本文介绍了利用琼脂稀释法评估福斯霉素与头孢曲松、美洛宾南和庆大米星联合使用对抗碳青penem大 肠 杆菌分离株的协同活性的方案。美洛宾南和庆大霉素有协同效应，但与头孢曲松无显著效果。
综述文章
针对碳青批南耐药性大肠杆菌的磷霉素类抗生素组合琼脂稀释棋盘分析方案
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本文内容
摘要
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摘要
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由于碳青霉烯耐药肠杆菌的治疗选择有限，联合治疗方案的重要性日益增加。本研究旨在研究福霉素耐药率，并评估福斯霉素与美洛宾脆、庆大霉素和头孢曲松联合使用对抗碳青霉烯的大 肠 杆菌分离株的体外协同相互作用。研究纳入了60个从迪克莱大学医学院医院临床病房和重症监护病房患者身上提取的多种临床样本（尿液、血液、抽吸液、伤口、脑脊液、气管内抽吸液）中分离出的耐药性大 肠杆菌 株。物种鉴定使用自动微生物鉴定系统完成。抗生素敏感性检测及碳青霉烯耐药性确认通过使用厄替哂、亚咪南和美洛宾南进行椎间盘扩散。通过琼脂稀释评估了磷霉素耐药性及抗生素间的相互作用。此外，采用琼脂稀释方案评估了跨序列两倍浓度梯度的抗生素组合，并计算了分数抑制浓度指数（FICI），以确定协同、无差异或拮抗作用。耐药率为福斯霉素76.6%，美洛宾脆61.6%，庆大霉素85.0%，头孢曲松98.3%。在35%的分离株中观察到协同相互作用，分别为fosfomycin–gentamicin组合为33.4%，fosfomycin–ceftriaxone组合为1.7%。在福斯霉素-美洛宾素组合中，仅在一个分离株中检测到受阻作用。fosfomycin与美洛宾南和庆大米星的联合使用显示出对碳青霉素耐药性大肠杆菌的体外协同效应。需要进一步的体外研究以证实这些发现。
引言
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肠杆菌家族包括一类高度多样化的革兰氏阴性杆菌，其中许多具有重要的临床意义1.其中， 大肠杆 菌是临床微生物实验室中最常分离的物种，广泛关联几乎所有器官系统的感染，包括尿路感染、伤口感染、免疫功能低下患者的肺炎、胃肠炎和新生儿脑膜炎。它也是革兰氏阴性败血症和内毒素介导败血性休克的主要原因。除了人类医学之外， 大肠杆 菌还是重要的兽医病原体，会引发包括马在内的多种动物的呼吸道和系统感染，拓展了大 肠杆 菌发病机制在人类和动物宿主的宿主范围范围2,3,4。
产生扩展谱β-内酰胺酶（ESBL）的肠杆菌，尤其是大肠杆菌和肺炎克雷伯菌，与死亡率增加、住院时间延长和医疗费用增加有关。抗生素的广泛使用是这些病原体多重耐药性（MDR）的主要驱动力。1.耐药机制包括碳青霉烯酶产生、ESBLs、氨基糖苷修饰酶（AMEs）、赋予喹诺酮耐药性的突变，以及孔素和排外系统的改变。在大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌中，耐药主要由质粒介导，促进横向基因转移。此类抗性性状在动物起源的大肠杆菌中也越来越多地报告，包括牛的分离株，支持“一体健康”理念，并表明潜在的人畜共患传播风险 2,3。
碳青霉烯被认为是治疗严重多重耐药感染的最后一线药物。然而，碳青烯类耐药肠杆菌（CRE）已成为全球重大健康问题。这种耐药性主要由碳青霉内酯酶介导，包括B类金属-β-内酰胺酶，促成了广泛耐药性和泛耐药性表型5。
多重耐药大肠杆菌株显著限制治疗选择，并使感染管理复杂化。这凸显了采用联合疗法等替代治疗策略以改善临床结果的必要性。此外，这些耐药菌株不仅来自临床环境，也越来越多地来自乳制品等食物来源。这拓宽了抗菌药物耐药性传播的流行病学背景，并支持联合治疗作为减缓其传播和临床影响的潜在策略 6,7。氨基糖苷、替格环素和多粘菌素是多重复原感染中常用的治疗药物8。磷霉素还显示出对产生ESBL的大肠杆菌的活性，尤其是在尿路感染中。
