基于空气分类的干分馏对鹰嘴豆蛋白浓缩液在纳米乳剂应用中的结构、热和功能性质的影响

Summary

干萃鹰嘴豆蛋白浓缩液表现出高蛋白含量、强烈的起泡特性，并在3.0%的w/v浓度下有效稳定纳米乳剂。结构和热分析显示其组织为非晶优势，残留结晶性低且分子灵活性增强，支持其作为可持续植物基功能性食品胶体系统成分的适用性。

Abstract

鹰嘴豆蛋白浓缩液（CPC）通过干式提取方法获得，并系统地从其组成、功能和结构特性上进行表征，以评估其在纳米乳剂（NE）应用中的适用性。干提取的CPC蛋白质含量为44.8%，表现出优异的功能性能，包括61.1%的起泡能力和94.7%的高泡沫稳定性，体现了高效的界面吸附和胶片形成。采用3.0% w/v CPC作为乳化剂制备的NE配方显著减少了液滴尺寸，获得Z平均液滴直径152.7 nm，低多分散指数（0.30），表明液滴尺寸分布细小且相对均匀，且胶体动力学稳定。鹰嘴豆粉（CF）和CPC的比较差扫描量热法（DSC）分析揭示了两种主要的吸热转变。虽然两样品在68.4°C的低温转变中表现出相似的结合水释放，但CPC的焓变化显著较低，表明干提取后天然分子秩序部分被破坏。用于NE系统的CPC的X射线衍射（XRD）轮廓显示出10°-30°2θ范围内的宽广非晶晕，间或有有限的低强度锐利反射。这些发现证实了该精矿具有部分结晶区域的非晶显性结构，整体晶体度估计约为15%。本研究描述了一种可重复且无溶剂的方案，用于利用干空气分类CPC生产油中水NEs，适用于教学用途及潜在工业规模化。

Introduction

豆类来源蛋白作为结构稳定食品乳剂设计的多功能成分，已受到广泛关注。在这些来源中，鹰嘴豆（Cicer arietinum）尤为突出，因其全球产量高（全球第三大广泛种植的豆科作物）、高蛋白含量（18%-24%）、低过敏性以及均衡的必需氨基酸组合^1,2。通常，蛋白质分离株含有较高的蛋白质浓度（80%-90%），因为它们经过额外加工以去除碳水化合物和脂肪，而CPC（50%−75%蛋白质）则保留纤维和其他必需营养素³。这些营养和农学优势凸显了鹰嘴豆蛋白作为传统植物和动物蛋白乳化剂的可行替代品。尽管使用广泛，但用传统低分子界面活性剂稳定的乳剂^在热力学上通常仍不稳定，且在储存过程中容易发生聚合、絮凝和相分离。相比之下，液滴直径通常低于200 nm的NE表现出更高的动力学稳定性，更好地保护包裹的生物活性化合物，并在水溶液系中具有更高的扩散性。因此，NE技术已成为开发具有控制释放和提高疏水成分生物利用度的功能性食品的有效^策略。

一项最新研究报告称，CPC在形成NE方面表现出有利的界面和功能特性，包括强的水结合能力、显著的泡沫性能以及稳定油水界面的能力。CPC也因其乳化稳定性和清洁标签的吸引力，被评估为蛋黄在蛋黄类乳剂中的潜在^替代品。除了这些模型系统外，鹰嘴豆蛋白基纳米乳化剂在多种食品基质中具有潜在应用，包括饮料（浑浊饮料、蛋白水、抗氧化饮料以及姜黄素、欧米伽-3脂肪酸、类胡萝卜素和精油的纳米封装）、植物性乳制品、减脂配方以及烘焙或糖果馅^料。

尽管鹰嘴豆蛋白（CP）的乳化功能^{已被广泛报道}，但源自干萃取途径的纳米乳化系统在重复性、结构完整性和食品应用的可扩展性方面，关注相对有限。与传统的湿式提取方案需要大量调整pH值、离心和溶剂去除不同，空气分类能够在环境条件下快速富集蛋白质，无需使用水、化学品或^{过度热处理}3。因此，干法相较于湿法具有明显优势，既保留蛋白质功能，又减少环境负担^{和加工复杂}性 ^3,6。

