本文介绍了一种针对急性呼吸窘迫综合征（ARDS）大鼠模型肺组织进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析的标准化实验流程。该流程涵盖了从脂多糖（LPS）诱导模型建立到生物信息学分析的各个步骤，鉴定出21个细胞簇和6种巨噬细胞亚群，并揭示了参与ARDS发病机制的关键炎症通路。
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本文介绍了一种针对急性呼吸窘迫综合征（ARDS）大鼠模型肺组织进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析的标准化实验流程。该流程涵盖了从脂多糖（LPS）诱导模型建立到生物信息学分析的各个步骤，鉴定出21个细胞簇和6种巨噬细胞亚群，并揭示了参与ARDS发病机制的关键炎症通路。
急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种严重的炎症性肺部疾病，具有高死亡率，其特征是免疫反应失调和肺泡损伤，但其细胞异质性尚未被充分阐明。单细胞RNA测序（scRNA-seq）能够以前所未有的分辨率解析细胞类型特异性的机制，但其在ARDS中的应用受到技术变异性的限制。本文介绍了一种在脂多糖（LPS）诱导的大鼠ARDS模型中对肺组织进行scRNA-seq分析的标准化流程。该方法包括优化的组织解离、严格的质控、双细胞去除、批次效应校正，以及用于聚类、注释和差异表达分析的完整生物信息学流程。我们的方法可靠地鉴定了21种不同的细胞群体，并揭示了在ARDS中具有独特转录特征的6个巨噬细胞/单核细胞亚群。亚聚类特异性的差异基因表达和功能富集分析进一步识别出参与ARDS发病机制的关键基因和通路。这一可重复的工作流程有助于深入表征细胞多样性、炎症通路及潜在治疗靶点，为ARDS的机制研究和转化研究提供了坚实的基础。
急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种急性呼吸系统疾病，其特征为弥漫性肺部炎症和非心源性肺水肿，主要表现为进行性低氧血症和呼吸衰竭1,2。ARDS 的病理机制涉及炎症级联反应的失调、肺泡-毛细血管屏障的破坏，以及多种免疫细胞类型的异常活化与相互作用3,4。在 ARDS 的发展过程中，肺组织内的免疫细胞通过分泌炎症介质和调节免疫反应，驱动炎症级联反应，从而破坏肺血管内皮，触发外源性凝血级联反应的活化，并加剧肺损伤5,6,7。然而，目前对 ARDS 在细胞水平上的病理机制仍了解有限，这限制了特异性药物治疗的发展，当前的治疗策略主要依赖于各种形式的氧疗支持和机械通气1。深入解析 ARDS 发病过程中细胞异质性及其动态变化，对于发现新的治疗靶点和开发新型治疗策略具有重要意义8,9,10。
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购自北京维通利华实验动物技术有限公司（动物许可证号：SCXK (京) 2025-0008）的12只无特定病原体（SPF）级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，年龄6–7周，体重220 g ± 10 g。大鼠饲养于北京中医药大学东直门医院实验动物中心，符合中国国家标准化管理委员会发布的国家标准《实验动物 环境及设施要求》（GB 14925-2010）。实验程序经北京中医药大学东直门医院动物福利与伦理委员会批准（批准号：24-54）。所用试剂和设备列于材料表中。
1. 模型建立与样本采集
注意：实验前，将所有大鼠进行为期1周的适应性饲养，以尽量减少应激反应带来的影响。
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大鼠肺组织的HE染色显示，对照组肺泡结构清晰，炎症轻微；而ARDS模型组则表现出肺泡腔变形、肺泡壁增厚以及明显的炎性细胞浸润，相应肺损伤评分也证实了这一结果（图1A–E）。支气管肺泡灌洗液（BALF）和血清中IL-6、TNF-α和IL-1β水平升高，表明造模成功并引发了全身性炎症反应（图2A–F）。经质控后的单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析共鉴定出21个不同的细胞簇，涵盖主要的细胞类型、免疫细胞和结构细胞，并依据经典标志物进行分类；比较分析显示，ARDS模型组肺组织中巨噬细胞/单核细胞、中性粒细胞和树突状细胞的数量显著增加（图3A–D）。对巨噬细胞/单核细胞进行进一步重聚类分析，识别出六个亚群，包括M1型、M2型以及组织驻留型巨噬细胞（图4A–C）。针对每个.......
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本方案介绍了一种针对急性呼吸窘迫综合征（ARDS）大鼠模型肺组织进行单细胞RNA测序分析的标准化方法。实验结果表明，通过脂多糖（LPS）诱导成功建立了ARDS模型，组织病理学检查、肺损伤评分升高以及支气管肺泡灌洗液（BALF）和血清中炎症细胞因子水平升高均证实了该模型的可靠性。单细胞转录组分析鉴定了21个不同的细胞群体，在ARDS组织中，巨噬细胞/单核细胞、中性粒细胞和树突状细胞的数量显著增加。对巨噬细胞/单核细胞亚群的进一步分析识别出六个不同的聚类，包括M1型、M2型以及组织驻留型巨噬细胞，这些亚群在ARDS条件下表现出各自独特的转录特征。
本文所述方案解决了急性呼吸窘迫综合征（ARDS）单细胞研究中固有的若干关键技术难题。酶消化方法的选择对于成功释放细胞、同时维持细胞活力和表型至关重要30。我们采用了胶原酶/中性蛋白酶（Collagenase/Dispase）消化法，该方法在肺组织解离中已得到广泛验证，能够在高效释放细胞与保护表面标志物之间取得良好平衡。这一分步消化策略十分关键，因为过度消化会损害细胞活力并改变基因表达谱，而消化不.......
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作者无任何利益冲突需要披露。
作者希望感谢北京中医药大学东直门医院横向项目（HX-DZM-202114）的支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.4% 台盼蓝溶液 | Gibco, USA | 15250061 | |
| 4% 多聚甲醛 | Servicebio, China | G1101 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sangon Biotech, China | A600332-0005 | |
| 胶原酶 I | YEASEN, China | 40507ES60 | |
| CurveExpert | Hyams Development | v1.4 | |
| 分散酶 II | YEASEN, China | 40104ES60 | |
| 大肠杆菌脂多糖（LPS） | Sigma, USA | L6511 | |
| 苏木精-伊红（HE）染色试剂 | Solarbio, China | G1120 | |
| 高通量基因测序仪 | MGI Tech Co., Ltd | MGISEQ-2000RS | |
| 磷酸酶抑制剂 | Beyotime Biotechnology, China | P1081 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Solarbio, China | P1020 | |
| PMSF | Solarbio, China | R0010 | |
| R 软件 | Lucent Technologies, USA | v4.2.0 | |
| 大鼠 IL-1β ELISA 试剂盒 | 4abio, China | CRE0006 | |
| 大鼠 IL-6 ELISA 试剂盒 | 4abio, China | CRE0005 | |
| 大鼠 TNF-α ELISA 试剂盒 | 4abio, China | CRE0003 | |
| 红细胞（RBC）裂解缓冲液 | Solarbio, China | R1010 | |
| 红细胞裂解缓冲液 | Tiangen Biotech, China | RT122-1 | |
| 无 RNase 水 | Ambion, USA | AM9937 | |
| TE 缓冲液，pH 8.0 | Ambion, USA | AM9858 | |
| Tris-甘氨酸转移缓冲液 | Servicebio, China | G2017 |
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