磷霉素最早于1969年被发现，能抑制细菌细胞壁早期合成，并作为复合疗法中的前景重新出现。在MDR生物中，福斯霉素与氨基糖苷或β内酰胺类之间存在协同效应报道11,12。此外，福霉素已在大型临床队列中评估，单用或联合方案在严重感染中表现出有效性13。然而，大多数先前研究涵盖了异质性细菌群体，专门针对碳青霉烯抗性大肠杆菌的数据仍然有限。
标准抗菌药敏感性检测方法包括琼脂稀释、肉汤稀释和盘片扩散。基于琼脂稀释的联合检测通过确定抗菌化学化学化合物（MICs）和计算FICIs，实现抗菌相互作用的定量评估。替代方法如时间杀死和梯度扩散可提供动态或简化的交互数据，但在可重复性和标准化方面可能存在差异13,14。 该方案最适合对已定义抗生素组合进行体外受控评估。然而，它并未完全反映体内药物动力学条件15。其中琼脂稀释被视为MIC鉴定的参考方法;然而，其在评估对抗碳青霉烯抗药性大肠杆菌活性中的福霉素联合作用方面的应用仍然有限。
本研究系统评估了基于福霉素的组合与临床确认的耐碳青霉素大 肠 杆菌分离株。采用标准化琼脂稀释棋盘格方法，在受控体外条件下直接生成比较相互作用数据。
因此，本研究检验了福斯霉素与美洛宾南、庆大霉素或头孢曲松联合使用，在体外对CRE大肠杆菌分离株具有协同作用的假说。
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综述与观点
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本研究获迪克勒大学医学院非干预性临床研究伦理委员会批准（决定号：100，日期：2021年1月1日）。
以下方案描述了一种标准化琼脂稀释棋盘格方法，用于评估福霉素组合对抗碳青霉烯抗性 大肠杆菌 分离株的协同效应。
分离株收集
2021年2月15日至12月15日期间，共计60个从Dicle大学医学院医院住院患者采集的临床样本（尿液、血液、抽吸物、伤口、脑脊液和气管内抽吸物）分离出的耐药性大肠杆菌株。鉴定使用了MALDI-TOF质谱系统。当同一患者提取多个分离株时，仅包含第一个分离株。排除了门诊诊所和住院时间少于48小时的患者样本。所有符合预定纳入标准的碳青细胞素耐药性大肠杆菌分离株均连续纳入;因此，样本量由可用合格分离株的总数决定，未进行先验样本量计算。大肠杆菌ATCC 13846和大肠杆菌ATCC 25922被用作质量控制菌株。质量控制菌株与临床分离株在相同的琼脂稀释条件下并行测试。所有跑程均由两名独立观察员评估。质量控制品系的结果显示所有实验均显示预期的生长抑制模式，未观察到超出范围或无效的结果。
所有涉及临床分离株的操作均在生物安全二级（BSL-2）条件下进行。使用了适当的个人防护装备（实验服、手套和护目镜），所有操作均在认证的生物安全柜内进行。
物种鉴定与抗菌药敏感性检测
碳青霉烯耐药性和抗菌药敏感性检测采用自动微生物鉴定与敏感性检测系统。系统检测到的碳青霉烯抗药性通过使用ertapenem、imipenem和meropenem盘进行盘扩散测试确认。区径的解释依据EUCAST断点16,17（表1）。所有分离株均保存在含20%甘油的含盐大豆汤中，并储存在−20°C。
表1：通过盘扩散试验（DDT）确定的大 肠杆菌 碳青霉烯类区域直径断点。 用于碳青霉烯敏感性测试的椎间盘扩散解释标准。 请点击此处下载此表格。
适合儿童和好氧样本的血液培养瓶被置于自动血液培养系统中。阳性瓶子被亚培养到EMB琼脂、5%羊血琼脂和Sabouraud葡萄糖琼脂上。
尿液和气管内抽吸样本采用定量方法培养，其他样本则采用半定量方法处理。气管内抽吸样本采用革兰氏染色法评估，仅有Bartlett评分为0、默里>评分为3的样本被认为>显著，共计18个。
对于伤口样本，革兰氏染色评估采用Q评分系统;纳入了Q分数大于0的样本，19人。
通过基质辅助激光脱附/飞行电离时间质谱法鉴定细菌分离株。≥2.0的分数被认为属级和物种级鉴定可靠，而1.7至2.0的分数表示属级鉴定可靠，20,21。 仅纳入得分为≥2.0的分离株。
通过琼脂稀释法确定福斯霉素的敏感性
根据欧洲抗菌药敏感性检测委员会（EUCAST），推荐采用琼脂稀释法来确定肠道杆菌家族成员的萆孢霉素敏感性16。
