骨关节炎患者髌下脂肪垫来源的小细胞外囊泡的分离与表征

摘要

摘要 本方案提供了一种标准化的操作流程，用于从骨关节炎患者髌下脂肪垫组织中分离和表征小型细胞外囊泡（sEVs）。

摘要

细胞外囊泡（EVs），尤其是定义为直径小于200 nm的小细胞外囊泡（sEVs），是细胞间通讯的重要介质，几乎由所有细胞类型释放至多种生物体液中。髌下脂肪垫（IPFP）与膝骨关节炎（OA）的发生和发展密切相关。然而，目前仍缺乏从IPFP组织外植体直接分离sEVs的标准化方法。本文介绍了一种可重复的实验方案，用于从OA患者获取的IPFP组织中分离和表征sEVs。收集IPFP组织培养的条件培养基后，首先通过低速离心去除细胞和碎片，随后采用超速离心富集符合sEV尺寸范围的囊泡。根据细胞外囊泡研究最低信息标准（MISEV2023）的建议，利用涵盖不同功能类别的代表性蛋白标志物对所得囊泡进行表征：CD63作为膜相关四跨膜蛋白，ALIX和TSG101作为参与ESCRT（运输所需内体分选复合物）介导生成过程的胞质蛋白，Calnexin作为内质网驻留蛋白用于监测潜在的非囊泡污染。该流程可获得特征明确的sEV制备物，适用于骨关节炎研究中的功能实验或蛋白质组学分析等下游应用。

引言

小细胞外囊泡（sEVs）是一类异质性的小细胞外囊泡亚型，根据国际细胞外囊泡学会（ISEV）在细胞外囊泡研究最低信息标准（MISEV2023）指南中提出的操作性分类，被定义为直径通常小于200 nm的囊泡¹。几乎所有类型的细胞均可向生物体液中释放sEVs，因其在生理和病理条件下作为细胞间通讯的重要介质而受到越来越多的关注^2,3。

小细胞外囊泡（sEVs）的膜富含多种功能蛋白。其中，CD63等四跨膜蛋白家族成员与囊泡膜的组织和融合相关⁴。此外，参与运输所需内体分选复合物（ESCRT）的胞质蛋白，如ALIX和TSG101，在sEV的生物合成与分泌过程中起关键作用。因此，这些蛋白可作为可靠标志物，用于确认所分离囊泡的内体来源^5,6。

髌下脂肪垫（IPFP）已被认为是一种活跃的关节相关组织，与骨关节炎（OA）的起始和进展密切相关^7,8。在炎症和退行性条件下，推测来源于IPFP的sEVs携带....

方案

本研究使用骨关节炎患者的IPFP组织已获得河北医科大学第一医院伦理委员会批准（批准文号：[2024] 018）。样本收集在批准的有效期内进行，并在获取组织前取得所有参与者的书面知情同意。

1. 培养基与溶液的制备

1. 通过混合445 mL基础DMEM/F12培养基、50 mL无外泌体胎牛血清（10%）和5 mL青霉素/链霉素/两性霉素B（终浓度分别为100 U/mL、100 µg/mL和0.25 µg/mL），配制500 mL无外泌体完全DMEM/F12培养基。使用0.22 µm滤器过滤除菌。
2. 将950 mL蒸馏水（dH₂O）与50 mL 20x电泳缓冲液（Tris/MOPS/SDS）混合，配制Western blot电泳缓冲液。
3. 将800 mL dH₂O与100 mL 10x转移缓冲液和100 mL无水乙醇混合，配制Western blot转膜缓冲液。
   注：该快速转膜缓冲液专为室温下高电流湿转（400 mA）优化设计。由于产热较低，转膜时间少于45分钟时无需使用冰浴，且已证实可在10–250 kDa蛋白范围内保持高转膜效率。
   警告：无水乙醇易燃。应在通风良好的区域操作，并远离热源。
4. 将50 mL 20x TBS（含200 mM Tris和3 M NaCl，pH 7.5–7.6）、2 mL T....

结果

通过多模式表征证实了从小块人髌下脂肪垫（IPFP）组织中成功分离出小细胞外囊泡（sEVs）。

透射电子显微镜（TEM）显示，分离的囊泡呈现出典型的杯状形态，并具有清晰定义的脂质双层膜结构，符合小细胞外囊泡（sEVs）的结构特征（图1）¹¹。

图1： 小细胞外囊泡（sEVs）的透射电子显微镜（TEM）图像。 典型的透射电镜图.......

