高效分离猪脂肪组织中脂肪来源的干细胞和脂肪细胞

摘要

本文介绍了一种高效分离脂肪来源干细胞和脂肪细胞的标准方法，其特点是处理时间缩短>90%，细胞存活率高且兼容性广泛。

摘要

脂肪来源干细胞（ADSC）因其丰富的种子来源、微创采集、多谱系分化潜力及免疫调节特性，已成为再生医学中理想的种子细胞。其应用涵盖组织修复、疾病建模和细胞治疗;然而，高效分离高可存活性ADSC，对于推动研究和临床转化仍至关重要。传统分离方法，如酶消化结合移液机械解离，受限于处理时间较长（1–3小时）、细胞存活率低（常为<70%）以及批次间差异较大，影响后续实验。

这里，我们介绍了SoniConvert系统（一种基于机械波的细胞分离系统），它结合了机械波和酶消化来解决这些挑战。该系统集成了一个基于微处理器的控制单元，通过数字反馈调节机械波介导的解离，同时还配备了针对脂肪组织优化的组织特异性松动试剂（培养5–15分钟）。该方法能够快速将组织转化为单细胞悬浮液，机械解离可在3–9秒内完成。

该系统有三大优势：（1）超高速处理，核心分离过程——从酶消化到初始细胞分离——约30分钟完成（>比传统方法减少90%）;（2）高存活率，锥蓝染色确认细胞存活率为80–95%，超过传统方案;以及（3）广泛的兼容性，因为所得的单细胞悬浮液满足原级细胞培养、流式细胞培养、细胞毒性分析和脂肪类器官构建的要求。通过缩短处理时间、增强细胞完整性和限制变异性，该系统为脂肪相关研究提供了实用平台。

引言

脂肪来源干细胞（ADSC）是从脂肪组织中分离出的关键间充质干细胞（MSCs）亚群，因其易得性、微创采集、强健的增殖能力、多谱系分化潜力以及强效的副分泌和免疫调节特性，展现出显著的治疗潜力 1,2,3,4 .这些特性使ADSC成为再生医学、组织工程和免疫治疗的有前景候选者。然而，ADSC的转化价值依赖于分离功能完整、高纯度群体的能力——这一过程在技术上仍具挑战性。脂肪组织独特的生物学结构带来了两个主要障碍：（1）脂肪细胞高脂质含量使其在机械加工过程中易破裂，释放游离脂质污染间质血管分数（SVF），从而影响细胞存活率并产生^5,6;以及（2）组织结构复杂性，包括筋膜、内皮细胞、免疫细胞和^{血液成分7}，使脂肪来源细胞的分离变得复杂。这些局限性凸显了对高效、快速且保存生命力方法的紧迫需求，以分离高质量的ADSC和脂肪细胞，这对代谢疾病建模和基于细胞的治疗等下游应用同样至关重要。

目前已有多种成熟方法用于分离脂肪来源细胞，包括酶促消化、外植培养和机械分离^8,9,10。酶消化是最广泛采用的方法，利用胶原酶降解细胞外基质（ECM）成分，释放被包裹的干细胞。该方法通常包括组织剁碎、胶原酶消化（37°C，1–2小时）、通过离心进行SVF分离以及粘附培养纯化。虽然酶促消化对ECM分解有效，但存在显著缺点：处理时间较长（总计3–4小时）、依赖大量样本量，以及酶促细胞毒性或动物来源胶原酶批次间变异的风险——这些都阻碍了临床转化。移植培养利用干细胞从组织片段迁移，产出的细胞存活率保持，但存在低通量和细胞恢复延迟（7–10天）的问题。机械解离依赖物理破坏（如振荡、剪切），虽然能缩短处理时间，但常常会损害细胞完整性，导致存活率下降和杂质群体。这些方法整体未能调和效率、纯度和存活性——这些是临床级细胞分离的关键标准。因此，我们提出了一种结合酶消化与机械波介导解离的新型方法，用于分离脂肪源性细胞（脂肪细胞和ADSC）¹¹。该方法实现了两个关键进展：（1）时间效率：通过将预先优化的无动物酶混合物与低频机械波结合，将总处理时间从3–4小时缩短至~30分钟（见图1）;（2）存活性保持：温和的机械分散可最大限度减少脂肪细胞破裂和脂质释放。重要的是，30分钟时间框架指的是核心分离流程（消化、机械解离、过滤和初次离心），以获得粗脂肪细胞和SVF分数;可选的下游纯化步骤，如红细胞（RBC）裂解，则需要额外的处理时间。

