骨关节炎患者髌骨下脂肪垫中小细胞外囊泡的分离与特征分析

Summary

摘要 本方案提供了一套标准化工作流程，用于从骨关节炎患者髌骨下脂肪垫组织中分离和表征小细胞外囊泡（sEV）。

Abstract

细胞外囊泡（EV），尤其是小于200纳米的细胞外囊泡（sEV），是细胞间通信的重要介质，几乎所有细胞类型都会释放到各种生物液体中。髌骨下脂肪垫（IPFP）与膝关节骨关节炎（OA）的发生和进展密切相关。然而，直接从IPFP外植中分离sEV的标准化方法仍然有限。我们提出了一个可重复的方案，用于分离和表征从OA患者获得的IPFP组织衍生的sEV。从IPFP组织培养中收集的调质培养基通过低速离心依次清除细胞和残渣，随后进行超速离心以富集sEV尺寸范围内的囊泡。根据有限信息，利用一组代表性蛋白标记在不同功能类别中进行细胞外囊泡（MISEV2023）推荐：CD63作为膜相关四斯潘素，ALIX和TSG101作为参与由内质分选复合物（ESCRT）介导的生物发生的细胞质蛋白，Calnexin作为内质网驻留蛋白以监测潜力非囊泡性污染。该工作流程产生了明确定义的sEV制备，适用于骨关节炎研究中的功能性分析或蛋白质组学剖析等下游应用。

Introduction

小细胞外囊泡（sEVs）是一种异质细胞囊泡亚型，根据国际细胞外囊泡学会（ISEV）在细胞外囊泡研究（MISEV2023）指南中提出的操作分类，被定义为直径通常小于200纳米的囊泡.sEVs几乎由所有细胞类型释放到生物体液中，因其在生理和病理环境中作为细胞间交流介导者的重要作用，吸引了越来越多的关注 ^2,3。

sEVs的膜富含多种功能蛋白。其中，像CD63这样的四斯潘素与囊泡膜组织和融合^有关。此外，与运输所需的内体分选复合物（ESCRT）相关的细胞质蛋白，如ALIX和TSG101，是sEV生物合成和分泌的重要组成部分。因此，它们作为确认分离囊泡内体起源的可靠标志^5,6。

髌骨下脂肪垫（IPFP）已被认定为与骨关节炎（OA^）的发生和进展密切相关的活跃关节相关组织^7,8。在炎症和退行性条件下，IPFP衍生的sEV被假设携带炎症介质和致病信号，从而促进滑膜炎症和软骨降^解9。因此，表征OA患者IPFP组织释放的sEV可能为疾病相关细胞间通信网络提供关键见解。

鉴于对sEV作为分子介质和潜在治疗剂的兴趣日益增长，建立高产率、高纯度且可重复的分离方法至关重要。尽管差别超量离心仍是最广泛使用的纯化策略之一，^但针对细胞培养上清液或生物流体优化的方案可能无法直接适用于如IPFP的固体脂肪组织。高脂质含量、致密的细胞外基质以及多变的酶消化条件都会影响囊泡的恢复和纯度。

组织移植培养提供了一种生理学相关的方法，既保留了原生细胞结构和细胞间相互作用，又最大限度地减少了过度的酶素破坏，从而能够在近乎原生条件下收集释放的sEVs。然而，目前尚缺乏专门针对分离IPFP外置培养的sEV的标准化工作流程。

本文介绍了一项通过差异性超速离心法分离和表征骨关节炎患者髌骨下脂肪垫移植培养物中小细胞外囊泡的逐步方案，为后续功能和转化研究提供了可重复的方法学框架。

Protocol

本研究中使用骨关节炎患者的IPFP组织已获得河北医科大学第一医院伦理委员会批准（批准号为[2024] 018).采样在批准期限内完成，并在组织采集前获得所有参与者书面知情同意。

