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方法文章

急性呼吸窘迫综合征大鼠模型肺组织的单细胞RNA测序

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DOI：

10.3791/70491

⸱

2026年4月7日

 ,  , 
1Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine

本文内容

摘要

本文介绍了一种针对急性呼吸窘迫综合征（ARDS）大鼠模型肺组织进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析的标准化实验流程。该流程涵盖了从脂多糖（LPS）诱导模型建立到生物信息学分析的各个步骤，鉴定出21个细胞簇和6种巨噬细胞亚群，并揭示了参与ARDS发病机制的关键炎症通路。

摘要

急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种严重的炎症性肺部疾病，具有高死亡率，其特征是免疫反应失调和肺泡损伤，但其细胞异质性尚未被充分阐明。单细胞RNA测序（scRNA-seq）能够以前所未有的分辨率解析细胞类型特异性的机制，但其在ARDS中的应用受到技术变异性的限制。本文介绍了一种在脂多糖（LPS）诱导的大鼠ARDS模型中对肺组织进行scRNA-seq分析的标准化流程。该方法包括优化的组织解离、严格的质控、双细胞去除、批次效应校正，以及用于聚类、注释和差异表达分析的完整生物信息学流程。我们的方法可靠地鉴定了21种不同的细胞群体，并揭示了在ARDS中具有独特转录特征的6个巨噬细胞/单核细胞亚群。亚聚类特异性的差异基因表达和功能富集分析进一步识别出参与ARDS发病机制的关键基因和通路。这一可重复的工作流程有助于深入表征细胞多样性、炎症通路及潜在治疗靶点，为ARDS的机制研究和转化研究提供了坚实的基础。

引言

急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种急性呼吸系统疾病，其特征为弥漫性肺部炎症和非心源性肺水肿，主要表现为进行性低氧血症和呼吸衰竭1,2。ARDS 的病理机制涉及炎症级联反应的失调、肺泡-毛细血管屏障的破坏，以及多种免疫细胞类型的异常活化与相互作用3,4。在 ARDS 的发展过程中，肺组织内的免疫细胞通过分泌炎症介质和调节免疫反应，驱动炎症级联反应，从而破坏肺血管内皮，触发外源性凝血级联反应的活化，并加剧肺损伤5,6,7。然而，目前对 ARDS 在细胞水平上的病理机制仍了解有限，这限制了特异性药物治疗的发展，当前的治疗策略主要依赖于各种形式的氧疗支持和机械通气1。深入解析 ARDS 发病过程中细胞异质性及其动态变化，对于发现新的治疗靶点和开发新型治疗策略具有重要意义8,9,10。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的出现为RNA测序研究带来了革命性突破，使我们能够解析疾病发病机制中的细胞异质性与功能动态11,12。与传统的群体RNA测序相比，scRNA-seq技术能够识别稀有但关键的细胞亚群，揭示细胞状态转变的动态过程，并发现复杂的细胞间相互作用网络，而这些信息在群体水平分析中往往被掩盖13,14,15。近年来在急性呼吸窘迫综合征（ARDS）中的scRNA-seq研究已取得显著进展，包括鉴定出特异的单核细胞基因表达特征、发现异常的巨噬细胞极化模式，以及阐明促纤维化的细胞间通讯网络16,17,18,19。这些发现不仅加深了我们对ARDS病理生理机制的理解，也为生物标志物开发、疾病分型和精准治疗提供了新的思路20,21。

然而，目前急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的单细胞RNA测序（scRNA-seq）研究面临诸多挑战，包括方法学标准化不足、样本处理方案存在显著差异以及数据分析流程不一致等问题，这些因素限制了研究成果的可重复性及其在临床上的转化应用22,23。本实验方案通过优化组织处理、质量控制和数据分析等步骤，解决了ARDS肺组织scRNA-seq分析中的技术难题，从而为机制研究和治疗开发提供了基础。该标准化方法可确保不同实验室之间的结果可重复性，并促进ARDS研究中细胞异质性的比较分析。

