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利用高密度微电极阵列研究苍白球深部脑刺激的全网络作用机制

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DOI：

10.3791/70507

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2026年6月16日

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1Oscar Langendorff Institute of Physiology, University Medical Center Rostock, 2Institute of General Electrical Engineering, University of Rostock, 3Institute for Pharmacology, Pharmacy and Toxicology, University of Leipzig, 4Institute of Applied Microelectronics and Computer Engineering, University of Rostock

本文内容

摘要

在此，我们描述了一种实验方案 离体 从接受治疗的肌张力障碍仓鼠模型的急性小脑脑片中进行高密度微电极阵列记录 体内 持续11天的苍白球深部脑刺激

摘要

肌张力障碍是一种神经系统运动障碍，其特征是肌肉控制异常，影响自主运动和维持姿势的能力。尽管肌张力障碍与基底节功能障碍相关，但越来越多的证据表明小脑也参与了其病理生理过程。本实验方案介绍了一种在肌张力障碍仓鼠模型（dtsz 仓鼠）中进行的在体苍白球深部脑刺激（DBS），并结合离体 高密度微电极阵列（HD-MEA）记录技术，用于研究小脑活动。该方案包括：（1）DBS手术以植入电极和刺激器，（2）急性小脑切片制备，（3）高分辨率电生理记录，以及（4）数据分析。代表性结果表明，持续11天的苍白球DBS使分子层、浦肯野细胞层和颗粒层的放电活动恢复至接近正常水平，提示小脑网络参与了肌张力障碍的调控。本方案可实现对小脑活动及其受DBS调节作用的详细分析，为研究神经调控疗法背后的神经网络机制提供了一个平台。

引言

肌张力障碍是第三常见的运动障碍1，其特征为独特的临床体征和症状2,3，尽管有时可能被误诊为其他运动障碍4,5,6。最显著的临床特征包括不自主的肌肉收缩、重复性运动以及异常和/或扭曲的姿势7。这些特征可能伴随疼痛、运动功能受损和疲劳等症状，在压力、焦虑或身体极度疲劳期间可能加重8,9,10,11。肌张力障碍的病理生理机制尚未完全阐明12,13。尽管传统研究主要集中在基底神经节，但越来越多的证据支持该疾病是一种涉及多个脑区的网络性障碍，其中包括小脑14,15,16,17。本方案旨在研究小脑皮层不同层次的细胞外网络活动，以阐明其在肌张力障碍病理生理中的作用，并理解深部脑刺激（DBS）的全网络作用机制。

以苍白球内侧部（GPi）或丘脑底核（STN）为靶点的深部脑刺激（DBS）常用于治疗某些类型的肌张力障碍18,19，尤其是那些耐药的病原体。此外，治疗效果具有异质性和不可预测性，临床表现相似的患者可能对相同的治疗方案产生不同的反应。20对潜在肌张力障碍的神经网络获得更全面的理解，可能改善治疗效果21因此，需要大规模的实验方法，而这些方法只能通过动物模型中的临床前研究来实现。结合 体内 DBS 实验与 离体 高密度微电极阵列（HD-MEA）记录可实现对（近乎）生理状态下神经元网络活动的高分辨率监测，有助于深入理解肌张力障碍的病理生理机制以及深部脑刺激（DBS）的作用机理。

基底神经节和小脑各自通过与初级运动皮层（M1）的连接，在不同程度上影响运动控制22。一项针对纹状体损伤及小脑切除的解剖学研究支持了这一观点23。在本研究中，我们采用了肌张力障碍型 dtsz 仓鼠作为动物模型24,25，该模型表现出与肌张力障碍相关的小脑异常26。利用高密度微电极阵列（HD-MEAs），我们研究了肌张力障碍仓鼠与健康仓鼠的小脑皮层网络活动。然而，传统的电生理方法缺乏足够的空间分辨率以捕捉特定层的网络动态，而本方法克服了这一局限性。此外，我们还研究了苍白球内侧部深部脑刺激对小脑皮层网络的影响。

HD-MEA 系统具有能够并行记录详细电生理信号的优势，可实现对小脑皮层各层（颗粒层、浦肯野层和分子层）的分析，而每一层在运动序列的处理过程中均发挥着关键作用27。颗粒层由密集排列的颗粒细胞组成，接收来自苔藓纤维的感觉和运动信息，并在进一步处理前完成初始信号整合27。浦肯野层包含浦肯野细胞，向小脑深部核团传递抑制性信号，而颗粒层和分子层则对输出信号进行调节。分子层富含树突和中间神经元，通过与浦肯野细胞的突触相互作用实现复杂的信号调控，从而精细调节运动输出28。与其它记录技术不同，HD-MEA 不受空间分辨率或采样区域的限制，因此能够捕捉到肌张力障碍中各层在神经动力学改变方面的独特贡献15。该方法相较于单电极或低密度记录技术，具有更高的空间分辨率和并行记录能力。目前已有基于互补金属氧化物半导体（CMOS）29,30 技术并结合有源像素传感器（APS）概念的 HD-MEA 系统，可实现功能性成像，用于随时间可视化大量神经元的电活动31,32。利用该技术，可监测小脑皮层各层的动力学变化，并通过灌注不同物质来研究特定的突触传递过程。该方法特别适用于研究复杂神经元网络活动以及神经系统疾病模型中各层特异性的改变。

