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方法文章

利用ICG近红外成像和超声评估骨折后淋巴引流

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DOI：

10.3791/70466

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2026年6月23日

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1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education (Shanghai University of Traditional Chinese Medicine), 4School of Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 5Shanghai Pudong New Area Hospital of Chinese Traditional Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案通过结合吲哚菁绿（ICG）近红外成像与超声技术，定量评估小鼠骨折后足底ICG清除情况及腘窝淋巴结肿大，以评价淋巴回流功能。

摘要

创伤性骨折常伴随淋巴引流功能受损。骨折后淋巴引流减少及淋巴结肿大，提示急性炎症反应和免疫细胞募集的持续动态过程。本文描述了一种方法：对接受假手术或胫骨骨折手术的小鼠，于足底区域皮内注射6 µL浓度为0.2 mg/mL的吲哚菁绿（indocyanine green）。通过近红外荧光成像技术，定量检测0 h和24 h时足底吲哚菁绿信号，计算24 h清除率，以评估小鼠淋巴引流功能。同时采用超声成像对腘窝淋巴结（PLNs）进行三维重建，比较其体积，并评估骨折所致的淋巴结肿大情况。  结果表明，骨折后淋巴清除率显著降低，足底区域ICG的荧光强度明显升高，且足淋巴结体积显著增大。  与以往测量淋巴系统的方法（如组织病理学切片或淋巴显像）相比，这些方法通常难以实现 体内，可进行动态、连续的观察，该方法表现出高稳定性和可重复性。值得注意的是，该方法能够实现动态 在体内 监测淋巴引流功能，为研究骨折模型中淋巴反流变化提供强有力的技术支持。

引言

创伤性骨折常导致显著的组织损伤和肿胀，增加感染、坏死和骨不连等并发症的风险1,2。Grzegorz Szczesny 等人研究表明，淋巴引流功能障碍导致的组织水肿与愈合延迟相关3。研究指出，在骨折愈合过程中，除了骨组织的修复外，骨折部位的淋巴系统也发挥着重要作用。淋巴管不仅负责引流组织间液、防止肿胀4，还参与调节免疫细胞迁移和清除代谢废物。然而，在骨折早期，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）以及巨噬细胞集落刺激因子（MCSF）等促炎因子可损伤淋巴内皮细胞5，导致退行性变、水肿和纤维化等病理改变6。相关研究已证实骨组织、骨膜以及周围脂肪和肌肉组织中存在淋巴内皮细胞。此外，淋巴引流还参与调控骨折后血肿微环境；有效的淋巴引流有助于成骨细胞的存活及骨髓间充质干细胞（BMSCs）的增殖7。骨折发生时，损伤部位免疫细胞产生的促炎因子（TNF-α、IL-1 和 IL-6）以及生长因子（TGFβ1 和 PDGF）是调控成骨细胞凋亡和 BMSC 增殖的重要调节因子8。Hüseyin Arslan 等学者已证实淋巴水肿对成骨细胞具有负面影响。这些研究成果凸显了淋巴引流在骨折愈合中的重要作用。近年来，吲哚菁绿（ICG）近红外（NIR）荧光成像技术的发展使得在动物模型和人体中无创、实时观察淋巴流动态成为可能9,10,11。该技术可对淋巴管收缩性、引流速度及通路完整性进行定量评估10,11。一项利用关节炎和炎症小鼠模型的研究表明，ICG-NIR 成像能够区分急性和慢性淋巴反应，揭示组织损伤与恢复期间不同的引流模式。此外，NIR 淋巴成像已被证明可用于监测手法淋巴引流后的功能恢复情况，并评估靶向淋巴治疗的疗效。超声检查为评估引流淋巴结的形态和体积以及与淋巴引流障碍相关的组织水肿提供了互补的定量手段。将 NIR 荧光成像与超声技术结合，可同步评估淋巴功能与解剖结构变化，为体内研究淋巴动态提供多模态方法。in vivo. 尽管淋巴功能障碍在创伤后愈合中的关键作用日益受到重视，但目前仍缺乏评估骨折后淋巴引流的标准化且可重复的方法。许多现有的成像方法具有侵入性，空间分辨率不足，或无法动态监测淋巴流动。因此，建立一种结合 ICG-NIR 与超声成像的方案有望弥补这一方法学上的不足，为评估淋巴功能恢复及其对骨修复的贡献提供有效工具。