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方案

购自北京维通利华实验动物技术有限公司（动物许可证号：SCXK (京) 2025-0008）的12只无特定病原体（SPF）级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，年龄6–7周，体重220 g ± 10 g。大鼠饲养于北京中医药大学东直门医院实验动物中心，符合中国国家标准化管理委员会发布的国家标准《实验动物 环境及设施要求》（GB 14925-2010）。实验程序经北京中医药大学东直门医院动物福利与伦理委员会批准（批准号：24-54）。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 模型建立与样本采集

注意：实验前，将所有大鼠进行为期1周的适应性饲养，以尽量减少应激反应带来的影响。

  1. 将大肠杆菌脂多糖（LPS）溶于0.9%生理盐水中，配制成0.4 mg/mL的LPS溶液。
  2. 将12只SPF级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为两组：对照组（n = 6）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）模型组（n = 6）。
  3. 注射0.9%生理盐水 通过 对照组以0.5 mL/100g体重的剂量进行气管内注射。
  4. 给予0.4 mg/mL的LPS溶液 通过 经气管注入相同体积（0.5 mL/100 g）的液体至ARDS模型组，16小时后，采用异氟烷（按照机构批准的方案）麻醉大鼠。
  5. 采集血液 通过 腹主动脉，然后离心（4 °C，1000 × g，30 分钟）以获取血清。
  6. 打开胸腔并取出肺组织。
  7. 进行支气管肺泡灌洗 通过 使用注射器冲洗支气管残端以获取支气管肺泡灌洗液（BALF）24,25.
  8. 取右肺叶，用PBS冲洗，用于后续病理学检查。
  9. 收获左肺叶，用PBS冲洗，用于后续单细胞测序和分子生物学实验26,27.

2. 肺组织的组织病理学评估

  1. 将收获的大鼠右肺组织浸入4%多聚甲醛中固定12小时。
  2. 固定后，依次通过梯度乙醇（70%、80%、90%、95%、100%和100%）脱水，每种浓度处理2小时。
  3. 用二甲苯处理脱水后的组织，直至组织变透明。
  4. 将透明化的组织置于60 °C烘箱中，用熔融石蜡浸润2小时。
  5. 将浸透的组织块放入包埋模具中，加入新鲜石蜡，冷却并凝固成石蜡块。
  6. 使用切片机将石蜡块切成4 μm厚的切片，在45 °C水浴中展平切片，然后用聚-L-赖氨酸包被的载玻片捞取切片。
  7. 将载玻片置于60 °C烘箱中烘烤，以确保切片牢固附着于载玻片上。
  8. 将切片浸入二甲苯中脱蜡，并通过递减浓度的乙醇（100%、95%、90%、80%和70%）进行再水化。
  9. 用PBS冲洗切片，进行苏木精-伊红（HE）染色，然后用中性树脂封片。
  10. 采用标准化评分系统，在全片扫描切片上评估肺损伤，评分依据包括中性粒细胞浸润、间质性炎症、水肿和充血。
    注：每个参数根据病理受累程度评分，范围为0至4：0（无）；1（≤25%）；2（26–50%）；3（51–75%）；4（>75%）28,29。

3. 酶联免疫吸附测定

注意：如果在样本获取后无法立即进行分析，可将样本保存在 -80 °C 条件下。

  1. 溶解标准品，并在室温下静置15分钟，然后根据制造商说明书进行系列稀释。
  2. 按照说明书配制生物素化抗体工作液、酶结合物工作液和洗涤缓冲液。
  3. 向包被抗体的微孔中加入100 μL每种样品或100 μL系列稀释的标准品，在37 °C孵育90分钟。
  4. 使用洗板机洗涤微孔板4次，每孔加入100 μL生物素化抗体工作液，在37 °C孵育30分钟。
  5. 再次洗涤微孔板4次，每孔加入100 μL酶结合物工作液，在37 °C孵育30分钟。
  6. 每孔加入100 μL底物溶液，在37 °C避光孵育10分钟。
  7. 每孔加入100 μL终止液，轻轻混匀，使用酶标仪在450 nm处测定各孔的光密度（OD）值。
  8. 使用指定软件，以标准品浓度为横坐标、OD值为纵坐标绘制标准曲线。
  9. 根据测得的OD值和标准曲线确定样品浓度。

