本研究提出了一种综合方法，用于评价雪山金罗汉止痛涂膜剂的镇痛和抗炎作用。其作用具有面积和时间依赖性，经皮分析表明，苯甲酰乌头原碱为主要渗透成分，且呈扩散控制型释放。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本研究提出了一种综合方法，用于评价雪山金罗汉止痛涂膜剂的镇痛和抗炎作用。其作用具有面积和时间依赖性，经皮分析表明，苯甲酰乌头原碱为主要渗透成分，且呈扩散控制型释放。
外用中药制剂因其可在局部发挥治疗作用，同时可能减少全身不良反应，被广泛用于炎症和疼痛相关疾病的治疗。然而，许多临床应用制剂的药效学特征及其透皮作用机制尚未得到充分阐明。雪山金罗汉止痛涂膜剂（XJCA）是一种藏药制剂，常用于治疗炎症性疼痛，但其应用面积、作用持续时间以及局部效应与全身效应的相对贡献尚未得到系统评估。本研究建立了一种整合的体内-体外方法学框架，用于研究这些参数。采用多种互补的动物模型评估中枢和外周镇痛活性以及急性炎症反应，从而评价与面积、时间及局部与全身效应相关的药效特征。同时，结合超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）的Franz扩散池系统被用于表征两种主要生物碱——苯甲酰乌头原碱（benzoylaconine）和乌头碱（aconitine）的经皮吸收动力学。结果显示，XJCA具有显著的面积依赖性和时间依赖性镇痛及抗炎作用，且较大的用药面积与更强的全身性镇痛贡献相关。透皮动力学分析表明，苯甲酰乌头原碱具有更高的稳态通量，并符合Higuchi模型描述的扩散控制型释放，而乌头碱的渗透性较低，释放曲线更为复杂。这些发现将透皮递送行为与观察到的药效学结果相联系，为外用中药制剂的评价与优化提供了系统化的研究框架。
炎症和疼痛是相互关联的生理与病理反应，在机体抵御损伤和感染过程中发挥着关键作用1。然而，持续性或过度的炎症与疼痛，如骨关节炎、类风湿性关节炎或创伤后疼痛，可能导致组织损伤，严重影响患者的身体功能和心理健康2,3。目前，临床上对炎症和疼痛的治疗主要依赖非甾体抗炎药（NSAIDs）（例如双氯芬酸、布洛芬）和阿片类药物。尽管NSAIDs因其抗炎和镇痛作用被广泛应用，但口服给药常引起胃肠道刺激、肾损伤以及心血管风险4。阿片类药物虽然镇痛效力强，但存在成瘾性、呼吸抑制及其他严重不良反应的风险5,6。因此，临床上对更安全替代疗法的需求日益增长。局部制剂可通过将药物直接递送至作用部位，有效减少全身性不良反应，是一种具有战略意义的解决方案7。然而，其疗效高度依赖于药物穿透皮肤屏障的能力，这一因素可能限制临床前研究结果的可转化性，特别是对于分子量较大或脂溶性较差的药物尤为明显8,9。因此，开发安全有效的替代疗法，尤其是具有局部作用且全身暴露最小化的局部制剂，已成为药理学研究的重点方向。
外用中药制剂在治疗炎症和疼痛方面具有悠久的应用历史。其优点包括可直接作用于病变部位、减少全身性副作用以及实现药物的缓释10,11。XJCA 是一种临床应用的中药成膜凝胶，由多种草药成分组成，在中国广泛用于缓解由骨关节炎、软组织损伤和神经痛引起的疼痛和炎症12,13,14。然而，其疗效的科学证据仍有限，关键的药效动力学特征，如用药面积与疗效的关系、作用的时间进程，以及局部效应与全身效应之间的差异，尚不明确。这些空白限制了 XJCA 的合理临床应用。
透皮吸收是影响外用制剂治疗效果的关键因素。皮肤作为主要屏障，限制了药物向体循环或局部组织的渗透15,16。对于雪 jun 草膏（XJCA）而言，明确其活性成分的透皮吸收特性对于阐明其药效动力学作用及优化剂型至关重要。既往对中药制剂的研究表明，生物碱类成分（如乌头碱类衍生物）是具有抗炎和镇痛作用的重要活性组分17,18。苯甲酰乌头原碱和乌头碱是 XJCA 中的两种主要生物碱19,20，其含量及透皮行为可能直接影响 XJCA 的药理效应。然而，目前尚无关于 XJCA 中这两种成分透皮吸收的研究报道，亦未见其动力学特征及释放机制的相关研究。