我们优化的脂肪细胞分离方法展现出在多个研究和临床领域的显著应用潜力。在基础研究中，获得的高存活率细胞在脂肪生成和骨生成分化研究中表现出卓越的性能，为组织工程应用提供了可靠的细胞源。在转化医学中，临床研究已证明ADSCs在治疗骨关节炎¹²、心血管疾病¹³、多发性硬化症¹⁴以及炎症性肠病（IBD）/克罗恩病¹⁵等疾病中的治疗潜力。快速分离的ADSCs成为构建脂肪组织类器官和实施细胞治疗应用的理想构件，显著推动了药物筛选和疾病建模研究的发展。此外，高质量的单细胞悬浮液也适用于单细胞RNA测序。总之，这一综合方法为脂肪组织建立了坚实的技术平台，支持再生医学的基础研究和临床转化。

方案

所有动物研究均依据《实验 动物管理条例 》（中国科学技术部，2017年3月修订），并经四川农业大学动物伦理福利委员会批准（许可号：20230089）。该方案需要使用SoniConvert系统，这是一种商业化的机械波辅助组织解离装置（以下简称机械解离系统）。该方案针对猪脂肪组织进行了优化，其对这些专用设备的依赖是关键局限。

1. 脂肪组织收集与制备

1. 术前消毒与脱毛
   1. 通过静脉注射过量五巴比妥钠（100毫克/体重体重）安乐死猪。在组织采集前确认死亡。
   2. 使用浸有2%碘蛋白的无菌纱布，从中线延伸15厘米，进行猪背螺旋消毒。晾干30秒。
   3. 用无菌剃须刀刮除16厘米×8厘米的毛发。确保手术区域的所有毛发都被去除。
   4. 用75%乙醇用无菌纱布擦拭背部两次。
2. 脂肪组织采集
   1. 用无菌手术刀沿背侧中线做一个20厘米的横切口。
   2. 用无菌产钳抬起切口边缘。沿脂肪组织与真皮层之间的自然平面进行解剖，获得一层完整的背部皮下脂肪组织（ULB）上层，厚度约为2–3毫米。
   3. 将ULB用冰冷无菌生理盐水冲洗一次，然后放入无菌培养皿中（见图2）。

图2：用于细胞分离的猪ULB采集。 （A） 猪背脂肪组织结构示意图;（b）巴马迷你猪的切割场; （C）背部脂肪组织的呈现，猪背皮下脂肪包含两层，上层（ULB）和内层（ILB）; （D）收集的ULB。缩写：ULB = 背部上层;ILB = 背部内层。 请点击此处查看该图的放大版本。

暂停点：收集的脂肪组织可在冰冷无菌生理盐水或D-Hanks溶液中以4°C保存短时间，然后进行进一步解剖。
注意：目标是收集ULB。避免在解剖时包含背部皮下脂肪组织（ILB）的下层。