本研究提出了一种创新性框架，将吲哚菁绿近红外（ICG-NIR）荧光成像与高分辨率超声技术相结合，用于评估小鼠胫骨骨折后淋巴系统的引流情况。该方法可对引流效率进行半定量分析，并在骨折愈合过程中测量淋巴结体积。但该方法也存在一些局限性：首先，ICG-NIR主要用于评估浅表淋巴管，对深层结构的成像能力有限；其次，尽管淋巴结体积的变化可提供一定信息，但其特异性不足，无法完全替代直接的功能性测量。该技术方法具有重要的转化潜力，有助于加深我们对淋巴系统功能在骨再生过程中作用的理解。

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方案

动物实验已获得上海模型生物研究中心机构动物护理和使用委员会的批准（批准号：NMB-SMP-IACUC-01-0002-R02-03）。本研究使用了建立骨折模型的C57BL/6雄性小鼠3（6–8周龄）。所用试剂和设备列于材料表中。 

1. 术前护理

  1. 将小鼠适应性饲养至少1周 随意摄取 自由饮水和进食。使用计算机生成的随机化列表将动物随机分配至骨折组或假手术组。
  2. 将小鼠置于动物加热垫上，并维持恒定温度为 37 °C。
  3. 打开气体麻醉机，将小鼠放入诱导室中，以2%–3%异氟烷麻醉5分钟。
  4. 诱导后，改为1%–2%异氟烷以维持麻醉 通过 直至操作结束，始终保留鼻锥。 确认小鼠反射消失且肌肉完全放松。验证足趾夹捏反应和角膜反射消失，并确保腹部呼吸稳定。 在麻醉期间，将红霉素软膏涂抹于双眼以防止角膜干燥。