讨论

本方案提供了一种可重复且实用的工作流程，用于通过组织块培养结合差速超速离心法从人髌下脂肪垫（IPFP）组织中分离小细胞外囊泡（sEVs）。通过多种互补的表征方法对分离的囊泡进行了验证，包括透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒追踪分析（NTA）以及对已确立的细胞外囊泡标志物的蛋白质印迹检测¹。TEM确认了具有典型形态的膜包被囊泡的存在，NTA显示其粒径分布符合sEV群体特征，蛋白质印迹分析证实了CD63、Alix和TSG101的存在，同时未检测到Calnexin，表明细胞内细胞器污染极少。这些结果共同证明了本方案在从IPFP组织中分离结构完整且分子特征明确的小细胞外囊泡方面的有效性与可靠性。

本方案的一个关键方法学特征是采用组织外植体培养而非酶消化法来收集细胞外囊泡（EV）。酶解离方法（如胶原酶消化）可能破坏细胞膜，并诱导EV相关表面蛋白发生人工蛋白水解切割，从而可能改变囊泡组成并引入非囊泡污染物¹³。相比之下，外植体培养可保持组织完整性，使活细胞在生理相关条件下分泌囊泡，所获得的EV群体更.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
40 mL PET 离心管	himac（Eppendorf Himac Technologies）	5720411148	聚对苯二甲酸乙二醇酯，26 × 90 毫米
70 µm细胞筛	北京兰杰科技术	560049	用于组织碎片清除
抗Alix抗体	上海阿比源生物科技	CY7215	sEV阳性标志物
抗钙联蛋白抗体	上海阿比源生物科技	CY5839	阴性标志物（ER污染）
抗 CD63 抗体	Affinity Biosciences	DF2305	四跨膜蛋白标志物
抗TSG101抗体	上海阿比奥韦生物科技	CY5985	sEV阳性标志物
BCA 蛋白检测试剂盒	上海雅美生物科技	ZJ102	用于蛋白质定量
细胞培养瓶（T175）	NEST Biotechnology	560229	用于IPFP外植体培养
离心管（50 mL）	BIOFIL	560041	用于初始低速步骤
无外泌体胎牛血清	Cyagen Biosciences	FBSNE-01061	用于组织培养
HRP 标记的山羊抗兔 IgG	上海阿比源生物科技	AB0101	用于WB的二抗
即用型蛋白上样缓冲液（变性，还原，5×）×)	上海雅美生物科技	LT101	用于蛋白质变性
Micro BCA 蛋白检测试剂盒	赛默飞世尔科技	23235	用于蛋白质定量
Millex-GP 滤器单元（0.22 µm） µm)	北京兰杰科技术	560360	无菌，用于囊泡过滤
纳米颗粒追踪分析仪	马尔文帕纳科	NanoSight NS300	用于大小和浓度分析
Omni-Flash 无冰快速转移缓冲液	上海雅美生物科技	PS201S	用于蛋白质印迹转膜
磷钨酸（2%）	Sigma-Aldrich	P4006	用于透射电镜负染色
蛋白上样缓冲液（变性，非还原，5×）×)	上海雅美生物科技	LT103	用于蛋白质变性
无蛋白快速封闭缓冲液（5×)	上海雅美生物科技	PS108	封闭膜
RIPA裂解缓冲液	北京索莱宝科技有限公司 & 技术有限公司	R0010	用于sEV蛋白提取
TBS(20×)	北京索莱宝科技有限公司 & 技术有限公司	T1080	用于配制洗涤缓冲液
透射电子显微镜	日立	HT7800	用于形态学表征
Tris/MOPS/SDS 电泳缓冲液	上海雅美生物科技	PS120	用于蛋白质分离
Tween-20	北京索莱宝科技有限公司 &科技有限公司	T8220	用于配制洗涤缓冲液
超速离心机	himac（Eppendorf Himac Technologies）	CP100NX	高速分离系统
超灵敏化学发光检测试剂盒	上海雅美生物科技	SQ201	用于蛋白质条带的可视化
通用抗体稀释缓冲液	上海雅美生物科技	PS119L	一抗/二抗