3. 脂肪组织解剖与清洁
   1. 每1.8克组织加入10毫升冰冷D-Hanks缓冲液，确保组织完全浸没。
   2. 使用无菌外科剪刀识别并切除所有可见的血管。去除所有结缔组织和纤维化成分。将切除的材料丢弃到指定的生物危害容器中。
      注意：使用锋利工具时务必格外小心;使用后务必从尸体上切开，并立即将用过的刀片和剪刀放入锐器容器中处理。
   3. 冲洗D-Hanks缓冲液内的组织，去除残留的血液和杂质。
      注意：对于血肿过多的样本，应根据需要更换缓冲液1–3次以获得视觉清晰度。所有解剖步骤都保持冰冻，以保持组织存活。
4. 脂肪组织机械解离
   1. 将1.8克冲洗后的组织碎片转移到无菌的1.5毫升微离心管中。向管内加入800微升A型组织解离缓冲液（A-缓冲液）。
   2. 使用无菌眼用剪刀将管内组织切碎，切成约1–2 mm³ 大小的小块。
      注意：如果在剁碎过程中或之后观察到明显脂质泄漏，应在进行酶消化前，用1毫升预冷却的D-Hanks溶液再次清洗组织，以去除破碎脂肪细胞中的脂质。这一步可以为后续分析保持脂肪细胞的完整性。

2. 细胞分离与均质化

1. 酶处理
   1. 向新的微型离心管加入200微升A型组织解离剂（A型溶液）。轻轻旋转并用手摇晃管子3次，混合内容物，确保脂肪碎片完全浸入解离溶液中。
   2. 确认管盖是否紧闭。将试管放入37°C的金属浴中，孵育5–10分钟。
      注意：观察溶液变浑浊且组织碎片部分消化。A型溶液含有胶原酶和中性蛋白酶。搬运时请戴丁腈手套、实验服和安全护目镜。避免皮肤接触;如果发生暴露，立即用大量清水冲洗15分钟。添加A型溶液后，A-缓冲液不会被丢弃。
2. 超声辅助机械解离
   1. 将部分消化的脂肪组织碎片连同周围缓冲液从微离心管转移到专用于机械解离系统的无菌1.5毫升微离心管中。
   2. 在机械解离系统中运行预设的脂肪 组织 程序，使用200 Hz正弦波进行机械解离。

3. 过滤以获得单细胞悬浮液

1. 过滤与离心
   1. 收集细胞悬浮液，通过200微米的细胞过滤器进入新的50毫升离心管，去除大颗粒残渣和未消化的组织团块。
   2. 向滤网中加入5毫升预冷（4°C）D-Hanks溶液。用D-Hanks溶液冲洗过滤器两次以最大化细胞产量。
   3. 将过滤后的细胞悬浮液在500× 克 下离心，4°C下离心5分钟。
      暂停点：离心后，细胞悬浮液可以立即处理，或在层分离前短暂冰封。
   4. 脂肪细胞采集：采集脂肪细胞时，使用无菌巴斯德移液管抽取并丢弃上清液脂质层，保留1毫升缓冲液保护脂肪细胞层。采集第二层，用于脂肪细胞的下游分析。避免扰动第三和第四层。
   5. 间质血管分数（SVF）采集：去除上层后，轻柔地将含有间质血管分数（SVF）的底部沉淀液重新悬浮于1毫升D-Hanks/PBS中。将细胞沉淀轻轻地悬浮在1毫升D-Hanks/PBS中，以获得2–5 ×10个⁶ 细胞/毫升的细胞浓度。
      注意：理想情况下，离心后可观察到四层：顶部的脂质层;第二层包含脂肪细胞;第三层是亲水缓冲层;底层是SVF，包含干细胞（见图1）。
2. 红细胞裂解
   1. 注意：如果细胞沉淀表现出明显的红色，表明红细胞污染，应进行红细胞溶解。
      使用带宽口径的P1000移液管将细胞沉淀液重新悬浮于1–3毫升红细胞（RBC）溶解缓冲液中。冰上孵化15分钟，偶尔混合。
   2. 将所有溶液和离心转子预冷至4°C，以减少加工过程中的代谢活动。
   3. 离心机在500× 克 ，4°C下离心10分钟。 完全抽取上清液。
   4. 再次清洗细胞，将沉淀重新悬浮于5毫升预冷的D-Hanks溶液中，并在500× 克 离心机中，4°C下5分钟。 丢弃上清液。
3. 最终停赛
   1. 将最终电池沉淀重新悬浮在D-Hanks/PBS中，用于下游应用。

