定均进行三次重复实验（n=3），而结构分析（XRD 和 DSC）则进行单次测量，代表性的运行结果。数据以平均值 ± 标准偏差（SD）表示。采用 SPSS 软件进行单因素方差分析（ANOVA）进行统计评估。在所有分析中，以 p 值 < 0.05 作为具有统计学显著性的标准。当发现存在显著差异时，采用 Tukey 诚实显著性差异（HSD）事后检验进行多重比较。表格和图中所示的统计标记字母（如 a、b、c）来源于 Tukey HSD 检验结果；均值间若共享相同字母，则表示在 5% 显著性水平上无显著差异。
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结果
CF 和 CPC 的营养与理化特性表征
组成参数
CF 和 CPC 的组成参数总结于表 1中。CPC 含有 44.8% 的蛋白质、5.8% 的粗脂肪和 45.9% 的总碳水化合物，表明经过干法分级处理后，其蛋白质含量相对于 CF 显著提高。CPC 中蛋白质含量的增加证实了气流分选在富集蛋白质组分方面的有效性。本研究获得的蛋白质水平处于文献报道的 CPC 蛋白质含量范围（40%–55%）之内，表明所制备的 CPC 在组成上与先前报道的 CPC 材料具有可比性。
除了其成分上的优势外，CPC还表现出重要的技术功能特性，包括溶解性、持水能力、持油能力以及界面活性。这些特性对于分散体系的形成与稳定具有重要的功能意义。基于这些特性，CPC能够形成粒径小于200 nm的纳米乳液（表5），证明其作为植物来源乳化成分的有效性能。
颜色分析
经过气流分级后，CF 和 CP...
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讨论
本研究通过气流分级法获得浓缩豌豆蛋白（CPC），并对其组成、功能、结构和胶体特性进行了表征，特别关注其作为植物源性纳米乳化剂的应用。与冷榨粉（CF）相比，气流分级等非热加工方法可显著提高蛋白质含量，所得CPC的蛋白质含量达44.8%3。相较于文献中主要通过湿法提取制备的CPC，本研究拓展了现有认知，证明了在特定加工条件下，采用干燥的气流分级工艺可获得富含蛋白质的组分，该组分能够支持纳米乳液（NE）的形成并维持短期的理化稳定性。这与以往研究形成对比，后者通常依赖pH调节、溶剂/化学试剂添加以及复杂的水相处理步骤来制备用于乳化应用的蛋白质分离物17,18,19。本研究结合组成分析、界面功能特性（起泡性）以及胶体表征（Z均粒径、多分散系数PDI、ζ-电位及25 °C下储存7天），提供了一套综合数据集，将干法分级的结果与纳米乳液性能关联起来。因此，本研究提出，干法气流分级是一种无需溶剂且能保持功能特性的方法，可用...
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披露
作者声明，在本文件所报告的工作中，不存在已知的可能影响研究的财务利益冲突或个人关系。
致谢
作者衷心感谢Bekir Çakıcı先生（SFA Ar-Ge Sağlık Hizmetleri）在纳米乳液配制和ζ电位分析方面提供的技术支持。诚挚感谢Rüya Kandemir女士（Çukurova大学CUMERLAB分析中心）在X射线衍射（XRD）分析中给予的协助。作者还感谢Dervişoğlu Bakliyat A.Ş.公司为本研究中开展的各项分析提供了蛋白质试验样品及实验室设施的使用支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 50 mL 锥形管 | Corning | 352070 | 聚丙烯离心管 |
| 气流分级磨 |  | CSM1250 | 用于蛋白质分级的气流分级磨 |
| 分析天平 | Sartorius | BCE224I-IS | 分析天平（最大称量 120 g） |
| 自动移液器 | Brand | 3123000055 | 可调移液器（200 μL、1 mL、5 mL） |
| 离心机 | Eppendorf | 5810R | 制冷离心机 |
| 鹰嘴豆样品 | | — | 食品级鹰嘴豆 |
| 色差仪 | HunterLab | A60-1014-593 | 用于颜色分析的仪器 |
| 差示扫描量热仪 | NETZSCH | — | DSC 分析 |
| 数字温度计 | Hanna Instruments | HI-98501 | 温度监测 |
| 磷酸氢二钾（Na2HPO4） | Sigma-Aldrich | S7907 | 分析纯 |
| 脂肪分析仪 | C. Gerhardt GmbH & Co. KG | 13-0005 | 基于索氏提取法的脂肪分析 |
| 高速均质机 | VELP | SA20900010 | 粗乳液的均质化 |
| 盐酸（HCl） | Sigma-Aldrich | 320331 | 分析纯 |
| 盐酸溶液（0.1 N） | Sigma-Aldrich | H1758 | 调节 pH |
| 凯氏定氮催化剂片 | C. Gerhardt GmbH & Co. KG | 12-0328 | 凯氏定氮分析 |
| 磁力搅拌器 | IKA | 3339000 | 样品混合与水合 |
| 中链甘油三酯油 | Ataman Kimya A. | https://www.atamanchemicals.com /medium-chain-triglycerides-mct _u30009/?lang=TR#:~:text =Orta%20zincirli%20trigliseritler %20(MCT)%2C%20hindistance vizi%20ve%20hurma%20%C3 %A7ekirde%C4%9Fi%20ya%C 4%9Flar%C4%B1nda,g%C3%B Cne%C5%9F%20kremleri%20i% C3%A7in%20%C4%B1slat%C4% B1c%C4%B1%20ajand%C4%B1r. | 食品和药用级油 |
| 水分分析仪 | Mettler Toledo | HC103 | 水分测定 |
| 粒径与Zeta电位分析仪 | Malvern Instruments | ZEN3600 | 动态光散射与电泳迁移率 |
| pH计 | Mettler Toledo | MET-30671567 | pH测量 |
| 塑料离心管 | ISOLAB | 078.02.003 | 一次性塑料管 |
| 猪胃蛋白酶 | Sigma-Aldrich | P7012 | 酶（1:10,000） |
| 磷酸二氢钾（KH2PO4） | Sigma-Aldrich | P5379 | 分析纯 |
| 探头式超声波破碎仪 | Bandelin | — | 乳液超声处理 |
| 防护眼镜 | Baymax | BX-2500 | 实验室安全设备 |
| 蛋白质分析仪 | C. Gerhardt GmbH & Co. KG | 12-0520 | 蛋白质测定 |
| 蛋白质消化系统 | C. Gerhardt GmbH & Co. KG | 12-0700 | 凯氏消化装置 |
| 氯化钠（NaCl） | Sigma-Aldrich | S9625 | 分析纯 |
| 氢氧化钠（NaOH） | Sigma-Aldrich | S5881 | 分析纯 |
| 刮勺 | — | https://www.blabmarket.com/ meta-etiket/plastik-spatul?srsltid =AfmBOoqsvXR_3rQgU1n8QBn DyR_P9D52v2Hahy27RLOH7Zg VbFzzcbsb | 塑料刮勺 |
| 超纯水系统 | ELGA Labwater | PC110COBPM1 | 水电阻率 18.2 MΩ·cm |
| 容量瓶 | Schott Duran | 2120117 | 100 mL 容量瓶 |
| 水浴锅 | Memmert | WTB24 | 温度控制（20–25 °C） |
| X射线衍射仪（Cu–Kα） | PANalytical | STEM-LE-0294-LC | XRD 分析（45 kV，40 mA） |
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