本方案建立了一种大鼠慢性运动诱导的生理性应激模型，用于研究应激反应。通过血清生化分析和组织病理学检测，可对水蛭疗法与运动相互作用进行可控性评估。该模型为研究运动后恢复机制提供了可重复的实验框架。
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本方案建立了一种大鼠慢性运动诱导的生理性应激模型，用于研究应激反应。通过血清生化分析和组织病理学检测，可对水蛭疗法与运动相互作用进行可控性评估。该模型为研究运动后恢复机制提供了可重复的实验框架。
长期运动可诱导一种以肌肉损伤、氧化失衡和激素改变为特征的生理性应激，可能影响恢复能力与运动表现。水蛭疗法是一种传统生物治疗手段，含有抗炎、抗氧化及促进血液循环的成分，近年来被视为一种潜在的天然恢复策略而受到关注。本研究旨在评估水蛭疗法在运动诱导生理性应激大鼠模型中，对长期运动后生化及组织病理学指标的影响。将32只雄性大鼠分为四组：对照组、水蛭疗法组、运动组以及水蛭疗法加运动组。分析血清生化参数和氧化应激标志物，并对骨骼肌和肝脏组织进行组织病理学检查，以评估运动引起的改变及水蛭疗法的潜在调节作用。接受长期运动的大鼠表现出明显的生理应激生化与结构指标。水蛭疗法与这些改变的部分减轻相关，尤其在组织病理学结果中较为明显，但氧化应激标志物的变化无统计学意义。这些结果提示，水蛭疗法可能对运动后恢复过程具有一定的调节作用；然而，仍需进一步研究以明确其对氧化应激通路的影响。
传统医学实践已在多种临床环境中用于治疗各种急性和慢性疾病1,2。其中，医用蛭类疗法（水蛭疗法）在不同文化和医学体系中具有悠久的应用历史。近年来，由于该疗法在多种临床疾病中展现出潜在的治疗作用，包括炎症性疾病、骨关节炎和血管疾病等，重新引起了科学界的关注1,2,3。这些作用主要归因于水蛭唾液中存在的多种生物活性分子混合物，这些分子具有抗凝血、抗炎和抗菌特性3,4,5。此外，在动物模型中的实验研究还表明，水蛭疗法可能通过抗氧化、抗炎和抗凋亡机制对组织损伤发挥保护作用6。
Hirudo verbana 是治疗中最常用的医用水蛭种类，其唾液含有多种生物活性成分，包括水蛭素（hirudin）、博莱蛋白（bdellin）、依格兰（eglin）、卡林素（calin），以及透明质酸酶等酶类和多种小分子代谢物。这些成分具有抗凝血、抗炎、抗氧化、溶纤、镇痛及抗癌等生物活性2,7。广泛的生物学活性提示，水蛭唾液（LS）可能在现代生物医学应用中作为辅助治疗手段；然而，其在特定生理应激条件下的全身性作用仍尚未完全阐明3。
剧烈或长时间的体力活动可导致肌肉膜出现微结构损伤，从而显著升高血清中肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）等酶的水平。丙氨酸氨基转移酶（ALT）在肌肉损伤后也可能升高，但通常幅度小于AST5,8,9。此外，高强度或长时间运动可引发皮质醇（一种关键的应激激素）水平上升，其反应程度因运动强度、持续时间及个体生理状态而异10,11。运动后血糖升高也可能发生，主要由皮质醇介导的糖异生作用驱动，是代谢应激反应的典型特征12。综上所述，这些发现表明，剧烈运动后肌肉损伤的生化标志物和代谢应激的指标均趋于升高5。
已研究多种策略，包括按摩、冷水浸浴以及富含抗氧化剂的营养补充剂（如多酚、酸樱桃提取物和姜黄素），以探索其在促进运动后恢复方面的潜在作用。系统性综述表明，这些干预措施可能影响氧化应激和肌肉损伤相关指标；然而，其效果在个体间存在显著差异，且未必能持续提供足够的生化保护13,14,15。因此，人们日益关注探索其他替代性或辅助性方法，以在运动诱发的生理应激条件下提供额外益处。在此背景下，已有研究报道水蛭唾液中的生物活性化合物可调节氧化应激和炎症反应7。此外，临床观察表明，水蛭疗法可能减轻疼痛和炎症，尤其在肌肉骨骼系统和血管疾病中具有应用潜力1。
在水蛭唾液（LS）中鉴定出的多种化合物，包括黄酮类、酚类分子及其他生物活性成分，可通过调节氧化应激通路减轻炎症反应。这些抗氧化特性可能与其他唾液成分产生协同作用，从而增强水蛭疗法的整体抗炎潜力7,16。此外，蛋白酶抑制剂如bdellin和eglin已被证实可降低中性粒细胞来源酶的活性，从而限制组织损伤4。进一步研究表明，从水蛭组织中鉴定出的多种肽类和脂质衍生物分子可抑制炎症信号通路的激活17。
尽管有这些发现，水蛭疗法在运动诱导的生理应激中的潜在作用仍缺乏充分研究，尤其是在受控的实验模型中1,2,4。尽管先前的研究已证实水蛭疗法具有抗炎、抗凝血和改善微循环的作用，且运动已知会引发肌肉损伤和氧化应激反应18，但在同一实验框架内整合生化、激素和组织病理学结果的研究仍然有限。
因此，本研究旨在通过整合生化、激素和组织病理学指标，在可控的运动诱导生理应激模型中对水蛭疗法进行全面的实验评估。这一多维度方法旨在增进对水蛭疗法潜在调节作用的理解，并为评估补充性生物治疗干预措施提供可重复的框架。
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所有实验操作均按照 ARRIVE 指南进行19。本研究方案已通过克尔谢希尔阿希·埃夫兰大学动物实验地方伦理委员会审查并批准（批准号：06/03/2025-05-1，Türkiye）。所有操作均符合机构关于实验动物护理和使用的指南。所用试剂和设备列于材料表中。
1. 动物选择与饲养
使用32只雄性Wistar白化大鼠（RRID: RGD_2308852；8–12周龄，200–250 g）。动物单独饲养在聚碳酸酯笼子（40 cm × 25 cm × 20 cm）中，垫有木屑 bedding。环境温度维持在22–24 °C，光照周期为12小时光照/12小时黑暗。自由供应食物和水 随意摄取.