4. 下游应用与分析

1. SVF细胞活性与细胞产量评估
   1. 准备在1.5 mL微离心管中获得的SVF细胞悬浮液。使用前保持悬挂冰冻状态。
   2. 将10微升SVF细胞悬浮液与10微升0.4%的锥蓝溶液混合在无菌0.5毫升微离心管中。轻轻上下移液3次以确保均匀混合。
      注：混合物中锥蓝的最终浓度为0.2%。混合时避免引入气泡，因为它们可能干扰自动细胞计数。
      将10微升染色细胞混合物转移到适合自动细胞计数器的计数载玻片上。确保样品完全充满腔室且无溢出。
   3. 将计数滑片插入单元计数器。选择Trypan Blue检测法类型，必要时调整细胞浓度范围。
   4. 按下计数按钮即可启动自动细胞计数。该仪器将拍摄计数室的图像，并自动区分活细胞和死细胞。
   5. 记录细胞存活率百分比，并统计仪器屏幕上显示的存活细胞总数。对每个样本进行三次独立测量，计算每克脂肪组织的平均存活率和细胞产率。
      注意：每次使用后用70%乙醇清洁计数载玻片和仪器装载口，以防止样品间交叉污染。
2. 脂肪细胞形态的观察
   1. 在D-Hanks/PBS中，在37°C下用5 μg/mL Hoechst染色，脂质用1 μM BODIPY染色分离的脂肪细胞。
      暂停点：染色后应及时成像样品;如有需要，它们可以在显微镜检查前短暂保持在4°C的光线保护下。
   2. 使用自制的适合脂肪细胞的滑套玻璃系统进行载玻片准备，以避免压缩细胞。
   3. 在荧光显微镜下观察核（用霍克斯特染色）和脂滴（用BODIPY染色）。
      注意：由于体积较大（20–300微米）和高脂质含量，脂肪细胞脆弱，容易漂浮，并堆叠成多层，使得传统装载方法不适合显微镜下清晰观察（见图3A）。为此，开发了一种自制的适合脂肪细胞的安装系统，使用标准载玻片和盖套（见图3B）。
3. 基质血管成分纯化及ADSC的形态学观察
   1. 将新鲜分离的SVF播种于含有5毫升DMEM的T25细胞培养瓶中，该瓶补充10% FBS和1%青霉素-链霉素。在37°C、5%二氧化碳下孵育。
   2. 48小时后，用预热的PBS轻轻清洗瓶子2次，去除不粘附的细胞。加入新鲜培养基，继续孵化。
   3. 每2-3天更换培养基。在倒置显微镜下监测细胞形态和汇合情况。
   4. 当细胞达到80–90%的汇合度（通常在7–10天后），使用0.25%胰蛋白酶-EDTA在37°C下分离细胞3–5分钟。 用培养基中和并收集细胞悬浮液。
   5. 在FACS检测和分选前，先进行Trypan Blue染色以检测细胞活性。
   6. 在光学显微镜下观察纯化培养ADSC的形态。
   7. 将收集的细胞悬浮液过滤至70微米的细胞筛，以去除残留的聚集物。将细胞重新悬浮于含有2% FBS的PBS中进行FACS分析。
   8. 用荧光色素结合抗体染色细胞，分别针对CD73、CD90、CD11b和CD45，在4°C的黑暗环境下染色30分钟。
   9. 用染色缓冲液清洗细胞两次，然后用含2% FBS的PBS重新沉淀。