为填补这一研究空白，本研究旨在建立并验证一种用于评估外用中药制剂的系统性方法学框架，并以新疆传统复方药XJCA为案例进行研究。目标是展示一种整合性评价方法，该方法包括：（1）设计用于解析给药部位、治疗时长以及局部与全身药物递送对药效影响的体内药效学模型；以及（2）一种 体外 使用Franz扩散池和UPLC-MS/MS进行透皮动力学评价，以测定关键活性生物碱的经皮吸收与释放。我们假设XJCA的体内药效，特别是其面积依赖性和时间依赖性，主要由其关键成分的透皮动力学所驱动。通过将体内药效参数与相应的体外动力学数据相联系，该方法为透皮递送如何影响外用中药制剂的药效动力学提供了机制性理解。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
本研究遵循《实验动物福利伦理审查指南》（GB/T 35892-2018）和《关于善待实验动物的指导性意见》的规定进行。所有动物实验均经成都中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准号：TCM-09-315）。
实验动物与饲养条件
采用无特定病原体（SPF）级昆明小鼠（20~25 g，雌雄比1:1）和SPF级Sprague-Dawley（SD）大鼠（180~200 g）。动物饲养于受控环境中：12小时光照/12小时黑暗循环，温度23 ± 2 °C，相对湿度60% ± 5%，自由摄食和饮水。为全面评估XJCA的镇痛和抗炎作用特征，采用了多种体内小鼠模型。热板试验用于评估中枢介导的痛阈；福尔马林试验用于区分神经源性疼痛（I相）和炎症性疼痛（II相）；二甲苯致耳肿胀试验用于评价急性抗炎活性；醋酸致扭体试验用于模拟内脏炎症性疼痛。需注意，XJCA为即用型成膜凝胶，使用前无需额外配制。
应用面积对镇痛和抗炎效果的影响
将 SPF 级昆明小鼠按雌雄各半随机分为 4 组：正常对照组（NC）、小面积 XJCA 组（1×1 cm，1 cm2，XJCASAAG）、中面积 XJCA 组（1×2 cm，2 cm2，XJCAMAAG）和大面积 XJCA 组（1.5×2 cm，3 cm2，XJCALAAG）。每只小鼠按 0.015 g/cm2（每只 0.15 mL）剂量连续给药 7 天。正常对照组以相同方式给予生理盐水。末次给药后 120 分钟，采用热板法和福尔马林试验评价镇痛效果。
在热板实验中，将小鼠置于保持在55 ± 0.5 °C恒温的热板上进行预筛选。记录后肢回缩潜伏期（PWL），仅选择基线PWL在5至30秒之间的小鼠（n = 40，雄性/雌性 = 1:1）。经过7天治疗后，每隔30分钟测量一次PWL，共测量3次，并记录平均值。设定60秒为截断时间，以防止组织损伤。
在福尔马林实验中（n = 40，雄性/雌性 = 1:1），经过7天治疗后，将1%福尔马林溶液（1 mL/kg）皮下注射至小鼠右后足掌。注射后立即把小鼠放入独立的观察箱中。记录I相（0–10分钟，神经源性疼痛）和II相（15–30分钟，炎症性疼痛）期间与疼痛相关的行为（舔舐、抬足和逃避）。通过观察足部是否出现明显肿胀来确认注射成功。
时间依赖性镇痛和抗炎效果评价
将120只SPF级昆明小鼠随机分为三组（每时间点n = 10，雌雄比1:1）：模型对照（MC）组、XJCALAAG（1.5×2 cm，3 cm2）组和双氯芬酸二乙胺乳胶（DDE）阳性对照组。XJCA（0.015 g/cm2，每只小鼠0.15 mL）和DDE（0.016 g/cm2，每只小鼠0.15 mL）连续给药7天，MC组给予生理盐水。末次给药后2、4、6和8小时，分别进行二甲苯致耳肿胀试验和乙酸致扭体试验。
在二甲苯诱导的耳肿胀实验中，将30 µL二甲苯涂抹于右耳两侧（MC组给予生理盐水），60分钟后，以戊巴比妥钠（30 mg/kg，腹腔注射）麻醉小鼠并处死；随后用打孔器取下耳片（直径8 mm）并称重。耳肿胀程度以右耳耳片重量减去左耳耳片重量计算，肿胀抑制率按公式[(MC组肿胀度－给药组肿胀度) / MC组肿胀度] × 100%计算。从左右耳廓相同位置用圆形打孔器（直径8 mm）取下耳组织，使用电子天平称重。
在醋酸诱导的扭体实验中，腹腔注射0.6%醋酸溶液（0.1 mL/10 g），记录20分钟内扭体反应次数（包括后肢伸展、腹部收缩和躯干扭转）。醋酸注射后立即将小鼠放入各自的观察笼中。扭体抑制率按以下公式计算：[（模型对照组扭体次数－给药组扭体次数）/ 模型对照组扭体次数] × 100%。