2. 实验步骤

注意：在所有实验过程中，需统一麻醉条件、吲哚菁绿（ICG）剂量和体积、注射部位与深度、曝光时间、感兴趣区域（ROI）定义以及超声扫描参数，以尽量减少个体间差异。

  1. 近红外ICG成像
    注意：ICG 近红外成像的分步操作流程如以下所示 图1.
    1. 称取 0.2 mg 吲哚菁绿（ICG），转移至 1.5 mL 微量离心管中，加入 1 mL PBS 溶解，配制 0.2 mg/mL 的 ICG 溶液。用铝箔包裹管子以避光。
    2. 打开成像系统并启动 FluoBeam v1.46 软件。根据需要调整相机高度。
    3. 用75%乙醇润湿棉签，对模型后肢足底表面进行消毒。
    4. 使用10 µL微量注射器吸取6 µL的ICG溶液。将针头插入足底表面约1 mm深度，以恒定速率注射溶液，直至完全注入全部体积。
    5. 在软件中，同时激活“相机” 和 “激光”功能。点击“修改”以创建一个新文件夹并将其设置为保存目录。在0 h和24 h图像采集时保持曝光时间一致。
    6. 将小鼠置于俯卧位，放置在相机下方，使建模的后肢位于视野中央。确保建模的后肢位于视野中央。
    7. 将曝光时间设置为30 ms，并在0 h和24 h的图像中保持一致。在注射后0 h和24 h，对同一足底注射区域（ROI）进行成像，以测量ICG信号强度。在0 h和24 h时保持曝光时间相同。
    8. 当视野中后肢的淋巴管清晰可见时，点击“照片”以采集图像。
    9. 图像采集后，导出数据并使用图像分析软件定量0 h和24 h的荧光强度，然后计算荧光清除率。
    10. 打开图像分析软件。
    11. 单击以导入荧光图像 文件 → 打开，打开同一动物在同一检查日对应的0小时足底图像（随后再打开配对的24小时图像）。
    12. 选择椭圆，然后单击 编辑 → 选择 → 指定；设置 宽度 = 30 和 高度 = 30，选择 椭圆形，然后单击 好的.
    13. 将圆圈放置在背景区域上。
    14. 点击 分析 → 测量，将结果窗口中的平均值记录为0小时背景荧光强度（FI0hbg）。
    15. 将圆圈放置在目标观测位置上，点击 分析 → 测量，将结果窗口中的平均值记录为 FI0h。
    16. 将0 h的校正荧光强度计算为：Corrected FI0h = FI0h − FI0hbg。
    17. 打开匹配的24小时图像，重复步骤3至7，以获得校正后的FI24h。
    18. 使用经背景校正的荧光强度计算清除率，公式如下：清除率 = [(FI0h − FI0hbg) − (FI24h − FI24hbg)] / (FI0h − FI0hbg) × 100%。
  2. B型超声检查
    注意：超声成像及淋巴结勾画的逐步操作流程见于 图2.
    1. 打开超声系统，连接换能器，并调整小鼠体位以清晰显示后肢。在持续麻醉状态下，将小鼠俯卧于成像平台，头部朝向远离操作者方向，尾部朝向操作者。屈曲膝关节，使腘窝向上并略向外侧，将换能器置于腘窝凹陷处。
    2. 在模拟的后肢上涂抹超声耦合凝胶。
    3. 旋转探头，使其角度始终与后肢的长轴平行。
    4. 将扫描距离设为4 mm，步长设为0.04 mm。根据解剖位置在图像上识别腘窝淋巴结。
    5. 用双手固定小鼠，一手握住尾巴，另一手固定建模侧后肢。在探头扫描过程中，不得移动动物。
    6. 采集图像。将腘窝淋巴结识别为一个较小的椭圆形或略呈豆状、回声中等至偏低的结节，其回声略低于周围脂肪组织，并与邻近回声较暗、呈条纹状的肌肉组织分界清晰。
    7. 将图像导出至三维重建软件进行三维图像处理。
    8. 在超声成像系统控制台上完成三维扫描后，将扫描数据保存为三维数据集，并记录动物编号、分组代码和时间点（0 h / 24 h）。
    9. 将原始数据从采集控制台导出至分析计算机，保持原始文件夹结构不变；每个时间点的每只动物尽可能使用单独的文件夹存放。
    10. 打开3D重建软件。
    11. 点击“研究”进入该模块，然后选择“导入.”
    12. 点击 数据 文件夹，检查要导入的数据，然后双击打开。
    13. 在显示模式下，选择“图像处理” → “载入三维” → “横断面视图” → “体积测量” → “开始”
    14. 确认切片方向和步进参数（“体素/间距”）与采集设置一致。
    15. 使用鼠标滚轮或切片滑块从近端向远端滚动，找到PLN首次出现的切片（通常呈现为椭圆形或豆状结构，回声略低于周围脂肪组织，边界相对清晰）。
    16. 在PLN首次出现的切片上开始描记，通过左键单击以启动轮廓绘制。
    17. 沿淋巴结边缘逐点追踪，绘制一个闭合轮廓，尽量贴近被膜外侧，避免将周围脂肪或血管腔纳入其中。
    18. 使用鼠标滚轮移动至显示 PLN 最大横截面积的切片，并重复步骤 10 以完成第二个轮廓。
    19. 使用鼠标滚轮移动到PLN刚要消失的切片，然后重复步骤10以完成第三个轮廓。
    20. 点击“完成”以生成三维分割体积并输出体积测量结果。
    21. 记录 PLN 体积（mm3结果面板中的）
    22. 在测量结果面板中，选择“导出”并将结果导出为 .csv 或 .xls 文件。
    23. 选择文件类型，并将图像导出为TIFF图像区域（.tif）。
    24. 分析过程中保持盲法，仅显示动物编号和时间点，不显示分组信息（骨折/假手术），直至完成全部体积提取后，在进行统计分析前对分组进行解码。
  3. 使用统计分析软件进行统计分析
    1. 选择 新表格 & 图表，选择 分组.
    2. 将数据输入格式设置为“输入重复值，堆叠成子列”。
    3. 输入 1 / 7 / 14 天以及假手术组 / 骨折组的原始数值。- 打开图表。
    4. 将图表类型更改为散点图（显示单个数值）+ 均值 + 误差线。
    5. 设置坐标轴格式：调整 Y 轴并修改坐标轴标题。
    6. 点击 分析 并进行双因素方差分析。
    7. 比较每个时间点假手术组与骨折组。
    8. 将显著性结果添加到图表中。