本研究解决了刺激系统封装方面的技术难题，以及 组织制备、数据采集以及大规模电生理数据集的分析。通过本研究，我们提供了一种选择方案 体外 对高度复杂的神经元处理过程进行研究，一方面有助于更深入地理解肌张力障碍性神经网络中的病理生理动力学，另一方面可提供关于深部脑刺激（DBS）治疗作用机制的知识。

方案

使用肌张力障碍型 dtsz 仓鼠及对照组叙利亚金黄仓鼠用于实验26总共在本研究中考察了四个实验组：（1）非肌张力障碍对照组仓鼠（野生型，WT），（2）未经处理的天然dtsz 仓鼠，(3) dtsz-假手术组（进行植入操作，但无主动刺激）和（4）dtsz-脑深部电刺激（含持续性脑深部电刺激） 体内 在脑片制备前饲养11天。所有动物实验均依照欧盟指令2010/63/EU以及联邦动物保护法律进行，并在许可证7221.3-1-029/20下开展。

1. 动物

  1. 在 GV Solas33 规定的标准条件下饲养动物，光照周期为 14 小时光照 / 10 小时黑暗，并可自由获取水和食物（金黄地鼠标准饲料，Altromin）。
  2. 在 20 ± 1 天和 27 ± 4 日龄时，采用三重刺激技术26 对 dtsz 突变型金黄地鼠进行肌张力障碍症状的筛查。
    注意：该标准化的轻度应激程序包括将金黄地鼠从其居住笼中移出并转移至一个新的空笼中，随后进行腹腔或皮下注射生理盐水，并实施短期睡眠剥夺。这一系列轻度致焦虑刺激可稳定诱发肌张力障碍发作，且发作潜伏期可重复，因此用于实验分组前的表型筛选。非肌张力障碍对照组金黄地鼠也需接受相同程序，以确保各组间实验条件的一致性。
  3. 为实现镇痛，对 dtsz-Sham 组和 dtsz-DBS 组动物给予 100 mg·kg-1 口服（p.o.）安乃近。随后按照下述手术程序对两组动物进行植入操作。

STELLA 刺激系统的封装

  1. STELLA 刺激系统采用生物相容性封装方法，以在长期植入期间保护设备免受液体渗透。电子元件被安置在一个定制的 3D 打印 PETG 封装壳内。
    1. 使用硅胶密封盖子与封装壳之间的接缝。
    2. 此外，在电缆引出位置也用硅胶对壳体进行密封。
    3. 若硅胶干燥后可见缝隙，则重复步骤 1 和 2。
    4. 硅胶完全固化后，按 100:35 的混合比例（重量比）配制环氧树脂。
    5. 在真空条件下（Vevor RS-1.5）去除树脂中的气泡。
    6. 在模具组装前，于定制硅胶模具的配合面上涂抹一层薄薄的凡士林，以增强密封性，并便于环氧树脂固化后脱模。将刺激器封装壳放入硅胶模具中，缓慢注入环氧树脂，直至刺激器及电缆连接部位完全被覆盖。填充过程中应避免产生气泡。
    7. 树脂固化后，将封装壳从模具中取出，并使用细锉刀或抛光工具修整环氧树脂表面，去除锐边。
    8. 通过将封装壳浸入液态硅胶中，在已固化的环氧树脂封装壳外表面涂覆一层最终的薄硅胶涂层。使用塑料移液管在电缆靠近连接区域的周围额外涂抹硅胶。在固化前应使用棒状工具清除多余的硅胶积聚，以避免涂层过厚。
    9. 最后，进行封装后的功能测试，以在植入或实验使用前验证刺激输出是否正常。将 STELLA 刺激系统置于林格氏液中，并激活磁控 BIST 功能。确认 LED 闪烁模式正确（2 × 2），表明刺激输出正常，且无短路、断路或低电量情况34。

3. 植入刺激系统的手术操作步骤

  1. 准备手术器械（图 1以及STELLA（软件定义的可植入模块化平台）刺激系统34.
    1. 对金属器械进行灭菌处理 图 1 在200 °C下加热约5分钟，例如使用FST Sterilizer 250。注意取出器械时温度较高。
    2. 用70%乙醇对带有两个DBS电极的STELLA刺激系统进行消毒。将干燥后的刺激系统置于装有林格溶液的Falcon管（50 mL锥形管）中，浸泡过夜。
  2. 准备动物（25–32日龄）
    1. 将麻醉室（自制）放入仓鼠笼中。短时间后，仓鼠会自愿走入管中。图 2A).
    2. 当仓鼠进入管中后，封闭管的一端，并将管连接至挥发性异氟烷输出端，持续1-2分钟（使用4%异氟烷诱导麻醉）图 2B).
    3. 轻轻地将动物从圆筒中取出，将其放置在温度可控的平台上。
      表面（约38 °C），并佩戴呼吸面罩（GM-4；以3%异氟烷维持麻醉，通过趾间反射检测麻醉深度）。
    4. 使用合适的电推剪剃除头部手术区域的毛发（图 2C用湿棉签清洁该区域，并皮下注射 500 µL 0.25% 布比卡因，以对骨膜进行额外的局部麻醉。切开头皮前至少等待 5 分钟。
    5. 将动物小心转移至立体定位仪框架中，并使用耳杆固定，使前囟和后囟处于同一高度（维持麻醉时异氟烷浓度降至1.5–2.5 %）。
    6. 使用人工泪液（TVM Ocry-Gel）保护眼睛。