局部与全身镇痛效果的比较
为了区分局限于局部的镇痛作用与经皮吸收及全身分布所产生的效应，我们设计了两种具有明确操作定义的给药方案。局部效应指的是药物在给药部位下方或邻近组织局部发挥作用，血液循环中的药物贡献极小；而全身效应则是指药物进入血液后，在远离给药部位的中枢或外周位点介导的镇痛作用。我们通过保持单位面积剂量恒定而改变总给药面积的方式，直接检验了“增加给药面积会导致药物更多的全身吸收，从而产生强于单纯局部作用的镇痛效应”这一假设。该实验设计可量化暴露空间范围如何决定药物的全身生物利用度，以及由此产生的全身介导效应的贡献程度。
将30只在热板试验中痛阈值为5～30秒的SPF级昆明小鼠随机分为3组（每组n = 10，雌雄比1:1）：阴性对照组（NC组）、局部给药组（TMG）和全身给药组（SMG）。XJCA以0.015 g/cm2的固定剂量、0.15 mL的体积连续给药7天。
对于局部给药组（TMG），将制剂涂抹于后肢皮肤的局部区域。对于系统给药组（SMG），为了模拟增加的全身吸收，将制剂涂抹于包括双侧后肢和背部皮肤在内的联合区域，同时保持单位面积给药剂量相同（0.015 g/cm2）。该设计确保SMG组接受的XJCA总剂量按比例高于TMG组，从而促进更多药物经皮吸收进入全身循环。在末次给药后120分钟，采用热板法检测痛阈值（每隔30分钟测定1次，共3次，记录平均值）。通过比较TMG组（以局部效应为主）与SMG组（局部效应加全身效应），可解析药物全身分布对整体镇痛作用的贡献。
体外透皮吸收研究
本研究采用有效扩散面积为 1.76625 cm2 的 Franz 扩散池。Franz 扩散池是评估经皮吸收的金标准。该系统由供体室（含待测制剂）、受体室（填充生理缓冲液）以及夹在两者之间的离体皮肤组成。药物分子通过皮肤扩散进入受体溶液，随时间采集样品以定量分析渗透动力学。取经戊巴比妥钠（30 mg/kg，腹腔注射）麻醉的 SD 大鼠腹部皮肤，仔细去除皮下脂肪组织，用生理盐水冲洗后置于生理盐水中浸泡 24 小时。必须保护角质层的完整性，避免拉伸、折叠或触碰表皮表面。皮肤的渗透性受其水合状态影响显著，适当的水合时间可获得可重复的实验结果。
将制备好的皮肤置于供体室和接收室之间，角质层朝向供体室。供体侧加入200 µL XJCA（相当于0.06 g生药量），接收室中加入15 mL接收液（30%乙醇:70% PBS，经超声脱气15分钟），并在32 ± 0.5 °C条件下以350 r·min⁻1持续磁力搅拌。接收液在使用前应经超声脱气15分钟，以防止实验过程中产生气泡。
在2、4、6、8、10、12、20和24小时时，从接收室中各取1 mL样品，并每次补充等体积的预热（32 °C）新鲜接收液。
注意：置换溶液必须保持相同温度，以避免温度波动影响扩散动力学。收集的样品需经0.22 µm微孔滤膜过滤，并在24小时内通过UPLC-MS/MS进行分析。由于乌头碱不稳定，样品应在采集后24小时内完成分析，或添加稳定剂。若无法立即分析，应将样品分装后于-80 °C保存，但在进行后续操作前需验证样品在此条件下的稳定性。
UPLC-MS/MS 条件
色谱分析采用 Agilent ZORBAX SB-C18 色谱柱（2.1 × 100 mm，1.8 µm），柱温维持在 40 °C，流速为 0.3 mL/min，进样体积为 2 µL。流动相由乙腈（A）和含有 0.5 mL/L 冰醋酸的 0.1 mol/L 乙酸铵溶液（B）组成，采用以下梯度程序：0–5 min（26%–45% A），5–7 min（45%–74% A），7–10.1 min（74%–90% A），10.1–12 min（90% A），12–12.1 min（90%–26% A），以及 12.1–15 min（26% A）。