3. 术后护理

  1. 实验结束时，将小鼠置于加热垫上，使其从麻醉状态中恢复。
  2. 术后监测小鼠的呼吸频率、鼻黏膜颜色、卷曲反射、摄食情况及行为变化。
    注意：正常呼吸频率应高于每分钟50次，鼻黏膜应保持粉红色；若出现发绀或呼吸抑制，可能提示麻醉过量或残余麻醉作用，应停止给药，清理呼吸道，抬高头部，并在必要时进行胸部按压或人工呼吸。使用加热垫维持体温在约37 °C，以防止低体温并促进麻醉恢复。术后连续3天每天皮下注射美洛昔康0.5–1 mg/kg，用于镇痛，并对任何异常情况及时采取相应的兽医干预措施。

4. 评估

注意：由对分组情况设盲的研究人员进行图像采集和定量分析，并在完成统计分析之前始终保持所有数据集处于编码状态。

  1. 近红外ICG成像
    1. 使用图像分析软件对从小鼠足垫采集的ICG图像中的荧光强度进行相对定量分析。
      注意：小鼠足垫ICG清除率的计算公式如下：
      清除率 (%) = [(FI0h – FI24h) / (FI0h)] × 100%
    2. 采用相同方法记录每次测量的清除率，并使用统计分析软件分析淋巴清除率与时间之间的关系。
  2. B型超声检查
    1. 使用三维重建软件分析B型和三维图像，以确定PLN体积。
    2. 通过统计分析软件绘制散点图，评估淋巴引流和淋巴结体积随时间的变化。
  3. 统计分析
    1. 使用双因素重复测量方差分析（ANOVA）对第1、7和14天获得的重复测量数据进行分析。

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结果

在建立骨折模型后的第1、7和14天，骨折组的足底24小时吲哚菁绿荧光强度（FI24h） consistently 高于假手术组（图3）。对采集的足底图像进行ICG荧光强度的相对定量分析显示，骨折组的淋巴系统ICG清除率显著低于假手术组（p < 0.05）（图4）。同时，三维B型超声成像显示，骨折组小鼠在第1、7和14天的腘窝淋巴结体积显著大于对照组（p < 0.05）（图5）。这些结果表明淋巴清除率与淋巴结肿大之间存在高度相关性。

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讨论

该方案包含若干容易被忽视的细节。例如，曝光时间并非固定不变，必须根据具体的荧光强度来确定。然而，同一组小鼠在0 h和24 h的曝光时间必须保持一致，否则可能导致结果不可靠。使用超声进行观察时，必须用耦合剂完全覆盖小鼠的下肢，任何未覆盖的区域在探头扫描时都会导致图像失真。扫描过程中，小鼠的下肢应保持静止。操作者可用一只手轻轻牵拉小鼠下肢，另一只手握住尾巴以固定小鼠。此步骤尤其具有挑战性，但对准确的超声检查至关重要。