4. 植入 STELLA 刺激系统

  1. 在头皮内侧做一条长 2 cm 的皮肤切口。使用牵开器（图 1，编号 14 和 图 2D）将皮肤拉开。用刀片刮除局部骨膜以暴露颅骨，并用棉片止血。
  2. 用棉签蘸取 3 % H2O2 涂于颅骨表面以增加粗糙度。
  3. 从林格氏液中取出刺激系统，并用 Parafilm 保护 DBS 电极。
  4. 将钝头剪刀经头部刚做的皮肤切口插入，在皮下向颈部和体侧分离形成一个长约 5 cm 的皮下囊腔。
  5. 将已从 Falcon 管中取出并浸泡于皮肤消毒液中的刺激器植入囊腔内。
  6. 用棉签向皮下囊腔内滴加约 500 µL 抗生素（10 mg·g-1 腥红酸）。
  7. 根据前囟坐标，在颅骨上钻两个直径为 7 mm 的孔（使用 FST#19007-07 钻头），用于植入 DBS 电极，定位坐标为 AP: −0.6 mm，ML: ± 2.2 mm。
  8. 在每个电极孔外侧再钻两个直径为 9 mm 的孔（FST#19007-09），并在已准备好的孔中拧入四枚螺钉（DIN 84 A2 M1x2）（图 2D）。
  9. 根据前囟坐标，将两枚 DBS 电极（SNEX-100）植入 DV: 6.0 mm 深度。请注意，具体使用的立体定位仪电极夹持装置将决定哪一侧电极先植入（两电极间距为 4.4 mm）。
  10. 使用紫外光固化粘合剂（Heliobond）将电极固定于两枚螺钉上。当两枚电极均植入后，在其之间再施加一层紫外光固化粘合剂。最后，使用 Compoglass Flow 对电极进行整体封固（图 2E）。
  11. DBS 组动物在术后至少恢复三天后，通过磁铁激活刺激器，持续进行 11 天的 DBS 刺激。本研究中采用的刺激参数与临床常用参数相似（130 Hz，50 μA，60 μs）。
  12. 每天用磁铁扫过仓鼠体侧，检查刺激器的发光模式（图 2F）。

5. 急性小脑切片的制备

  1. 为每只动物准备 1 L 人工脑脊液（ACSF）和 0.5 L 蔗糖溶液（详见表 1和表 2）。
  2. 在脑组织提取和切片过程中，使用约 4 °C 的蔗糖溶液，并持续通入碳合气（carbogen）。此外，准备冰冻的浆状蔗糖溶液，以便在快速解剖期间维持组织低温。
  3. 准备好解剖工具、蔗糖溶液、培养皿和振动切片机装置（见图 3A）。
  4. 动物应在关闭深部脑刺激（DBS）后约 15 分钟内处死，随后立即开始小脑提取。使用挥发性异氟烷诱导深度麻醉后将动物断头，并将头部置于盛有冰冻浆状蔗糖溶液的较大培养皿中。
  5. 解剖脑组织时应避免通过脊髓管进行中线切开，以保护小脑组织免受损伤。
  6. 将脑组织转移至底部铺有滤纸的新培养皿中，皿内盛满冰冻浆状蔗糖溶液，以防止切片过程中小脑滑动。
  7. 首先使用刀片通过脑桥进行冠状切面切除小脑（图 3B）；然后通过矢状旁切面切除小脑半球（图 3C）。
  8. 在振动切片机载物板上滴加一滴超级胶水。小心地将小脑蚓部从培养皿中取出，并将矢状旁切面轻压在滤纸上吸干水分，随后将该面粘附于载物板上（图 3D）。
  9. 将振动切片机载物板放入切片槽中，并加入足量蔗糖溶液（一半为浆状，一半为液体），确保完全浸没蚓部组织。切勿忘记持续通入碳合气（CB）。
  10. 以 0.08 mm·s-1 的恒定速度切割厚度为 200 μm 的矢状旁小脑切片（图 3E）。将切片储存于持续通入碳合气（CB）的室温 ACSF 烧杯中（图 3F）。
  11. 在转移至高密度微电极阵列（HD-MEA）前，将切片在室温下置于通有碳合气的 ACSF 中恢复约 40 分钟，此为记录前的复温与稳定阶段。在此期间，保持 ACSF 处于室温。

6. 准备 BioCAM DupleX MEA 系统的 CorePlateTM 单孔以进行记录

  1. 在开始实验前至少30分钟，开启配备Brainwave 5软件（BW5）的BioCAM DupleX记录系统。
  2. 在将组织切片放置于用于记录的CorePlateTM单孔板之前，先将单孔板插入记录装置，评估背景噪声水平。高质量记录的理想噪声水平应为9–20 µV。
  3. 用100%乙醇清洁镀金触点（图4A-1），用70%乙醇和软毛刷清洁电极阵列（图4A-2），最后用MilliQ水冲洗电极阵列。
  4. 将HD-MEA/CorePlateTM单孔板连接至记录系统（图4D-1）。
  5. 用移液器向孔中加入约2 mL ACSF。确保电极或接地端无气泡（图4D-2）。
  6. 启动实时采集，并使用BW5至少记录30秒。