磷菌素及其他抗生素工作溶液的制备
琼脂稀释法使用粉末状的福斯霉素二钠盐水合物，并使用无菌蒸馏水来稀释。每种抗生素计划将稀释八种，分别为EUCAST确定的MIC限值的4倍和3倍。
通过溶解51.2毫克无菌福斯霉素二钠（含2560微克/毫升福斯霉素）制备，该溶液采用体积/重量/效力公式（体积（mL）=重量（mg）×效力（μg/mg）/浓度（μg/mL）））在无菌条件下称重，置于20毫升无菌蒸馏水中。最终浓度计划为256微克/毫升，因加入MHA时将原溶液稀释10倍。
因此，确定了福斯霉素（2-256 μg/mL）、美洛宾南和庆大霉素（0.125–16 μg/mL）以及头孢曲松（0.0625–8 μg/mL）的稀释范围。
稀释液通过在无菌锥形管内连续两倍稀释，内含10毫升无菌蒸馏水制成。共进行了7次连续的双倍稀释，直到浓度达到2 μg/mL。最后一根管子里剩下的10毫升被丢弃。这导致了八种不同的抗生素浓度：256、128、64、32、16、8、4和2 μg/mL。
其他抗生素也采用了对狐霉素相同的方法来制备初始的库存溶液。头孢曲松用1.6毫克粉末抗生素，美洛宾脆和庆大霉素用3.2毫克，使用精确秤秤称重。每种抗生素共做了七种稀释剂。因此，针对美洛宾南、庆大霉素和头孢曲松，获得了八种不同浓度的抗生素稀释剂（见图1）。
图1：福霉素稀释溶液的制备步骤。 通过连续稀释步骤获得工作浓度。 请点击此处查看该图的放大版本。
琼脂培养基的制备
按照制造商的说明，经过阳离子调整的Mueller-Hinton Agar（CAMHA）进行了制备。它在121°C、1大气压下使用高压灭菌器消毒15–20分钟，然后在45–55°C的水浴中保持。
所有生物材料均在121°C高压灭菌处理15至20分钟后处理。含抗生素的废物处理方式符合机构生物安全和化学废弃物规范。
关键步骤： 添加抗生素前，保持琼脂温度在45–55°C之间。过热可能降低福霉素活性，影响MIC结果。
G6P加入该媒介
为了确定福斯霉素的敏感性，EUCAST建议向琼脂和汤液培养基中加入25 μg/mL葡萄糖-6-磷酸（G6P）。每升琼脂，将25毫克G6P溶解于20毫升MHA中，经过过滤消毒后，混合至主琼脂批次中。
琼脂稀释板的制备
为了确定单药中福霉素、美洛宾南、庆大霉素和头孢曲松的MIC值，每次稀释使用一块Petri平板（例如8次稀释，范围为2–256微克/毫升）。检测板上记录了抗生素浓度。
在联合研究中，试验板上记录了福斯霉素及其他抗生素的浓度（例如福斯霉素256 μg/mL和美洛宾脆32 μg/mL）。因此，每种组合共准备了64个平板，并在平板上记录了福斯霉素及其他抗生素的浓度。共制备32片美洛宾南-庆大米三单用板，192片用于联合治疗。一幅包含56个1厘米小方格的标准素描绘制在大理石表面上。所有版块均直接接种于此图纸上。因此，读数和接种被标准化（见图2和图3）。
图2：为接种和阅读目的制作的标准示意图。 采用标准化接种和评估方案。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：琼脂稀释板的评估方法。 用于确定MIC的细菌生长评估。F = fosfomycin;M = 美洛宾烯。 请点击此处查看该图的放大版本。
将2毫升抗生素溶液与18毫升熔融的CAMHA混合，以获得最终工作浓度。根据制造商说明书，该介质在热水浴中冷却至45−55°C。使用了一份（2毫升）抗生素混合物，培养皿中混合了9份（18毫升）MHA（抗生素稀释为十分之一）。最终琼脂板体积标准化为每板约20毫升（18毫升琼脂+2毫升抗生素溶液），稀释后计算最终抗生素浓度。通过这种方式，琼脂稀释板中实现了抗生素浓度（福斯霉素为2–256 μg/mL，头孢曲松为0.0625–8 μg/mL，美洛宾南和庆大霉素为0.125–16 μg/mL）。使用未加抗生素溶液的培养基制备平板作为生长对照（见图4）。由培养基和抗生素溶液组成的混合物在室温下固化。
图4：无抗生素溶液的对照培养基。使用无抗生素培养基以确认细菌存活能力。请点击此处查看该图的放大版本。
关键步骤：琼脂深度不均或抗生素混合不足可能导致MIC判读不准确和相互作用错误。
分离株的制备与接种