实验前进行了为期1周的适应期。在此期间，每天监测动物的摄食量、水合状态、理毛行为和运动活动。仅纳入表现出正常生理行为的动物。
2. 实验分组与随机化
采用计算机生成的随机化序列将动物随机分配至四个实验组（每组 n = 8）。在分组前为动物分配数字编号，以确保分配隐蔽性。实验组包括对照组（C），该组不接受任何干预；运动组（E），仅进行跑步机运动；水蛭疗法组（H），每周接受三次单独的水蛭疗法；以及联合治疗组（HE），根据研究方案同时接受水蛭疗法和运动干预。所有干预均在为期2周的时间内进行。为尽量减少昼夜节律变异，所有操作均在上午09:00至11:00之间完成。
3. 慢性运动方案
使用配备可调式电刺激网格的电动啮齿类动物跑台进行运动实验。将动物置于跑台装置的独立跑道中（图1进行为期2天的适应期，速度为15 m/min，每天持续15分钟。适应期结束后，运动强度增加至20 m/min，动物每天进行45分钟的跑步训练，持续2周。施加轻微电刺激（1.0 mA） 通过 必要时调整网格以保持连续运行。
4. 安乐死与采血
实验结束时（末次干预后24小时）6动物经腹腔注射氯胺酮（75 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行麻醉。通过检查足底回缩反射和角膜反射消失确认麻醉深度。随后使用无菌5 mL注射器进行心内采血。 通过 左心室穿刺。通过放血并随后进行胸廓切开术完成安乐死。随后取内侧腓肠肌和肝组织用于进一步分析。血液样本在采集后1小时内进行处理，转移至含凝血活化剂的采血管中，并以1,000 × g 在4 °C下离心15分钟。分离后的血清被分装成每份200 µL，于−80 °C保存直至分析。
5. 生物化学与ELISA分析
采用全自动生化分析仪，根据标准化的实验室操作规程检测了包括丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、葡萄糖、电解质和皮质醇在内的生化指标。所有针对CAT、SOD、MDA和GPX的ELISA检测均在标准化条件下严格按照试剂盒说明书进行。根据试剂盒方案要求，血清样本在必要时用样本稀释液按1:5比例稀释。随后，向指定孔中分别加入50 µL标准品和50 µL血清样本，在37 °C孵育60分钟。孵育结束后，使用提供的洗涤缓冲液将板孔洗涤五次，以去除未结合的成分。然后每孔加入50 µL检测抗体，在37 °C孵育30分钟。接着加入底物溶液，反应混合物在避光条件下孵育10–15分钟以显色。通过加入50 µL终止液终止反应，并使用酶标仪在450 nm波长下测定各孔的光密度值。所有样本均设复孔检测，以确保分析结果的可靠性和可重复性。
6. 组织病理学分析
进行组织病理学评估时，组织样本按照标准的组织病理学操作流程进行处理22。组织首先在10%中性缓冲甲醛溶液中固定72小时，随后通过梯度乙醇系列进行脱水，依次为50%、70%、80%、96%和100%乙醇，每个浓度孵育1小时。脱水完成后，组织在二甲苯中连续澄清两次，每次30分钟，随后包埋于石蜡块中。使用旋转式切片机切取厚度为5 µm的切片，并采用苏木精和伊红（H&E）以及马松三色染色法进行染色，以供组织学检查。最后，使用配备数字成像系统的光学显微镜观察染色切片。
7. 统计分析
采用统计学软件进行数据分析。使用 Kolmogorov–Smirnov 检验评估数据分布情况。对于正态分布的数据，采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行 Tukey 事后检验；对于非正态分布的数据，则采用 Kruskal–Wallis 检验，随后进行 Mann–Whitney U 检验。以 p 值 < 0.05 为具有统计学意义。
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肌肉损伤与疲劳参数
血清肌肉损伤标志物显示，各组之间的肌酸激酶（CK）水平差异具有统计学意义（p < 0.05）。尽管运动组（E组）的乳酸脱氢酶（LDH）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）数值呈上升趋势，但这些变化无统计学意义（p > 0.05）。CK浓度在E组中最高，而HE组则显著降低，接近对照组和H组水平，表明水蛭疗法对运动诱导的肌肉应激具有缓解作用（图3A–D）。
氧化应激与抗氧化参数
SOD、GPX 和 MDA 水平在各组之间差异无统计学意义（p > 0.05），尽管 HE 组呈现轻微上升趋势。相比之下，E 组的 CAT 活性显著高于 C、H 和 HE 组（p < 0.05–0.001）...