7. 分析峰峰值幅度

  1. 要分析噪声界面，需打开记录的 *.bxr 文件，该文件包含 30 秒的固有噪声记录（由电极和放大器电路的电阻组件产生）。
  2. 选择“活动图”以及在“公制，“选择” 峰峰值振幅。刻度设为 500 µV，可直观显示电极阵列上信号的变异性（图5A).
  3. 在“活动图窗口中，将鼠标指针置于记录电极上方以显示“宽视野平均值幅值。
  4. 或者，您可以通过在“图表导出" 然后打开该 Excel 文件，计算平均振幅值 [=AVERAGE(数字1, 数字2, ...)]。

8. 分析基线噪声（信号标准差）

  1. 通过点击“Playback”生成 *.brw 文件，以分析基线噪声。然后选择“Activity Map”，在“Metric”下选择“Standard Deviation”。系统将自动设置量程为 30 µV，从而可视化电极阵列上信号的变异性（图 5B）。
  2. 在“Activity Map”窗口中，将鼠标指针悬停在已记录的电极上方，以显示“Well Wide Mean”标准差。
  3. 或者，您也可以使用“Chart Export”确定平均标准差，并生成 *.xlsx Excel 文件。随后打开该 Excel 文件，计算平均标准差 [=Average(数值1; 数值2;...)]。

9. 用于评估信号质量：

  1. 计算信噪比（SNR）
    信噪比公式；显示为 SNR = 峰峰值幅度均值/噪声标准差。
    SNR ≥ 5：质量良好
    SNR 在 2 到 5 之间：质量中等
    SNR < 2：质量较差

10. 在 CorePlate 单孔板中对脑片进行定位以进行数据采集

  1. 借助巴斯德移液管，将切片放置在电极阵列上，使感兴趣区域被记录电极覆盖（图 4 B-1）。移除孔中的溶液（图 4 B-2）。使用直立显微镜拍摄图像。
  2. 使用切片固定锚将组织固定（图 4C）。
  3. 使用 3 mL 巴斯德移液管，向切片上加入一滴人工脑脊液（ACSF）。
  4. 使用体积较小的巴斯德移液管吸除液体。再用拧紧的滤纸条吸去残留液体（重复此步骤 7–10 次）（图 4C-2）。
  5. 记录期间进行灌流时，使用室温的人工脑脊液（ACSF），设置流速为 2 mL·min-1。进液口位于组织切片上方，出液口位于孔板壁处（图 4D）。
  6. 建议额外将进液和出液管道接地，以尽量减少灌流引起的噪声，可通过导线将其连接至记录系统实现（图 4D-1）。
  7. 为减少干扰，请关闭显微镜和房间内的灯光。

使用 CorePlateTM 单孔板记录神经网络活动

  1. 将记录参数设置为采样频率 20,000 Hz，高通滤波器为 100 Hz。
    1. 在 BrainWave 5 软件中，点击“文件”并新建一个记录会话。
    2. 点击“Source”。
    3. 打开：chip pilot，并进行以下调整：
      以 20,000 Hz/电极的采样率记录自发神经活动。
      硬件高通滤波器截止频率：100 Hz。
      光补偿速率：短（直接光刺激）。
  2. 选择芯片校准通道和原始信号轨迹类型。
    1. 打开：Control signal，并选择：启用内部芯片校准，输出通道选择：1.1。
    2. 点击“+”和“Charting”。
    3. 打开：Chart setting。
    4. 选择原始信号轨迹：raw and spikes。

12. 在活动图上插入并校准显微镜图像

  1. 点击“+”。
  2. 选择“叠加层与注释”，将显微镜图像插入到BW5上的活动图中：
  3. 进入孔板图层：
    1. 选择管理图层和小脑图像。
    2. 对齐所选图像图层：点击开始。
    3. 按照数字顺序点击图像的四个角，然后应用。

13. 录制前的数据压缩设置

  1. 为压缩数据，请进入 RECORDER 的第一页：
    1. 驾驶舱模式：高级
    2. 保存原始压缩数据：小波压缩 + 事件：尖峰信号
    3. 开始记录前先播放 10 分钟。
  2. 记录完成后，使用 100 % 乙醇清洁镀金焊盘，然后向孔中加入纯水并刷洗 30 秒。
  3. 接着，向孔中加入 70 % 乙醇，轻柔刷洗电极阵列约 30 秒。最后，向孔中加入纯水并轻柔刷洗 30 秒（重复此步骤 2 至 3 次）。
  4. 将 CorePlateTM 单孔板保持干燥，并存放于合适的容器中。