然而，当前食品胶体研究中一个关键未被满足的需求是明确理解干萃取如何改变蛋白质结构和热行为，以及这些变化如何转化为纳米乳化性能和胶体稳定性。特别是，需要系统评估涉及分子组织、界面活性和泡沫行为的结构-功能关系，以推动基于CPC的食物^{胶体系统的}应用。

本研究的新颖之处在于展示了将经干空气分类的CPC作为可重复、无溶剂的纳米乳化剂，同时直接关联其成分富集与结构、热及界面功能。因此，本研究旨在证明通过干空气分类获得的CPC能够作为有效的纳米乳化剂，系统地将成分富集与其结构、热及界面特性联系起来。特别强调物理化学特性、起泡能力与稳定性，以及XRD分析，以阐明决定NE形成与稳定性的结构-功能关系。

Protocol

样品制备
鹰嘴豆粉（CF）中的蛋白质分离
2025年种植季节采收的喀布尔鹰嘴豆（Cicer arietinum L.）来自土耳其东南部，采用基于冲击的空气分级机碾磨系统加工，颗粒在离心力下反复冲击研磨盘和环齿轮。在初步的预铣削步骤后，粗粒通过空气分级机进一步研磨以制备CF。在冲击铣削过程中，采用了40-45米^/小时的气流率，分级机转速为7,000-8,000转/分钟，进给速率为200千克/小时，符合先前报告的作条件和内部优化协议，详见文献⁸。

随后，通过在环境温度下对CF进行空气分类，使用相同的空气分类系统，从CF中获得了富含蛋白质的细小分数。分级轮转速设定为10,000转/分钟，进给速率保持在约200公斤/小时，气流量为52立方米/小时，如^前所述8。这一分离步骤根据颗粒大小、密度和空气动力学特性的差异选择性富集蛋白质分馏。

经过空气分类后，所得粉末颗粒粒径分布细小（d（0.9） = 20-22微米）;因此，没有进行筛分步骤以避免材料损失和不必要的机械应力。富含蛋白质的组分直接装入25公斤气体冲洗聚乙烯袋中，并以4°C储存，以减少水分吸收并保持功能性，直到进一步加工。

纳米乳剂制备
CPC作为唯一乳化剂用于制备油中水（O/W）溶化物，最终配方中靶向活性蛋白浓度为3.0% w/v。该浓度基于初步筛查的1.0% w/v、2.0% w/v和3.0% w/v CPC结果，表明3.0%能最有效地减少液滴大小，且具有最高的短期物理稳定性。根据测得的CPC粉末蛋白质含量（44.8% w/w），所需粉末浓度为6.67% w/v。CPC作为连续水相中的乳化剂，而中链甘油三酯（MCT）油则专门作为分散油相，浓度为5.0% v/v，相当于每100毫升配方中5.0毫升油。在任何配方中均未使用低分子量界面活性^剂9。

水性CPC分散液是通过将计算出的CPC粉末溶解在超纯水中，并在800转/分钟连续磁搅拌1800秒下制备，以确保完全水化和蛋白质均匀分散。完全水化通过无可见颗粒或沉积物得到证实。

油相随后在连续搅拌下缓慢加入水合CPC溶液中，随后以12,000转/分钟高剪切均质化240秒，产生粗糙（传统）乳液，外观均匀不透明，无可见油脂分离。这些条件的选择是为了避免蛋白质聚集，同时确保足够的液滴破坏。

随后通过探针超声波对粗乳液进行30%振幅，持续180秒，在冰水浴中进行，以保持样品温度低于30°C并防止蛋白质聚集，获得NEs。超声波检测期间会间歇性监测温度。初步优化实验（未显示数据）评估了60秒、120秒和180秒的超声处理时间，基于液滴直径低于200纳米且PDI较低的可重复生成的噪声化时间，选定了180秒作为最优条件。因此，本研究中报告的所有NE均采用了优化的180秒超声处理时间制备。

成功的北极形成得益于稳定且略带乳白色的色散，且在静止1800秒后无相分离。排除了明显乳化或相分离的样品。所有样品均在进行物理化学表征前平衡至室温（25±2°^C）。

注意：高能设备（均质器和超声器）的作遵循机构实验室安全程序。超声波检测时使用了听力保护和防溅屏蔽。乳剂制备过程中未使用酸碱;因此，无需进行化学中和或危险废物处置步骤。