   10. 使用70微米喷嘴，压力20 psi，流量低于3.0进行流式细胞术分析。
   11. 通过利用前向散射面积（FSC-A）和侧散射面积（SSC-A）参数对主种群进行门控，排除细胞碎片。
   12. 通过FSC-A门控与FSC-H门控去除双重态，选择适合下游分析的单重态群体。
   13. 根据表面标记表达分析门控细胞。使用CD73和CD90作为阳性标志物，CD11b和CD45作为阴性标志物以验证ADSC表型。
   14. 在光学显微镜下观察富集和培养ADSC的形态。具有典型的纺体状、类纤维细胞的形态表明ADSC富集成功。
4. ADSC脂肪生成分化
   1. 以1×10⁴ 细胞/^厘米2的密度播种第三代ADSCs。当细胞汇聚率达到约90%时，开始脂肪生成诱导。
   2. 使用高葡萄糖杜尔贝科改良的鹰氏培养基（DMEM）制备脂肪诱导培养基，该培养基含有10%胎儿牛血清（FBS）、0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄基（IBMX）、1 μM 地塞米松、10 μg/mL 胰岛素和1 μM 罗格列酮。
   3. 3天后，更换为维持培养基，每两天更换一次溶液。
   4. 诱导14天后，用Oil Red O染色细胞，并在倒置显微镜下观察脂滴。
5. ADSC骨生成分化
   1. 当细胞汇聚达到80–90%时，开始骨质诱导。配制含有10% FBS、10 mM β甘油磷酸、50 μg/mL抗坏血酸、10 μM 降钙醇和1 μM 地塞米松的产骨诱导培养基。
   2. 每2-3天更换培养基，并继续诱导过程约14天。
   3. 用2%的茜素红S（pH 5.2）染色细胞，并在倒置显微镜下观察。
6. 类器官的构造与鉴定
   1. 在完整培养基中制备单细胞ADSC悬浮液，并将细胞浓度调整为2×10⁴ 细胞/20微升。
   2. 将100毫米培养皿的盖子倒置，滴入20微升细胞悬浮液于盖子内表面。
   3. 在盘底添加无菌PBS以保持湿度，盖好，并在标准培养条件下孵育悬挂滴液。
   4. 每天观察滴剂，让细胞聚集并形成球状体，持续6天。
   5. 用移液管轻轻收集球体，转移到预冷的冰块中。
   6. 将球状体嵌入Matrigel中，并将混合物镀入培养板中，然后在标准培养条件下孵育。
   7. 定期更换培养基，监测类器官生长直到第18至28天，届时结构变得致密成熟。
   8. 用4%对甲醛定型类器官，用0.1% Triton X-100渗透，并用5% BSA阻断非特异性结合。
   9. 将样本与针对CD73、CD90、CD11b和CD45的初级抗体一起孵育，然后与相应的荧光二抗一起孵育。
   10. 用Hoechst和BODIPY染色类器官，分别观察核和脂滴，并在荧光显微镜下观察染色样本。
       注意：在严格无菌条件下，在生物安全柜内进行细胞分选及所有涉及开放培养的操作，包括播种、喂养和染色准备。