先前储存的纯菌株被转入5%羊血琼脂中，在室温下培养16–24小时。新鲜培养的菌落悬浮于无菌盐水溶液中，使用光学读卡器实现了0.5麦克法兰浊度。
琼脂稀释法每个点需要约104 CFU的细菌接种。0.5 McFarland值约含有108 CFU/mL细菌。通过将溶液与无菌生理盐水1：10稀释，细菌密度达到10.7 CFU/mL。
使用自动移液器从管内采集每种细菌悬浮液2微升。这个体积大约相当于每个点位2×10到4CFU 。接种针对琼脂表面的靶点区域，从含有最低浓度的菈菈素板开始，逐步推进至最高浓度。
因此，接种定义为每个斑点的CFU，每个接种点约含有104 CFU。每个细菌悬浮液的接种在15分钟内完成。
在接种含福霉素的板材前，先接种了生长控制板以检查污染情况。接种剂在室温下晾干。在35–37°C的有氧条件下进行孵育16–24小时，并用校准密度计测量浊度。
过多的接种密度可能导致拖延生长和终点判定困难。重新调节浊度至0.5麦克法兰，若发生汇合生长，重复接种。
组合测试
使用的是粉末状抗生素：美洛宾南、福霉素、庆大霉素、头孢曲松和葡萄糖-6-磷酸。
抗生素用量通过体积/重量/效力公式计算。制备完存货溶液后，将抗生素溶液调制在高于敏感MIC范围的三倍稀释和四倍稀释的浓度。稀释范围计算为：福斯霉素为2–256微克/毫升，头孢曲松为0.0625–8微克/毫升，庆大霉素和美洛宾南为0.125–16微克/毫升（见表2、表3和表4）。
表2：磷 霉素-庆大霉素联合用抗生素溶液的制备。 用于原料和工作溶液的制备步骤和浓度。 请点击此处下载此表格。
表3：用于磷 霉素-美罗宾南联合用药的抗生素溶液制备。 用于原料和工作溶液的制备步骤和浓度。 请点击此处下载此表格。
表4：磷霉素-头孢曲松联合用抗生素溶液的制备。 用于原料和工作溶液的制备步骤和浓度。 请点击此处下载此表格。
本研究为单疗法和联合试验准备了不同的fosfomycin库存溶液，以补偿琼脂测试中最终稀释因子的差异。单药实验使用标准库存溶液，而组合实验则使用调整过的高浓度库存溶液，以补偿抗生素预混时的额外稀释。
作为连续稀释的初步步骤，准备了原料溶液。对于福斯霉素，256毫克粉末在无菌条件下使用分析天平准确称重，并溶解在50毫升无菌蒸馏水中，连续搅拌（磁搅拌器）直到完全溶解，最终浓度为5120 μg/mL的福斯霉素二钠。分别制备了庆大霉素、美洛酮和头孢曲松的存量溶液。
对于连续的双倍稀释，准备了七根装有25毫升无菌蒸馏水的无菌锥形管。从原有溶液中，25毫升通过可调节移液器转移到第一管，随后依次转移到后续管子，实现双倍连续稀释。每根管子在每次转移后都用涡旋混合器彻底混合5–10秒。最后一根管子中丢弃25毫升以保持均匀体积。通过这种方式，得到了稀释序列，最低浓度为40 μg/mL，并共制备了八种不同的福斯霉素浓度。
同样的程序也应用于基因大美素、美洛酮和头孢曲松。然而，由于靶标浓度范围不同，16毫克的庆大霉素和美洛宾南（范围为0.125–16 μg/mL）和8毫克头孢曲松（范围为0.0625–8 μg/mL）分别称重并溶解于50毫升无菌蒸馏水中，且在室温无菌条件下进行。如上所述，进行了连续的双倍稀释。最终最低浓度为景大霉素和美洛宾南2.5 μg/mL，头孢曲松为1.25 μg/mL。每种抗生素都准备了八根装有不同浓度25毫升的管子。由于将福霉素与三种抗生素联合测试，共制备了24个福斯霉素稀释管（8×3个）。
琼脂制备中，18毫升穆勒-辛顿琼脂，辅以葡萄糖-6-磷酸（25 μg/mL）预冷至45–50°C，然后投入无菌培养皿中。随后，使用无菌移液器加入1毫升福斯霉素溶液和1毫升第二种抗生素溶液。板材通过圆周旋转轻柔混合以确保均匀分布，并在室温下凝固。由于均匀体积混合和琼脂添加，抗生素浓度降低了约9倍。
组合测试时，将最低浓度的1毫升（40 μg/mL）与八种杏仁稀释剂各1毫升（2.5–320 μg/mL）混合，然后加入分离培养皿中轻柔混合。同样的程序对下一个福斯霉素浓度（80 μg/mL）重复，并逐步提升至5120 μg/mL，确保所有可能的浓度组合都被测试。每次转移都使用新的无菌移液器尖端以防止交叉污染。共为福斯霉素-庆大霉素组合准备了64个培养皿（8×8种组合）（见表5）。