14. 录制数据的离线分析

  1. 使用 BW5 打开所需的文件。
  2. 根据解剖层定位（分子层、浦肯野细胞层、颗粒细胞层）选择电极，将小脑皮层分为三组。
    注意：每个感兴趣区域（ROI）内各层的电极数量取决于在该层检测到的自发活动，因此在不同记录之间有所变化。通常，单个脑片中每个 ROI 分析 25–250 个电极。跨越两个解剖层的区域中的电极被排除，以避免层定位的不确定性。仅包含明确归属于某一特定小脑层的电极用于后续分析。
    1. 选择与分组：进入 Unit groups（单元组）。
    2. 在“Manage unit groups”（管理单元组）中，点击“+”创建一个新组并命名。
    3. 如需向组中添加更多电极，先选中相应电极，然后点击“add or remove selected units”（添加或移除选中单元）。
  3. 使用称为精确时序峰电位检测（PTSD）的峰电位检测方法分析原始信号。该方法专注于检测峰-峰值幅度超过预设阈值的相对极大值和极小值，以确保峰电位识别的精确性和准确性。
    1. 数据处理：进入 Spike detection （峰电位检测），并将模式设置为 advanced（高级）。
    2. 使用数据来源：Raw（原始数据）。
    3. 算法：PTSD（Precise timing spike detection，精确时序峰电位检测）。
    4. 标准差倍数：8.0。
    5. 峰电位持续时间：2.0 ms。
    6. 不应期：1.0 ms。
    7. 峰电位判定依据：负向峰。
    8. 峰前波持续时间：1.0 ms。
    9. 峰后波持续时间：1.5 ms。
  4. 进入 Spike sorting（峰电位分类），并将模式设置为 advanced（高级）。调整以下参数：
    1. 峰前波采集时长：0.5 ms。
    2. 峰后波采集时长：1.0 ms。
    3. 特征提取算法：Legendre moments（勒让德矩）。
    4. 特征数量：3。
    5. 聚类算法：K-Means & Silhouette（K-均值与轮廓系数）。
    6. 每个簇的最小峰电位数：20。
    7. 最大簇数量：3。
    8. 轮廓阈值：2。
  5. 将数据导出至 Excel。
    1. 点击“Charting”（图表）。
    2. 进入 Chart Export（图表导出）。
    3. 选择电子表格并导出。

结果

苍白球深部脑刺激（DBS）使不同组间皮层各层的脉冲数量恢复至正常水平。

我们分析了四组实验动物小脑皮层三个层中的总峰电位数量——分子层（ML）、浦肯野细胞层（PL）和颗粒细胞层（GL）：野生型（WT，N = 8）、dtsz（N = 8）、dtsz-Sham（N = 7）和 dtsz-DBS（N = 7），分析基于从这些动物获取的脑片进行。

尽管肌张力障碍组织（dtsz）产生的峰电位显著较少，但苍白球深部脑刺激（pallidal DBS）使峰电位数量增加至与健康对照组相当的水平（表3）。Kruskal-Wallis H检验进一步证实了这一结果，显示在dtsz DBS组中，ML区域的峰电位数量相较于dtsz组和dtsz-Sham组均具有统计学意义上的显著增加（χ2(3) = 20.728，p = 0.001；图6A）。dtsz-DBS组在PL区域（χ2(3) = 16.855，p = 0.001；图6B）和GL区域（χ2(3) = 13.164，p = 0.004；图6C）也表现出类似的峰电位增加，达到与WT组相当的水平（表3）。

解剖工具套装、手术刀、剪刀、镊子、玻璃培养皿、解剖学研究中使用的实验仪器。
图1。外科器械概览。 图像展示了一个排列整齐的托盘，其中包含一套专为深部电极和刺激器植入手术设计的外科及显微外科器械。这些器械按照使用顺序排列，以提高操作效率。器械放置于组织上，以保持清洁并在手术过程中便于取用。此布局注重精确性、无菌性以及对复杂外科工作流程的充分准备。（1）钝头/钝头剪刀，（2）缝线剪刀，（3）锐头/锐头剪刀，（4）持针器，（5）打结镊，（6）弯头碎屑镊，（7）带齿镊，（8）标准短镊，（9）标准长镊，（10）微型刮匙，（11）重复使用的电极，（12）螺钉，（13）钻头配件，（14）牵开器头/夹具，（15）玻璃腔块，需填充0.9 % NaCl和利多卡因。更多信息请参见材料清单。请点击此处查看该图的放大版本。

DBS 手术示意图、电极放置、用骨水泥固定、间断缝合、大鼠模型。
图 2。用于在立体定位仪中麻醉和固定动物以植入 DBS 电极和刺激器的实验装置。（A）将动物轻轻放入定制的诱导室中以开始麻醉。（B）将诱导室连接至呼吸面罩，以确保在操作过程中安全地输送麻醉气体（使用 4% 异氟烷进行诱导）。（C）动物麻醉后，转移至带有连接呼吸面罩的加热板上（以 3% 异氟烷维持麻醉），以防止低体温，并在剃毛过程中持续维持麻醉状态。（D）将动物小心地固定在立体定位框架中。做一纵向切口，并使用夹子牵开皮肤。四个点标示螺钉的位置。将螺钉插入标记区域，并另外标记两个点用于电极放置。（E）将电极插入苍白球内侧部（GPi），并在移除立体定位夹持器前用胶水固定。为增强固定效果，在电极周围涂抹骨水泥。使用间断纵向缝合关闭手术切口；（F）将刺激器置于动物皮下侧腹部区域。术后动物保持存活状态，箭头指示刺激器的位置。请点击此处查看该图的放大版本。

脑切片装置：解剖工具与切片机。示意图展示了组织制备步骤。
图3．脑切片与切片示意图。（A）解剖手术器械：（1*）自制琼脂培养皿，（2*）琼脂培养皿，（3*）固定碳氧混合气体管的夹具，（4*）滤纸，（5*）刀片，（6*）超级胶水，（7*）振动切片机载物台/夹持器，（8*）弯头镊子，（9*）剪刀，尖头/钝头。（B）脑样本制备：解剖后对脑组织进行切割，虚线表示冠状面切片的方向。（C）旁矢状面切片：沿指定的旁矢状面进行脑组织切割。（D）组织固定：将所得脑组织用胶水固定在载物台/夹持器上，以确保精确切片。（E）振动切片：将附着组织的载物台转移至振动切片机中，获得超薄切片（200 µm）。（F）最终切片：生成精确的旁矢状小脑切片，可用于电生理记录35。更多信息请参见材料清单。请点击此处查看该图的放大版本。