结果

图1：脂肪 来源细胞分离过程的示意图。 图示展示了传统方法和当前方法作为示例工作流程。分离脂肪来源细胞主要涉及三个步骤：第一步是预处理;第二种是解离脂肪组织以释放细胞;最后一项是通过过滤和离心分离细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。

如图1所示，脂肪细胞已成功从猪的ULB AT中分离出来。通过用Hoechst和BO...

讨论

本研究引入了一种新型综合方法，用于分离脂肪来源细胞（主要是脂肪细胞和ADSC），解决了传统方法的关键局限性。通过结合组织特异性酶松弛与精密机械波解离，该系统实现了快速（总处理时间~30分钟）、高存活率（80–95%）且可重复的细胞分离。

传统酶消化虽然广泛使用，但依赖于胶原酶培养期（1–3小时）和严苛的机械移液，导致脂肪细胞破裂释放脂质、氧化应激及随之而来的存活能力丧失（常<70%）^16,17。相比之下，我们的方法采用双重作用机制：（1）短培养（5–15分钟）脂肪特异性松动试剂，温和破坏ECM交联而不破坏细胞膜;（2）微处理器控制的机械波，实现精确、低振幅的组织解离。这种协同作用最大限度地减少脂质污染和氧化损伤，如80–95%的存活率所证明——持续比传统方法高出10–25%^18,19...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
类型组织解离套件	Docsense（教义）	TM001	含有一种型组织解离剂（A型溶液）和一种型组织解离缓冲液（A型缓冲液）。
脂肪生成分化培养基套件	OriCell	GUXMD-90031	用于脂肪生成分化，包括高葡萄糖杜尔贝科改良的鹰氏培养基（未改造）和维持培养基
阿利扎林红 S	OriCell	A5533ALIR-10001	骨质分化的矿化染色（pH 5.2）
抗坏血酸	西格玛-奥尔德里奇	A4544	L-抗坏血酸，细胞培养，用于骨生成诱导
巴拉马迷你猪	成都多西实验动物有限公司		一岁的雄性SPF级动物，采用标准化疫苗接种、驱虫和清洁程序饲养。https：//www.cd-dossy.cn/animalpl_detail/12606067609851863 04.html
Bio-Rad TC20 自动细胞计数器	生物辐射实验室	1450011	用于存活性和产量评估的自动细胞计数器
身体	赛莫飞世尔科学	D3922	中性脂质染色
BSA（5%）	西格玛-奥尔德里奇	A9418	牛血清白蛋白，冻干粉末，用于阻断
钙三烯	西格玛-奥尔德里奇	C9756	1&α;，25-二羟基维生素D3，用于成骨诱导
单元筛（70 & MU;m)	科宁	352350	猎鹰70号及穆;无菌的M细胞滤过器，用于FACS样本准备
细胞过滤器（200 & MU;m)	pluriSelect	43-50200-03	pluriStrainer，PET网，适合50毫升管，无菌且无菌;
离心管（50毫升）	科宁	352098	Falcon 50 mL 高净度锥形管，无菌，聚丙烯
计数幻灯片（用于Bio-Rad TC20）	生物辐射实验室	1450011	TC20自动单元计数器的双腔计数幻灯片;
培养皿（100毫米）	科宁	430167	无菌聚苯乙烯皿，用于悬挂液滴类器官形成
地塞米松	西格玛-奥尔德里奇	D4902	≥98%，用于脂肪生成和骨质诱导
D-Hanks平衡盐溶液（PBS）	吉布科	10010015	预冷至4度;C，pH值7.4。
DMEM	吉布科	11965084	该方法用于新鲜分离的SVF培养
DNase I	碧昂泰姆	D7073	可选，建议如发现结团。
乙醇	西格玛-奥尔德里奇	459836	75%用于表面消毒。
胎牛血清（FBS）	吉布科	A4736201	春节系统认证，美国产，无菌等;
流式细胞仪	BD生物科学	BD FACSCanto II	3个激光（405 nm、488 nm、633 nm），8个荧光通道，用于表面标记分析（CD73、CD90、CD11b、CD45），满足70 M喷嘴需求，压力20 psi。
荧光显微镜	奥林匹斯		可支持FITC和DAPI滤波器集的倒置或直立模型。