4. 测序用单细胞悬液的制备

注意：获取肺组织后，应立即将其置于冰上并及时处理，以保持细胞活性。

  1. 用预冷至 4 °C 的 PBS 清洗肺组织 3 次。
  2. 加入 2 mL 预冷的 PBS，再用无菌剪刀将组织进一步剪碎成约 0.5 mm3 大小的碎片。
  3. 使用巴斯德移液管将剪碎的组织连同 PBS 一起转移至 15 mL 离心管中。
  4. 向培养皿中额外加入 1 mL 预冷至 4 °C 的 PBS，冲洗并重悬残留的组织碎片，然后将悬液转移至同一离心管中。
  5. 用预冷至 4 °C 的 PBS 调整体积至 6.5 mL，加入含有胶原酶 I（100 U/mL）和分散酶 II（1 U/mL）的酶溶液消化组织碎片，并在室温下轻轻振荡孵育 30 分钟。
  6. 当组织碎片变为半透明且无明显固体块状物残留时，将消化后的组织依次通过 70 μm 和 40 μm 细胞筛过滤，然后离心（4 °C，500 × g，5 分钟），弃去上清液。
  7. 立即将沉淀物重悬于 3 mL 红细胞（RBC）裂解缓冲液中，用移液器轻轻混匀，在冰上裂解 10 分钟。
  8. 当上清液呈淡黄色或接近无色时，加入 7 mL PBS 终止反应，离心（4 °C，500 × g，5 分钟），弃去上清液。
  9. 加入 3 mL PBS 重悬细胞，使用台盼蓝染色法测定细胞浓度和活力。
    注意：若细胞活力低于 70%，需进行死细胞去除操作。
  10. 用含 0.04% 牛血清白蛋白（BSA）的 DPBS 洗涤缓冲液洗涤细胞两次。
  11. 重悬细胞进行计数，并将浓度调整至 1,000 个细胞/μL，用于后续上样和检测。

5. 单细胞测序数据的质量控制

注意：单细胞RNA文库使用基于液滴的单细胞文库构建方法，从细胞悬液中制备。文库采用基于DNA纳米球的测序化学技术在高通量测序平台上进行测序。每个文库上样约21,000个细胞，目标细胞回收率约为60%。每个文库测序共产生5.0 × 108条读长，平均每细胞测序深度为30,000–40,000条读长。原始测序数据通过相应的单细胞RNA分析流程进行处理，以生成每个样本的基因表达矩阵。

  1. 通过PCR和条形码标记构建Oligo文库，确保浓度>10 ng/μL，峰值大小为180 bp ±10 bp。
  2. 通过片段化、末端修复、接头连接和PCR构建cDNA文库，确保浓度>10 ng/μL，峰值大小为350–550 bp。
  3. 在R软件（v4.2.0）中使用Seurat包（v4.3.0）的Read10X函数，从基因表达矩阵为每个样本生成Seurat对象。
  4. 通过过滤线粒体基因比例>10%或血红蛋白基因比例>5%的细胞，去除低质量细胞。
  5. 使用"LogNormalize"方法对数据进行归一化处理，缩放因子设为10,000。
  6. 采用"vst"方法识别高度可变特征，并保留前2,000个基因用于下游分析。
  7. 使用Seurat内置的细胞周期标志基因进行细胞周期评分，并在数据缩放过程中校正细胞周期效应（G2M.Score和S.Score）。
  8. 使用DoubletFinder（v2.0.3）检测并去除潜在的双细胞，参数设置为pN = 0.25，pK = 0.09，预期双细胞率为0.06，并将这些双细胞从后续分析中排除。
  9. 使用Harmony包（v0.1.1）校正样本间的批次效应，参数设置为theta = 2，max.iter.harmony = 20。
  10. 向Seurat对象的元数据中添加个体样本名称以及ARDS模型组和对照组分组信息的列。