采用电喷雾离子源（ESI）在正离子模式下进行质谱检测，设置条件如下：干燥气温度 500 °C，干燥气流速 5 L/min，雾化器压力 50 psi，鞘气温度 500 °C，鞘气流速 11 L/min，毛细管电压 5500 V，数据采集采用多反应监测（MRM）模式。MRM 转换及参数设置如下：乌头碱（m/z 646.6→586.4，驻留时间 100 ms，DP 102.930 V，CE 49.810 V）和苯甲酰乌头原碱（m/z 604.4→105.1，驻留时间 100 ms，DP 105.120 V，CE 74.270 V）。
方法验证与数据分析
通过评估特异性、线性、精密度、稳定性及重复性来进行方法验证。通过分析空白接收液、标准溶液和样品溶液，确认内源性物质无干扰，以验证方法的特异性。线性通过最小二乘法回归分析，以峰面积对浓度作图绘制标准曲线进行评价。精密度采用50 ng/mL的标准溶液进行日内（6次重复）和日间（连续3天，每天2次重复）测定，以峰面积的相对标准偏差（RSD）表示。稳定性通过测定样品溶液在0、2、4、6、8、12、16、18和24小时时峰面积的RSD进行评估。重复性通过6份平行样品制备液的峰面积RSD进行确认。标准储备溶液的制备：分别准确称取2.5 mg的苯甲酰乌头原碱和乌头碱，用异丙醇-二氯甲烷（1:1）混合溶剂溶解，定容至25 µg/mL。供试品溶液的制备：取适量样品置于离心管中，于12,000 × g 高速离心5分钟，取上清液用于分析。
每个时间点的累积渗透量（Qn，ng/cm2）通过以下公式计算：
Qn = [(Cn × V + ΣCi × Vi) / A]
其中：
Qn：第 n 次取样时间的累积透皮量（ng/cm2）。
Cn：第 n 次取样时间接收液中药物的浓度（ng/mL）。
Ci：第 i 次取样时间接收液中药物的浓度（ng/mL）。
V：接收液的体积（15 mL）。
Vi：每次取样的取样体积（1 mL）。
A：Franz 扩散池的有效扩散面积（1.76625 cm2）。
以累积渗透量（Qn）为纵坐标，时间（t，h）为横坐标，绘制累积渗透量-时间（Q-t）曲线。对Q-t曲线的线性部分进行线性回归，将回归方程的斜率作为稳态经皮渗透通量（Js，ng/cm2/h）。
将Q-t曲线拟合至零级模型（Q = kt + b）、一级模型（ln(Qmax - Q) = -kt + lnQmax）和Higuchi模型（Q = kt1/2 + b），其中Qmax为最大累积渗透量，k为速率常数，b为截距。采用相关系数（R2）评价拟合优度，R2值越高表示拟合效果越好。
统计分析
所有体内行为学实验的单个动物原始数据和体外渗透研究的原始UPLC-MS/MS色谱数据分别作为补充文件1和2提供。所有实验数据均以均值±标准差（x̄ ± SD）表示。统计分析采用GraphPad Prism 9.0软件进行。组间差异的比较采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Dunnett多重比较检验。p < 0.05被认为具有统计学显著性。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
镇痛和抗炎疗效对应用面积的依赖性
在小鼠模型中，XJCA在连续7天以固定剂量0.03 g/cm2给药后，表现出应用面积与镇痛/抗炎疗效之间的正相关关系。在热板实验中，NC组的平均PWLT最短，表明其疼痛反应最强。相比之下，XJCA处理组显示出与面积相关的PWLT延长：XJCASAAG、XJCAMAAG和XJCALAAG组与NC组相比均显示出显著差异（图1A），证实较大的应用面积可增强镇痛效果。
在福尔马林实验中观察到了一致的结果，该实验可区分神经源性（I相，0~10分钟）和炎症性（II相，15~30分钟）疼痛(图1B,C；补充表1)。对照组（NC组）表现出显著的疼痛相关行为（舔舐、抬足、逃避），其累计持续时间在I相为182 ± 5秒，II相为344 ± 8秒。XJCA治疗以作用面积依赖的方式缩短了这些持续时间，其中XJCALAAG组效...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
炎症和疼痛是涉及多条信号通路的复杂病理过程。外用制剂因其能够精准作用于病变部位并最大限度减少全身不良反应而日益受到青睐21,22。本研究以消 joint 止痛搽剂（XJCA）为例，成功建立并验证了一套系统性的方法学框架，用于评价外用中药制剂。该整合方法结合了精心设计的体内动物模型与定量的体外透皮吸收分析，有效验证了“体内疗效主要由关键成分的透皮动力学所驱动”这一假设。