脑片电生理实验装置；清洗、定位、固定、灌流过程示意图。
图 4。获得良好细胞活性的操作步骤示意图。（A）清洗：此步骤通过清洁高密度微电极阵列（HD-MEA）表面，确保无杂质干扰后续的固定（接触垫，A-1）或记录过程（平坦区域，A-2）。（B）脑片定位：将组织切片小心地放置在 HD-MEA 上（B-1），确保其正确对齐以实现电极的有效接触（B-2）。使用移液器的细尖端（箭头）去除残留的人工脑脊液（ACSF），以便插入固定锚。（C）切片固定：使用固定锚将切片牢固地固定在 HD-MEA 上。在此步骤中，需先滴加一滴 ACSF，然后使用移液器（C-1；箭头）和卷紧的精密擦拭纸（C-2）小心去除多余液体。此操作可确保切片稳定并与电极保持良好接触，从而实现准确记录。（D）灌流：最后连接并启动灌流系统，以维持实验过程中组织切片的活性，其中流入液应位于切片上方，流出液靠近器皿壁（D-2）。同时必须清除所有气泡，以减少记录过程中的噪声（箭头所示）。额外的接地线连接至灌流系统的流入和流出管路（D-1）。红色标尺长度为 1.5 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

电生理学指标；峰峰值幅度和标准差；数据分析可视化。
图 5。使用 Brain Wave 5 软件（BW5）分析高密度微电极阵列（HD-MEA）记录中的幅度和标准差指标，以评估信号质量。（A）选择峰峰值幅度指标以提取电极本身的幅度值（标尺：500 µV）。（B）选择标准差指标以量化各电极上的基线噪声（标尺：30 µV）。请点击此处查看该图的放大版本。

脑层中神经放电计数比较；带有电生理波形的箱线图。
图 6：苍白球深部脑刺激（DBS）对小脑皮层各层放电活动的影响：(A) 分子层（ML），(B) 普肯耶细胞层（PL），以及 (C) 颗粒层（GL）。箱须图中以十字表示均值，横线表示中位数，并显示第25和第75百分位数。各组分别为野生型（WT，n = 22 片），dtsz 未手术组（n = 20 片），dtsz DBS关闭组（假刺激，Sham，n = 20 片），以及 dtsz-DBS开启组（n = 20 片）。统计显著性采用Kruskal-Wallis检验，随后进行Dunn's成对比较（*p< 0.05）。请点击此处查看该图的放大版本。

名称分子量 [g/mol]终浓度 [mol/L]
NaCl58.440.124
KCl74.550.003
葡萄糖180.160.01
CaCl2 (无水)110.980.0025
NaHCO384,0070.026
NaH2PO4119.980.00125
pH 7.35 至 7.40（可用 HCl 调节）
渗透压 [mOsmol/kg]290 至 300

表1：人工脑脊液（ACSF）溶液：用于制备小脑切片实验用ACSF的成分及其最终摩尔浓度。用HCl将pH值调节至7.35–7.40，渗透压维持在290–300 mOsm·kg-1。

名称分子量 [g/mol]终浓度 [mol/L]
Saccharose342.300.075
KCl74.550.0025
NaCl58.440.087
CaCl2 (无水)110.980.0005
MgCl295.210.007
葡萄糖180.160.01
NaHCO384.010.025
NaH2PO4119.980.00125
pH 7.35 至 7.40（可用 HCl 调节）
渗透压 [mosmol/kg]320 至 330

表2：蔗糖溶液。小脑切片制备过程中所用蔗糖溶液的组成成分及最终摩尔浓度。pH值调节至7.35–7.40，渗透压维持在320–330 mOsm·kg-1。

分组：WT dtsz dtsz-Shamdtsz-DBS 
n22202020
变异系数
ML0.530.550.60.35
PL0.570.570.520.46
GL0.480.660.610.51
尖峰数量
ML287240±32605163434±19998234209±31284345915±27113
PL413223±50171194277±24786304568±35692412707±42509
GL390817±40139211274±31193325533±44318373208±42220

表3：小脑各层及实验组间尖峰指标汇总。WT – 野生型非肌张力障碍对照组仓鼠；dtsz – 天然 dtsz 仓鼠；dtsz-DBS – 连续刺激11天的 dtsz 仓鼠；dtsz-Sham – 接受手术但无有效DBS的 dtsz 仓鼠；ML – 分子层；PL – 普肯耶细胞层；GL. – 颗粒细胞层。

讨论

我们描述了一种方法学途径，用于研究深部脑刺激（DBS）在dtsz仓鼠的病理生理性肌张力障碍神经网络中的作用机制。关键步骤包括精确的电极植入、快速的小脑切片制备以及稳定的高密度微电极阵列（HD-MEA）记录条件，以确保可靠的数据采集。我们展示了手术操作、小脑切片制备、记录及分析技术，以探究ex vivo 状态下小脑的神经活动及其受DBS调控的情况。利用HD-MEA进行的电生理测量可实现对小脑自发活动的实时记录，具有高时间与空间分辨率36，我们认为这对于研究苍白球深部脑刺激治疗肌张力障碍的机制至关重要。