鹰嘴豆粉（CF）和鹰嘴豆蛋白浓缩物（CPC）的营养和物理化学特性分析
组成分析
CF和CPC样本的营养成分是通过官方分析化学家协会（AOAC）官方分析方法确定的。粗纤维分析依据AOAC 991.43，总灰分分析，粗脂肪分析920.39，粗蛋白分析，氮转蛋白因子为N × 6.25。所有样品的总碳水化合物含量是通过差值减去水分、蛋白质、脂肪和灰分百分比的总和，从100^%中得出。

色彩分析
样品的色彩参数是用工作台式比色计在反射模式下测量的。测量前，仪器采用制造商提供的黑白校准标准进行标准化。为确保测量均匀且可重复，5.0克粉末样品轻轻装入内径64.0毫米的圆形玻璃凸锥中，以形成光滑均匀的表面。施加了足够厚的层（≥50.0毫米），以最大限度减少基材和背景效应的影响，并在反射条件下使半透明粉末有效不透明。所有测量均在室温下以反射模式进行。

色彩坐标在CIELAB色彩空间中表示，其中L*代表明度（0=黑色，100=白色），a*代表红绿轴，b*代表黄蓝轴。额外的色彩参数，包括总色彩差（ΔE*）、色差（C*）、色相角（H°）和色指数（CI），根据¹¹ （方程1–4）中描述的方程计算如下：

（式1）

（方程2）

（方程3）

（式4）

pH分析
CF和CPC样品的pH值通过配备玻璃电极的数字pH计，将电极直接插入样品色散区，温度为25.0 ± 2.0°C。 测量前，pH计使用标准缓冲液（pH 4.0和7.0）进行校准。所有测量均以三倍（n=3）进行，以确保分析可重复性。

含水量
CF和CPC样品的残留含水量通过在受控加热条件下作的快速湿度分析仪测定。所有测量均以三倍（n=3）进行，以确保分析可重复性。

CPC的结构与功能表征
XRD分析
CPC的XRD分析使用配备Cu-Kα辐射的实验室X射线衍射仪（λ = 1.5406 Å）进行。绕射图记录在2θ范围内10°-90°，扫描速率为2.5°分^-1，工作电压为40毫安和45千伏，遵循先前报道的程序¹²。

峰值识别、背景减法和曲线拟合均使用标准XRD分析软件完成。结晶度是根据¹³描述的方法计算的，如方程（5）所示，计算为晶体反射积分面积与绕射图下总面积的比值：

（式5）

通过X445555年，利用谢勒方程（式6）对最强衍射峰施加，从XRD数据估算表观晶粒尺寸（D）：

（式6）

其中D是表观晶粒尺寸（nm），K是形状因子（假设为0.9），λ是X射线波长，β是选定衍射峰的半高处全宽（FWHM，单位为弧度），θ是布拉格角。

差分扫描量热法（DSC）分析
使用实验室差分扫描量热计对CF和CPC进行了差分扫描量热分析（DSC）。大约10.0±0.1毫克样品被精确称重并密封在带穿孔盖的凹铝坩埚中，参考则使用空铝坩埚。测量在氮气气氛（20 mL/min）下进行，以最大限度减少氧化效应。样品在动态扫描条件下以恒定的5°C微^一加热速率，从0°C加热到400°C。分析前进行了温度和灵敏度校准，以确保测量准确性和可重复性。

热转变通过确定起始温度（T_o）、峰值温度（T_p）、终点温度（T_e）以及与每个转变相关的焓变化（ΔH）来表征。此外，吸热峰宽度（EPW）和峰值高度指数（PHI）也根据方程计算。（7）和（8），分别是：

EPW= （Te−Tp）（方程7）

PHI =ΔH/（Tp− To）（式8）

起泡能力（FC）和稳定性（FS）
CPC水溶液散布液（3.0 g/L）的起泡能力（FC）和泡沫稳定性（FS）在pH 7.0下进行评估，并根据需要使用0.1 N盐酸（HCl）进行调整。将30毫升蛋白质分散转移到50毫升聚丙烯离心管中，并用高速均质器在11,000转/分钟运行120秒后均质化，生成泡沫。通过样品体积迅速增加以及均质后立即形成稳定泡沫层，视觉确认了泡沫形成。