荧光二级抗体	赛莫飞世尔科学	A-11001（反老鼠），A-11008（反兔）	Alexa Fluor 结合，用于免疫荧光
荧光色素结合抗体（CD73、CD90、CD11b、CD45）	BD生物科学	561254（CD73）、561970（CD90）、557321（CD11b）、555485（CD45）	用于ADSC表型的流式细胞术分析
霍赫斯特	赛莫飞世尔科学	H3570	核染色用于活细胞/死细胞评估。
IBMX	西格玛-奥尔德里奇	I5879	≥99%（高效液相色谱），用于脂肪诱导培养基
冰冷无菌生理盐水	巴克斯特	2F7124	0.9%氯化钠注射，USP，用于冲洗组织
胰岛素	西格玛-奥尔德里奇	I9278	重组，在酵母中表达，用于脂肪诱导
碘置物	西格玛-奥尔德里奇	25104	2%消毒液。
马特里格尔	科宁	354230	生长因子还原，无酚红，用于嵌入球体和nbsp;
金属浴	服务简介	SMB-H	用于37 & C孵育。
油红O	OriCell	油轮-10001	脂质染色用于脂肪细胞分化
光学显微镜	奥林匹斯		标准明场显微镜配备10x–40倍目标。
骨质分化培养基套件	OriCell	GUXMD-90021	用于骨生成分化，包括高葡萄糖杜尔贝科改良版鹰氏培养基（未改造）和维持培养基
P1000移液器，带宽口径的移液器	贝克曼·库尔特	B01113	Biomek P1000 Span-8宽管头，绝无菌
对甲醛（4%）	赛莫飞世尔科学	J61899	水溶液，用于固定类器官和nbsp;
巴斯德移液器	科宁	7095S-5C	无菌，一次性。
青霉素-链霉素	吉布科	15070063	10,000 U/mL青霉素，10,000 & μ;g/mL链霉素，无菌
戊巴比妥钠	Hikma制药美国公司	24201-010-20	注射，用于安乐死（100毫克/公斤体重，静脉注射）。安达203619
原抗（CD73、CD90、CD11b、CD45）	BD生物科学	561254（CD73）、561970（CD90）、557321（CD11b）、555485（CD45）	用于类器官免疫染色
红细胞（RBC）溶解缓冲液	太阳生物	R1010	如果需要用于下游应用。
冷藏离心机	埃彭多夫	5702R	用于4 & C的离心步骤。
罗格列酮	开曼化学	71740	≥98%，PPAR和γ;脂肪诱导激动剂
锐器容器	贝克顿·迪金森	305270	用于用过刀片和剪刀的防刺容器
SoniConvert单电池悬浮液制备系统	Docsense（教义）	SC-L1W	用于组织的机械解离。
染色缓冲液（流式细胞术染色缓冲液）	eBioscience（Thermo Fisher Scientific）	00-4222-57	200毫升即用，含有FBS和0.09%叠氮化钠作为防腐剂，用于抗体和细胞稀释、表面染色及流式细胞仪洗涤步骤;
无菌1.5毫升Eppendorf管	埃彭多夫	30121.517	Safe-Lock微型离心管，无菌，用于组织剁碎
无菌培养皿	科宁	430167	100毫米×20毫米无菌培养皿，用于组织采集
无菌产钳	斯克拉尔	96-1719	无菌拇指镊子，锯齿状，用于组织处理
无菌纱布	杜卡尔市政公司	7060033	无菌纱布垫，用于消毒和擦拭
无菌眼科学剪刀	斯克拉尔	10023-580	Vannas风格弹簧剪刀，用于将组织切碎为1-2毫米及3毫米;棋子
无菌剃须刀	3岁月	9681	手术准备剃须刀，用于手术区域脱毛
无菌手术刀	英特格拉·米尔特克斯	4-415	无菌一次性手术刀，用于切开
无菌外科剪刀	斯克拉尔	10022-580	Merit无菌虹膜剪刀，用于血管和结缔组织的剥离
T25细胞培养瓶	科宁	430639	Falcon T25细胞培养瓶，通风盖，无菌
特里顿X-100（0.1%）	西格玛-奥尔德里奇	T8787	实验室级，用于渗透性及nbsp;
特里潘蓝	Gibco，赛莫·费舍尔科学	15250061	细胞存活率计数的解答率为0.4%。
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）	吉布科	25200056	0.25%胰蛋白酶，1 mM EDTA，用于脱离的ADSCs
&β;-甘油磷酸	西格玛-奥尔德里奇	G9422	五水合二钠盐，用于成骨诱导