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本研究证明，水蛭疗法与运动诱导的生理应激相关某些参数的可测量变化有关。运动组中肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT）的升高反映了肌膜破坏及酶泄漏，这与既往研究一致，这些标志物被描述为肌肉劳损的指标23,24,25。相比之下，水蛭疗法组（HE组）的酶水平更接近对照组值（图3A–D），且该生化特征在组织学上得到支持，表现为肌肉纤维结构相对完整，肌肉和肝脏组织中的坏死性改变减少（图7 和 图8）。这些结果提示，水蛭疗法可能有助于维持慢性运动后的组织完整性。
本研究的一个关键优势在于运动模型和水蛭疗法干预措施均采用了标准化且可重复的设计。通过受控...
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感谢克尔谢希尔阿希·埃夫兰大学实验研究实验室工作人员在动物护理和样本采集方面提供的支持。同时感谢组织处理和生化分析过程中，组织学与生物化学实验室提供的宝贵技术支持。本研究由克尔谢希尔阿希·埃夫兰大学科研项目协调单位（BAP）资助，项目编号：TIP.A2.25.004。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| -80°C 超低温冰箱（型号 DF590） | Nüve | DF590 | 用于在 −80°C 下储存样品 |
| 丙烯酸固定管 | N/A | N/A | 透明丙烯酸固定装置（直径 6 cm，长度 20 cm），用于水蛭疗法期间固定动物 |
| 全自动生化分析仪（Alinity） | Abbott | N/A | 用于血清生化参数分析 |
| 自动组织脱水机 | Leica Biosystems | N/A | 组织脱水及石蜡浸润 |
| 离心机（型号 FC5706） | OHAUS Corporation | FC5706 | 最高转速：6000 rpm（≈ 4,000 × g，具体取决于转子半径） |
| 数码显微镜相机（Axiocam 208 color） | Carl Zeiss | Axiocam 208 color | 用于组织病理学图像采集 |
| 伊红 Y（微黄色） | Merck / Sigma-Aldrich | 1.15935.0025 | H&E 染色（伊红组分） |
| 无水乙醇（99.5%） | Tekkim Kimya | TK.200655.05001 | 用于乙醇梯度脱水 |
| 甲醛溶液（~37%） | Merck / Sigma-Aldrich | 1.04002.2500 | 用于组织固定 |
| 哈里斯苏木精溶液 | BESTLAB | BS-002 | H&E 染色（苏木精组分） |
| 盐酸氯胺酮 | 药用级（商业来源未指明） | N/A | 用于腹腔麻醉（75 mg/kg） |
| 光学显微镜（Primo Star） | Carl Zeiss | Primo Star | 组织病理学成像 |
| Masson’s 三色染色试剂盒 | GBL | REF 5022 | 用于结缔组织染色 |
| 电动啮齿类动物跑台 | Columbus Instruments | Exer-3/6 | 用于标准化跑台运动实验，可控制速度和电刺激 |
| 大鼠过氧化氢酶（CAT）ELISA 试剂盒 | BT LAB | E0869Ra | 96 孔板；用于血清 CAT 活性测定 |
| 大鼠谷胱甘肽过氧化物酶（GPX1）ELISA 试剂盒 | Reed Biotech | RE2557R | 96 孔板；用于血清 CAT 活性测定 |
| 大鼠丙二醛（MDA）ELISA 试剂盒 | BT LAB | E0156Ra | 96 孔板；用于血清 CAT 活性测定 |
| 大鼠超氧化物歧化酶（SOD）ELISA 试剂盒 | BT LAB | E0168Ra | 96 孔板；用于血清 CAT 活性测定 |
| 轮转式切片机（Autocut） | Leica Biosystems | RM Autocut | 切割 5 μm 石蜡切片 |
| 载玻片烘片台 | Leica Biosystems | HI1210 | 用于干燥组织学载玻片 |
| 盐酸赛拉嗪 | 药用级（商业来源未指明） | N/A | 用于腹腔麻醉（10 mg/kg） |
| 二甲苯（异构体混合物） | Tekkim Kimya | TK.090270.05003 | 石蜡包埋前组织透明化处理 |
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