FC计算为均质化后体积的百分比增加，FS则基于600秒、1800秒、3600秒和7200秒后的保留泡沫体积计算。所有测量均以三倍法（n = 3）进行，FC和FS值均根据方程计算。（9）和方程。（10），分别^为14：

（等式9）

（等式10）

注意：稀盐酸处理时采用了适当的实验室安全措施，包括手套和护目镜。废弃物溶液的处理方式遵循机构化学品安全指南。

CPC及其基于CPC的自然型核的物理化学稳定性
平均颗粒大小及颗粒尺寸分布
通过动态光散射（DLS）测定样品的颗粒尺寸分布和Z平均流体动力学直径。记录了Z平均水动力学直径和多分散指数（PDI），分别用于表征液滴的平均大小和尺寸分布的均匀性，^15,16。

测量前，样品被以1：100（v/v）的比例稀释，以最小化多重散射效应并确保光散射测量的可靠性。分析在25±2°C的受控温度下进行。 PDI被用作液滴粒粒径分布均匀性的指标，粒径分布越小，PDI值越低。测量分别在第0天（新制备的NEs）及7天储存后进行，以^评估NE系统的短期物理稳定性。在测量前出现明显的乳化、沉降或相分离的样品被排除在DLS分析之外。

粒子的ζ势
通过电泳光散射（ELS）方法^15,16，测定样品的净表面电荷和静电稳定性，以评估样品的ζ电势。测量在25.0±2°C的受控温度下进行，使用未稀释样品以保存NE的原始离子环境。

计算了每个样品的平均ζ电势值和相应的标准差，以评估乳剂的静电相互作用和胶体稳定性。所有测量均使用水作为分散剂，符合既定的

内部标准作程序¹⁵.分析前显示可见相分离或变形的样本被排除在电位测量ζ之外。

方法验证与预期结果
方法验证通过评估关键物理化学参数实现，包括Z平均流体动力直径、PDI、ζ势和应力下的物理稳定性。协议的成功执行得益于液滴尺寸小于200 nm的可重复生成NE和PDI≤0.30。为了进一步验证稳定性，进行了4000转/分钟的离心应力测试，持续900秒。离心后无明显相分离或乳化现象，加上7天储存期间ζ电位和pH曲线一致，共同支持CPC的强健乳化能力及拟议方案的可重复性。

统计分析
成分和功能测量以三倍（n=3）进行，结构分析（XRD和DSC）则作为单次测量、代表性运行进行。结果以标准差（SD）±均值表示。统计评估采用SPSS软件中的单向方差分析（ANOVA）进行。所有分析中，p值<0.05被视为统计显著性。在发现显著差异的情况下，采用Tukey的诚实显著差异（HSD）事后检验进行多重比较。表格和图表中出现的统计连接字母（如a、b、c）均来自Tukey HSD检测结果;意味着共享同一字母在5%显著水平上并无显著差异。

Results

CF和CPC的营养和物理化学特性
组成参数
CF和CPC的组成参数总结于 表1。CPC含有44.8%蛋白质、5.8%粗脂肪和45.9%总碳水化合物，显示出干分过程使蛋白质相较于CF有显著富集。CPC中观察到的蛋白质含量增加，证实了空气分类在浓缩富蛋白组分中的有效性。本研究中获得的蛋白质水平位于CPC报告的40%-55%范围内，表明其产生的CPC在成分上与此前报道的CPC材料相当。

除了成分富集外，CPC还表现出相关的技术功能特性，包括溶解性、持水能力、持油能力和界面活性。这些特性对于分散系统的形成和稳定具有功能性重要性。基于这些特性，CPC使液滴尺寸小于200纳米的霓元素（NEs）得以形成（见表5），支持其作为植物基乳化成分的性能。