6. 降维、聚类与细胞类型注释

  1. 使用 Seurat 中的 RunPCA 函数对高变基因进行主成分分析（PCA）。
  2. 通过 ElbowPlot 可视化确定最佳主成分数量。
  3. 通过应用Leiden算法鉴定主要细胞簇 通过 Seurat 的 FindClusters 函数和 FindNeighbors 函数，分辨率为 0.1。
  4. 使用选定的主成分进行UMAP降维。
  5. 使用 FindAllMarkers 函数识别标记基因以注释细胞类型。
  6. 使用 DotPlot 函数可视化不同细胞类型中标志基因的表达。
  7. 向元数据中添加细胞注释结果的新信息列，并使用 Umap 可视化细胞类型注释。
  8. 使用 dplyr 函数计算每种已鉴定细胞类型中各实验组的细胞比例，通过计数细胞并计算百分比。
  9. 使用 ggplot2 生成堆叠柱状图，以展示每种细胞类型的群体组成，包括百分比标签及组间统计比较。

7. 亚群分析

  1. 使用 subset 函数提取目标细胞亚群，并创建相应的 Seurat 对象，用于下游的亚群水平分析。
  2. 对亚群数据进行重新标准化和重新缩放，同时校正线粒体基因、血红蛋白基因、UMI 计数和细胞周期评分的影响。
  3. 对亚群进行二次 PCA 分析，并应用 Harmony 批次校正方法。
  4. 使用 FindNeighbors 和 FindClusters 函数进行重新聚类，以识别目标细胞亚群内的不同亚型。
  5. 生成新的 UMAP 嵌入图，并按照此前所述方法对亚群聚类进行可视化，标注细胞类型。

8. 差异基因表达分析

  1. 使用 MAST 统计方法，针对每个亚群组鉴定急性呼吸窘迫综合征（ARDS）模型组与对照组之间的差异表达基因（DEGs）。
  2. 在差异表达分析过程中，引入潜在变量回归以校正测序深度对结果的影响。
  3. 利用 FindMarkers 函数，根据预定义的对数倍数变化阈值和校正后的 p 值对差异表达基因进行筛选。
  4. 使用 ggplot 函数为每个亚群组生成火山图，以可视化展示具有显著性标注的差异基因表达模式。
  5. 导出差异表达基因结果，并构建全面的汇总表格，以支持后续的功能富集分析及其他下游分析。

9. 富集分析

  1. 使用 org.Rn.eg.db 注释数据库将基因符号映射到 ENTREZ ID，以兼容通路分析。
  2. 整合所有亚聚类中的差异表达基因（DEGs），并根据对数倍数变化阈值和校正后的 p 值（Wilcoxon 秩和检验，logfc.threshold = 0.25，p_val < 0.05）筛选显著性基因。
  3. 使用 enrichGO 函数进行基因本体（GO）富集分析，涵盖生物过程（Biological Process）、分子功能（Molecular Function）和细胞组分（Cellular Component）本体类别，并采用 Benjamini-Hochberg 校正方法。
  4. 使用 enrichKEGG 函数对大鼠物种数据库进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，并应用统计学显著性阈值。
  5. 使用 dotplot 函数生成 GO 和 KEGG 富集结果的点图，展示基因比例和校正后 p 值最高的前 15 个显著富集条目。
  6. 将富集分析结果导出为 CSV 文件，并保存可视化图表，以便全面解读通路分析结果。