同样的程序也应用于福斯霉素与美洛宾烯和头孢曲松联合使用，结果每种抗生素组合均有64个平板（见表6和表7）。
表5：磷霉素-庆大霉素组合在MHA培养基上的排列情况。Mueller–Hinton琼脂上抗生素浓度的排列。FF = fosfomycin;GN = 庆大霉素。请点击此处下载此表格。
表6：磷霉素-美洛宾南组合在MHA培养基上的排列。 Mueller–Hinton琼脂上抗生素浓度的排列。FF = fosfomycin;MEM = 美洛宾南。请点击此处下载此表格。
表7：MHA培养基上磷霉素-头曲松组合的排列。Mueller–Hinton琼脂上抗生素浓度的排列。FF = fosfomycin;CRO = 头孢曲松。请点击此处下载此表格。
制备抗生素混合物后，每块含有1毫升抗生素混合物的板块加入18毫升熔融的Mueller–Hinton琼脂（45–50°C），确保温度不影响抗生素活性。这导致初始抗生素溶液大约稀释了9倍。
为系统评估，平板被排列成棋盘格（二维稀释）格式。磷霉素浓度沿垂直轴（A–H行）排列，A行浓度最高，H行浓度递减。第二种抗生素沿水平轴（第1至8列）排列，浓度从第1列递增至第8列。因此，每个等效位置都代表两种抗生素浓度的独特组合，便于全面评估相互作用效应。
结果评估
根据EUCAST v.11建议评估了最小抑制浓度结果。生长控制板显示可见细菌生长，而无菌控制板（未接种）则无细菌生长。MIC被定义为无可见生长的最低浓度。在组合测试中，交互作用效应采用FICI值来解释。协同作用定义为FICI为0.5≤，无异于>为0.5–4，拮抗为>4。对于福霉素，MIC值为32 μg/mL≤为易感性，>为32 μg/mL者为耐药性。对于庆大霉素和美洛宾南（脑膜炎感染），MIC值≤2 μg/mL被视为易感，2 μg/mL>被视为耐药。对于美洛宾南（非脑膜炎感染），MIC值≤2 μg/mL被认为易感。8 μg/mL >值被认为耐药，MIC ≤ 1 μg/mL（非脑膜炎感染）被认为易感，头孢曲松（脑膜炎感染）MIC ≤ 2 μg/mL（脑膜炎感染）被认为耐药，头孢曲松（脑膜炎感染）MIC > 1 μg/mL 被认为耐药16。
研究数据的统计分析使用统计软件进行。
统计：类别变量以数字和百分比表示。皮尔逊卡方检验用于所有预期细胞计数为≥5的比较。Fisher精确检验用于样本量较小或预期细胞计数为<5的分析。具体来说，卡方检验用于对福斯霉素耐药率的整体比较，而Fisher精确检验则用于由于某些组合中低频分布，对协同作用、加法和受体作用率的亚群分析进行分析。P值≤0.05被视为统计学显著。
解读说明： 抑制区内的微小单一菌落除非在重复测试中汇聚或可重复，否则不被视为生长。
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结论
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研究共纳入了60个抗碳青烯的大肠杆菌分离株。所有分离株均来自迪克莱大学医学院医院重症监护室或临床病房的患者。成人患者占83.3%，儿科患者占16.7%（见表8 和 表9）。在80%（n = 48）分离株中观察到多重药物耐药性。
表8：大 肠杆 菌分离株按住院地点和年龄分布。 ICU = 重症监护室。 请点击此处下载此表格。
表9：按样本类型划分的大 肠杆 菌分离株分布。 脑脊液 = 脑脊液;预计时间 = 气管内抽吸。
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披露
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作者声明他们没有利益冲突。
致谢
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本研究得到了迪克勒大学科学研究项目协调组（DÜBAP）的支持，项目编号为SBE.21.004。
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