色彩分析
空气分类后，CF和CPC的颜色参数有显著差异（

Discussion

本研究通过空气分类获得CPC，并从其组成、功能性、结构性质和胶体特性进行表征，特别关注其作为植物基纳米乳化剂的应用。非热成像方法，如空气分类，蛋白质含量相对于CF可显著富集，CPC蛋白含量为^44.8%3。与文献中主要基于湿法提取的CPC相比，本研究通过证明干式空气分类路径可以获得支持NE形成和在特定加工条件下短期物理化稳定性的蛋白质富集分段，进一步扩展了现有知识。这与以往依赖pH变化、溶剂/化学输入以及大量水溶液处理步骤获得乳化应用蛋白分离物的研究不同（^见17,18,19）。通过结合成分分析与界面功能性（起泡）和胶体表征（Z平均值、PDI、ζ电位及25°C下7天储存），本研究提供了一个将干分离结果与NE性能联系起来的综合数据集。因此，本研究提出将干空气分类作为一种无溶剂且保全功能的方法，以获得具有足够界面活性的CPC以稳定NE。

...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50毫升锥形管	科宁	352070	聚丙烯离心管
空气分级机		CSM1250	用于蛋白质分馏的空气分级机
分析平衡	萨托里乌斯	BCE224I-IS的	分析天平（最大承重120克）
自动移液器	品牌	3123000055	可调节移液器（200 & mu;L，1 mL，5 mL）
离心机	埃彭多夫	5810R	冷藏离心机
鹰嘴豆样品		—	食品级鹰嘴豆
比色计	猎人实验室	A60-1014-593	色彩分析仪器
差分扫描量能计	内茨施	—	DSC分析
数字温度计	汉纳乐器	HI-98501	温度监测
磷酸二钾（Na2HPO<>4）	西格玛-奥尔德里奇	S7907	分析等级
脂肪分析仪	C. Gerhardt 有限公司及KG连	13-0005	基于索克斯莱特的脂肪分析
高速均质器	维尔普	SA20900010	粗乳剂的均质化
盐酸（HCl）	西格玛-奥尔德里奇	320331	分析等级
盐酸溶液（0.1 N）	西格玛-奥尔德里奇	H1758	pH调节
Kjeldahl 催化剂片	C. Gerhardt 有限公司及KG连	12-0328	Kjeldahl 分析
磁力搅拌器	伊卡	3339000	样品混合与水化
中链甘油	Ataman Kimya A.	https://www.atamanchemicals.com /中链甘油三酯-mct _u30009/？ lang=TR#：~：text =Orta%20zincirli%20trigliseritler %20（MCT）%2C%20hindistance vizi%20ve%20hurma%20%C3 %A7ekirde%C4%9Fi%20ya%C 4%9Flar%C4%B1nda，g%C3%B Cne%C5%9F%20kremleri%20i% C3%A7in%20%C4%B1slat%C4% B1c%C4%B1%20ajand%C4%B1r.	食品和药品级机油
湿度分析仪	梅特勒·托莱多	HC103	湿度测定
颗粒尺寸与ζ势分析仪	马尔文仪器	ZEN3600	DLS与电泳迁移率
pH计	梅特勒·托莱多	MET-30671567	pH测量
塑料离心管	隔离实验室	078.02.003	一次性塑料管
猪肉蛋白酶	西格玛-奥尔德里奇	P7012	酶（1：10,000）
磷酸钾（KH2PO4）	西格玛-奥尔德里奇	P5379	分析等级
探头超声波器	班德林	—	乳化超声
防护护目镜	大白	BX-2500	实验室安全设备
蛋白质分析仪	C. Gerhardt 有限公司及KG连	12-0520	蛋白质测定
蛋白质消化系统	C. Gerhardt 有限公司及KG连	12-0700	凯尔达尔消化单元
氯化钠（NaCl）	西格玛-奥尔德里奇	S9625	分析等级
氢氧化钠（NaOH）	西格玛-奥尔德里奇	S5881	分析等级
铲子	—	https://www.blabmarket.com/ meta-etiket/plastik-spatul？srsltid =AfmBOoqsvXR_3rQgU1n8QBn DyR_P9D52v2Hahy27RLOH7Zg VbFzzcbsb	塑料铲
超纯水系统	ELGA实验室沃特	PC110COBPM1	水阻率18.2 MΩ·CM
体积瓶	肖特杜兰	2120117	100毫升容量瓶
水浴	梅默特	WTB24	温度控制（20–25 & deg;C)
X射线衍射仪（Cu–Kα）	潘纳利蒂卡尔	STEM-LE-0294-LC	XRD分析（45 kV，40 mA）