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结果

大鼠肺组织的HE染色显示，对照组肺泡结构清晰，炎症轻微；而ARDS模型组则表现出肺泡腔变形、肺泡壁增厚以及明显的炎性细胞浸润，相应肺损伤评分也证实了这一结果（图1A–E）。支气管肺泡灌洗液（BALF）和血清中IL-6、TNF-α和IL-1β水平升高，表明造模成功并引发了全身性炎症反应（图2A–F）。经质控后的单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析共鉴定出21个不同的细胞簇，涵盖主要的细胞类型、免疫细胞和结构细胞，并依据经典标志物进行分类；比较分析显示，ARDS模型组肺组织中巨噬细胞/单核细胞、中性粒细胞和树突状细胞的数量显著增加（图3A–D）。对巨噬细胞/单核细胞进行进一步重聚类分析，识别出六个亚群，包括M1型、M2型以及组织驻留型巨噬细胞（图4A–C）。针对每个...

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讨论

本方案介绍了一种针对急性呼吸窘迫综合征（ARDS）大鼠模型肺组织进行单细胞RNA测序分析的标准化方法。实验结果表明，通过脂多糖（LPS）诱导成功建立了ARDS模型，组织病理学检查、肺损伤评分升高以及支气管肺泡灌洗液（BALF）和血清中炎症细胞因子水平升高均证实了该模型的可靠性。单细胞转录组分析鉴定了21个不同的细胞群体，在ARDS组织中，巨噬细胞/单核细胞、中性粒细胞和树突状细胞的数量显著增加。对巨噬细胞/单核细胞亚群的进一步分析识别出六个不同的聚类，包括M1型、M2型以及组织驻留型巨噬细胞，这些亚群在ARDS条件下表现出各自独特的转录特征。

本文所述方案解决了急性呼吸窘迫综合征（ARDS）单细胞研究中固有的若干关键技术难题。酶消化方法的选择对于成功释放细胞、同时维持细胞活力和表型至关重要30。我们采用了胶原酶/中性蛋白酶（Collagenase/Dispase）消化法，该方法在肺组织解离中已得到广泛验证，能够在高效释放细胞与保护表面标志物之间取得良好平衡。这一分步消化策略十分关键，因为过度消化会损害细胞活力并改变基因表达谱，而消化不...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者希望感谢北京中医药大学东直门医院横向项目（HX-DZM-202114）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.4% 台盼蓝溶液Gibco, USA15250061
4% 多聚甲醛Servicebio, ChinaG1101
牛血清白蛋白（BSA） Sangon Biotech, ChinaA600332-0005
胶原酶 IYEASEN, China40507ES60
CurveExpertHyams Developmentv1.4
分散酶 IIYEASEN, China40104ES60
大肠杆菌脂多糖（LPS） Sigma, USAL6511
苏木精-伊红（HE）染色试剂Solarbio, ChinaG1120
高通量基因测序仪 MGI Tech Co., LtdMGISEQ-2000RS
磷酸酶抑制剂Beyotime Biotechnology, ChinaP1081
磷酸盐缓冲液Solarbio, ChinaP1020
PMSFSolarbio, ChinaR0010
R 软件 Lucent Technologies, USAv4.2.0
大鼠 IL-1β ELISA 试剂盒4abio, ChinaCRE0006
大鼠 IL-6 ELISA 试剂盒4abio, ChinaCRE0005
大鼠 TNF-α ELISA 试剂盒4abio, ChinaCRE0003
红细胞（RBC）裂解缓冲液Solarbio, ChinaR1010
红细胞裂解缓冲液Tiangen Biotech, ChinaRT122-1
无 RNase 水Ambion, USAAM9937
TE 缓冲液，pH 8.0Ambion, USAAM9858
Tris-甘氨酸转移缓冲液Servicebio, ChinaG2017

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