目前，肌张力障碍被认为是一种网络性疾病，其特征是基底神经节、小脑和皮层回路之间功能障碍性相互作用导致异常的运动输出37,38。临床和实验研究均表明，小脑异常在肌张力障碍中起着重要作用15,22,39。此外，一项针对松鼠猴小脑皮层注射逆行狂犬病毒（RV）的解剖学研究显示，基底神经节的丘脑底核对小脑皮层有显著的投射作用40。这些发现强调了在研究深部脑刺激（DBS）治疗机制时，同时探索小脑回路与基底神经节网络的重要性40,41,42。该方法特别适用于研究运动障碍中的神经元相互作用及神经调节效应。

关于苍白球深部脑刺激（pallidal DBS）的全脑网络机制，研究已表明，对苍白球内侧部（GPi）进行DBS可引发大脑活动的广泛改变，不仅影响基底神经节内部，还涉及皮质-纹状体网络43、丘脑44以及小脑15等相互连接的脑区。这些发现支持了苍白球DBS能够调节整个基底神经节-小脑网络活动的假说，从而解释其在肌张力障碍治疗中的疗效。这凸显了开展临床前研究以探究DBS作用机制的必要性，也体现了高密度微电极阵列（HD-MEA）记录技术在捕捉全网络电生理变化方面的优势。此外，Kotyra 等人（2025）的研究进一步证实，长期GPi-DBS可在肌张力障碍运动网络中诱导持久的神经可塑性重塑45。In vivo 研究结果显示，苍白球刺激可逐步减轻dtsz仓鼠的肌张力障碍严重程度，且在停止刺激后，其治疗效果仍持续存在，提示DBS的作用机制不仅限于刺激期间的急性效应45。此外，近期的电生理学研究发现，长期DBS可导致全网络范围内的突触可塑性和放电模式的调节，包括小脑活动增强15、运动丘脑神经元的兴奋性输入增加，以及初级运动皮层（M1）兴奋性输入更加集中46。

代表性结果表明，深部脑刺激（DBS）具有全网络范围的影响，这体现在肌张力障碍仓鼠小脑皮层的分子层、浦肯野细胞层和颗粒细胞层中放电活动的正常化（图6）。在dtsz DBS组中观察到的放电活动增加达到了与野生型对照组相当的水平。放电活动的这种正常化支持了DBS在治疗肌张力障碍方面的治疗潜力。值得注意的是，与WT组相比，dtsz-Sham组在所有小脑层中的放电值均处于中间水平，提示仅电极植入本身可能影响小脑网络活动。这一解释与临床上描述的肌张力障碍中的微损伤效应一致，即电极植入本身可能在刺激开始前短暂改善症状47。尽管dtsz仓鼠再现了阵发性全身性肌张力障碍的关键特征，但并未完全反映人类肌张力障碍综合征中所观察到的临床异质性。因此，在将这些发现外推至人类肌张力障碍时应保持谨慎。

本研究解决了与刺激器封装、脑深部电刺激手术、脑片制备以及大规模电生理数据分析相关的技术难题。基于CMOS的高密度微电极阵列（HD-MEA）技术的结合，为 体外 高度复杂神经元相互作用的研究48我们的研究结果有助于更深入地理解肌张力障碍背后的病理生理动态，为脑深部电刺激（DBS）治疗的网络层面机制提供了有价值的见解。对特定脑区及其相互作用进行详细的功能分析，一方面有助于更细致地认识肌张力障碍神经网络中的病理生理动态，另一方面则揭示了DBS治疗作用的机制。

本研究中，技术问题导致高密度微电极阵列（HD-MEA）记录过程中背景噪声增加，干扰了稳定信号的获取。常见的故障排除步骤包括排查噪声来源、确保正确接地以及维持组织与电极之间稳定的接触。当出现高噪声水平或测量不稳定时，应首先检查接地情况、电缆连接以及附近的电子设备。电极阵列表面的气泡也可能损害组织与电极的接触并影响记录稳定性，必须小心清除（图 4）。此外，必须确保放大器通过高质量的 USB-C 转 USB-C 电缆向计算机稳定传输数据。对于持续存在噪声的电极，应将其排除在后续分析之外。尽管使用 HD-MEA 记录细胞外信号可实现对神经网络活动的高空间分辨率，并结合叠加的显微图像将信号定位至小脑皮层的各个分层，但仍不能排除所检测到的细胞外活动由非目标分层的穿行轴突产生。此外，统计分析以脑片为单位进行，因为每张脑片代表在标准化实验条件下获得的独立电生理记录，尽管部分脑片可能来自同一只动物。

在深部脑刺激（DBS）过程中，由于电极松动或刺激器的技术缺陷，可能会出现其他问题。为尽量减少这些问题，应确保电极固定牢靠，并在整个操作过程中保持无菌操作条件。在本研究的所有试验中，此类情况的发生率为5%。为减少电极松动，必须在使用粘合剂或牙科水泥固定电极前将颅骨表面彻底干燥，以增强粘附性并防止滑脱。为确保无菌并避免机械污染，刺激器、电极尖端和单丝缝线只能使用镊子或止血钳进行操作。此外，在接触动物前，应使用乙醇对手套进行消毒并晾干，以最大限度降低感染风险。快速制备小脑脑片对于获得高质量的电生理记录至关重要。然而，这也意味着无法在事后验证植入式DBS电极的位置。在另一项研究中，研究人员探讨了不同刺激参数对dtsz-仓鼠肌张力障碍严重程度的影响，该研究采用了相同的刺激电极和手术技术。在该研究中，我们能够在94%的试验中确认电极位置的准确性37。