该方法学框架依赖于若干关键操作步骤，为确保结果的可靠性和可重复性，这些步骤需特别关注。首先，在为Franz扩散池实验准备皮肤时，必须保持角质层的完整性；该屏障层的任何损伤都会人为地增加药物渗透，导致通量计算出现错误。其次，体内给药区域的标记（例如使用模板或标记笔）至关重要。即使给药面积存在微小偏差，也会直接影响药物总剂量，进一步干扰面积-效应关系。此外，在涂抹凝胶时，应采用一致的涂抹技术（即均匀涂抹凝胶，避免过度摩擦），以防止覆盖区域内药物浓度不均。同时，对于不稳定的分析物（如乌头碱），取样和处理的时...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
作者声明无利益冲突。
本研究由山东省泰山学者计划（tsqn20250730）、高校（四川大学）-企业（西藏红景天药业控股有限公司）合作项目（24H0764，24H1043）以及山东中医药大学扁鹊学者计划资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 μm 微孔膜滤器 | MilliporeSigma, Burlington, MA, USA | GSWP04700 | |
| 乙酸 | CNW Technologies GmbH | N3800060 | 色谱纯 |
| 乙腈 | Merck KGaA | I1241129242 | 质谱纯 |
| 乌头碱 | 成都乐美天医药科技有限公司 | DSTDW000602 | 20 mg，≥98% 纯度 |
| Agilent ZORBAX SB-C18 色谱柱 | Agilent | 2.1 × 100 mm，1.8 μm | |
| 乙酸铵 | GENERAL-REAGENT | P1492146 | 分析纯 |
| 苯甲酰乌头原碱 | 成都乐美天医药科技有限公司 | DSTDB005502 | 20 mg，≥98% 纯度 |
| 二氯甲烷 | 中景化学有限公司 | P3048495 | 分析纯 |
| 双氯芬酸二乙胺乳胶剂（DDE） | 诺华制药（北京）有限公司 | H20020176 | |
| 福尔马林溶液 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10010061 | |
| Franz 扩散池 | 深圳瑞拓分析仪器有限公司 | RT806 | |
| GraphPad Prism 9.0 软件 | GraphPad Software, Inc. | 版本 9.0 | |
| 异丙醇 | GENERAL-REAGENT | 0530240601D | 色谱纯 |
| 生理盐水 | 国药集团化学试剂有限公司 | SY15931 | |
| 戊巴比妥钠 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P3761 | |
| 纯化水 | 广州屈臣氏食品饮料有限公司 | 批号 20240717C | |
| SPF 级昆明小鼠 | 成都恩斯威生物科技有限公司 | 许可证号：SYXK（四川）2019-049 | |
| SPF 级 Sprague-Dawley 大鼠 | 北京斯贝福生物科技有限公司 | 许可证号：SYXK（北京）2024-0010 | |
| UPLC-MS/MS 系统 | Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA | Agilent 1260 Infinity | |
| 雪山金罗汉止痛涂膜剂（XJCA） | 西藏药业股份有限公司 | Z20010095 | |
| 二甲苯 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10023418 |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。