吲哚菁绿-近红外成像（ICG-NIR）和超声成像在多种科研与临床应用中被广泛使用，但需注意，其参数可能因所观察的具体指标不同而有所变化12,13。ICG-NIR可用于动态评估淋巴引流速度及通路的完整性，而超声则作为补充手段，用于评估引流淋巴结的形态与体积。在使用超声检查组织时，实验前预先定位其解剖位置可显著提高检查效率。例如，腘窝淋巴结位于股二头肌腱、半膜肌腱与腓肠肌之间，紧邻膝关节囊。观察过程中，可能出现类似腘窝淋巴结的椭圆形低回声阴影。当难以明确识别时...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由国家自然科学基金（82174407，项目负责人：YJZ）、上海市浦东新区卫生健康委员会学科带头人培养计划（PWRd2020-05）， 浦东新区卫生健康委员会学科带头人项目（PWRq2020-56）以及深圳市医疗卫生“三名”工程（编号：SZZYSM202311006）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
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参考文献

  1. Zhang, S., Sheng, H., Xu, B., Lao, Y. Acute external iliac artery thrombosis following pelvic fractures: Two case reports. Medicine (Baltimore). 100 (6), e24710(2021).
  2. Szczesny, G., Olszewski, W. L., Gewartowska, M., Zaleska, M., Gorecki, A. The healing of tibial fracture and response of the local lymphatic system. J Trauma. 63 (4), 849-854 (2007).
  3. Zheng, Y., et al. A novel therapy for fracture healing by increasing lymphatic drainage. J Orthop Translat. 45, 66-74 (2024).
  4. Thomas, C., Le, J. T., Benson, E. Managing lymphedema in fracture care: Current concepts and treatment principles. J Am Acad Orthop Surg. 28 (18), 737-741 (2020).
  5. Jiang, X., Nicolls, M. R., Tian, W., Rockson, S. G. Lymphatic dysfunction, leukotrienes, and lymphedema. Annu Rev Physiol. 80, 49-70 (2018).
  6. Biswas, L., et al. Lymphatic vessels in bone support regeneration after injury. Cell. 186 (2), 382-397.e24 (2023).
  7. Dimitriou, R., Tsiridis, E., Giannoudis, P. V. Current concepts of molecular aspects of bone healing. Injury. 36 (12), 1392-1404 (2005).
  8. Arslan, H., et al. Effect of lymphedema on the recovery of fractures. J Orthop Sci. 12 (6), 578-584 (2007).
  9. Cheon, H., Kim, S. A., Kim, B., Jeon, J. Y. Investigation of optimizing indocyanine green solution for in vivo lymphatic research using near-infrared fluorescence indocyanine green lymphangiography. Sci Rep. 13 (1), 14966(2023).
  10. Polomska, A. K., et al. Minimally invasive method for the point-of-care quantification of lymphatic vessel function. JCI Insight. 4 (4), e126515(2019).
  11. Wang, F., Weng, Y., Geng, J., Zhu, J. A narrative review of indocyanine green near-infrared fluorescence imaging technique: A new application in thoracic surgery. Curr Challenges Thorac Surg. 3, 35-35 (2021).
  12. Zheng, Y., et al. Lymphatic platelet thrombosis limits bone repair by precluding lymphatic transporting damps. Nat Commun. 16 (1), 829(2025).
  13. Kim, K. M., Kim, K. Y. Lymphangiogenesis after nonvascularized lymph node transplantation: Lymphangiographic findings in mice and minipigs. PLoS One. 18 (12), e0295836(2023).
  14. Zhang, P. H., et al. Efficient pulmonary lymphatic drainage is necessary for inflammation resolution in ARDS. JCI Insight. 9 (1), e173440(2024).
  15. Kenney, H. M., et al. Persistent popliteal lymphatic muscle cell coverage defects despite amelioration of arthritis and recovery of popliteal lymphatic vessel function in TNF-TG mice following anti-TNF therapy. Sci Rep. 12 (1), 12751(2022).

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