总之，本方案为研究深部脑刺激（DBS）的电生理机制提供了一个强大的平台，并为其作用机制提供了宝贵的见解。dtsz 仓鼠独特地实现了在肌张力障碍表型背景下对苍白球DBS效应的临床前研究，同时结合了离体 高分辨率神经元网络活动记录。我们的结果支持小脑参与肌张力障碍的概念，并强调了在理解与优化神经调控疗法中进行网络水平分析的重要性。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由德国研究基金会（DFG）在合作研究中心（SFB 1270/1,2 ELAINE 299150580）项目资助下完成。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3% H2O2Caelo15301730
50 ml 锥形管Greiner Bio-OneFalcon型锥形管
琼脂培养皿手工制作 
麻醉装置BioMedical InstrumentsUniventor 1200
BioCam DupleX3BrainBioCAM DupleXCMOS-HD-MEA 平台
刀片（5*）Apollo Herkenrath09-025-056
Brainwave 软件 53Brain版本 5CMOS-HD-MEA 平台
呼吸面罩NarishigeGM-4
大容量可流动材料：Compula 补充装Dentsply Sirona267-0195用于粘固剂
胶囊分配枪 Dentsply Sirona296-0003用于粘固剂
碳酰气（Carbogen）Air LiquideAir Liqiuide（室内系统）
腔体阻断玻璃片AIMAIM40 mm × 40 mm
夹具（3*）DIEFFENBACH12-1003-04不锈钢，4 cm
计算机DellPrecission 3431
CorePlateTM 1W 38/603BrainAccura HD-MEACMOS-HD-MEA 芯片
钻头配件（13）FST19007-07尖端：7 mm
钻头配件（13）FST19007-09尖端：9 mm
Eco 擦拭巾 - 擦拭分配器Dr Schumacher00-915SE001 (1x1) 
Eco 擦拭巾 - 擦拭卷Dr Schumacher00-915SE001 (6x1)
ELASTOSILWackerRT 601 A/B
电极MicroprobesSNEX-100
乙醇Carl Roth GmbH + Co. KG货号 T913.3
挖匙（10）HLW Dental-Instruments GermanyS-10.28-6
镊子（5）FST18025-10不锈钢，10 cm
镊子（6）AesculapBD311R9 cm
镊子（7）FST91100-12不锈钢，12 cm
镊子（8）FST11231-20不锈钢，11 cm
镊子（8*） Karl Hammacher9.160 160Wironit，10.5 cm
镊子（9）FST11200-33Dumoxel，13.5 cm
镊子（9）FST11200-33Dumoxel，13.5 cm
带集成排气系统的加热手术台BioMedical InstrumentsBioMedical Instruments
heliobondIvoclar Vivadent42040
制冰机ScotsmanAF 80 AS / WS
流入和流出针头BD Microlance 1.25 × 70 mm
Isathal 10 mg/gDechra注册号 400216.00.00Fucidin
异氟烷Sedana medicalN001254
Milli-Q 水过滤器ElgaPURELAB flex 3
持针器（4）FST12501-13碳化钨，13 cm
OcteniseptSchülke & Mayr抗菌溶液 
滤纸（4*）Carl Roth GmbH + Co. KGAP75.1
ParafilmSigma AldrichHS234526C
铂金锚定件3Brain3Brain
牵开器头（14）FST18200-102.5 mm
重复使用电极（11）MicroprobesSNEX-100用于定位坐标
林格氏液B. Braun3570030
剪刀（1）FST14078-10不锈钢，10 cm
剪刀（2）AesculapBC144R
剪刀（3）FST14058-09不锈钢，9 cm
剪刀（9*）FST91401-12不锈钢，12 cm
螺钉（12）Online-Schrauben.deDIN 84 A2 M 1×2
剃毛器ExactaGT415
STELLA（软件定义可植入模块化平台）刺激系统非商业用途；罗斯托克大学开发开源（https://github.com/SFB-ELAINE/STELLA）电池驱动的深部脑刺激器
灭菌器 250FST18000-45
立体定位仪Narishige型号 SR-AR
超级胶水UHU64212
眼用软膏（泛醇鼻用软膏）Jenapharm5541249
振动切片机 LaicaVT12005
利多卡因凝胶 2%Aspen Pharma1138060
称量舟Carl Roth GmbH + Co. KGHYT9.1
电子天平VoltcraftTS-5000/1
用于溶液配制的化合物
氯化钙（CaCl2）Sigma-Aldrich10043-52-4
D-葡萄糖（C6H12O6）Sigma-Aldrich50-99-7
氯化镁（MgCl2）Sigma-Aldrich7786-30-3
氯化钾（KCl）Sigma-Aldrich7447-40-7
碳酸氢钠（NaHCO3）Sigma-Aldrich144-55-8
氯化钠（NaCl）Sigma-Aldrich7647-14-5
磷酸二氢钠（NaH2PO4）Sigma-Aldrich7558-80-7
蔗糖Sigma-Aldrich57-50-1

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