1. 培养基和溶液的制备

1. 通过混合445毫升基础DMEM/F12培养基、50毫升无外泌体胎儿牛血清（10%）和5毫升青霉素/链霉素/两性霉素B（分别为100 U/mL、100 μg/mL和0.25 μg/mL）制备500毫升外泌体耗尽的完整DMEM/F12培养基。通过0.22微米滤网进行滤除。
2. 通过将950毫升蒸馏水（dH_2O）与50毫升20倍流动缓冲液（Tris/MOPS/SDS）混合，制备西部墨迹缓冲液。
3. 将800毫升dH_2O与100毫升10倍转移缓冲液及100毫升绝对乙醇混合，制备西方墨迹转移缓冲液。
   注意：该快速传输缓冲液专门针对室温下高电流湿传（400 mA）进行了优化。由于其热量产生低，转移时间低于45分钟无需冰浴，这已被证明能维持10–250 kDa范围内蛋白质的高传输效率。
   注意：绝对乙醇是易燃的。在通风良好的环境中活动，远离热源。
4. 通过混合50毫升20 x TBS（200 mM Tris和3 M NaCl，pH 7.5–7.6）和2毫升Tween-20与950毫升 dH₂O混合来制备洗涤缓冲液。
5. 通过混合等量的鲁米醇/增强剂溶液和过氧水缓冲液（每平方厘米膜约需0.1毫升工作液）制备化学发光工作液。
   注意：化学发光基材可能令人不适。戴手套和护目镜。化学废弃物处理应遵循当地机构规定。

2. IPFP组织的制备及调质培养基的收集

1. 每次清洗新鲜获得的IPFP组织（约10克）时，用50毫升预冷却PBS在离心管中轻微搅拌，彻底去除残留血液。
2. 用无菌剪刀或手术刀将IPFP组织切碎，尺寸约为2毫米×2毫米×2毫米。
3. 将IPFP组织片段转移到T175瓶中。加入50毫升外泌体耗尽的DMEM/F12完整培养基。在37°C与5%二氧化碳下孵育48小时，轻微搅拌。
4. 将DMEM/F12完整培养基（即处理培养基）装入50毫升冰管中。通过70微米滤网过滤以去除组织杂质。

3. 利用差动超量离心分离sSV

注意：以下所有步骤请在4°C或冰上执行。

1. 初次低速离心以去除组织碎片
   1. 将调质培养基以300 x g 离心，4°C离心10分钟。 小心收集上清液，并将其转移到新的50毫升离心管中。
   2. 将上清液以3000 x g 离心，4°C离心10分钟。 收集上清液并转移到新的管子中，确保颗粒不受扰动。
2. 中间离心与过滤。
   1. 将上清液以10,000 x g 离心，4°C离心30分钟。
   2. 收集上清液，并用0.22微米真空滤器过滤，去除较大的囊泡和污染物。
3. 首次超速离心：sEV沉淀。
   1. 将过滤后的上清液转移到40毫升聚碳酸酯离心管中。
   2. 使用固定角度转子（k因子=70）以110,000 x g 在4°C下超速离心70分钟。小心地用移液器去除上清液。
   3. 将沉淀重新悬浮于10毫升预冷却的无菌PBS中。用0.22微米注射器过滤悬浮溶液，确保去除残留的聚集物。
4. 第二次超强离心：sEV纯化
   1. 再次以110,000 x g 在4°C下使用固定角度转子（k因子=70）对悬挂进行超离心。
   2. 小心地丢弃上清液，留下sEV沉淀在管底。将最后一个sEV沉淀重新悬浮在200微升无菌PBS中。
   3. 将sEV悬浮液分割成20微升的分量，以防止反复冻融循环造成的损坏。长期保存时应存放于-80°C。

4. 通过西方印迹分析对sEV的表征

1. 准备sEV蛋白样本。
   1. 将步骤3.5.2中的sEV沉淀与80–120微升RIPA溶解缓冲液混合，补充蛋白酶抑制剂。
      注意：目标比例约为1微升RIPA缓冲液与0.5–1.0微克估计蛋白。建议最终蛋白质浓度至少为1.0 μg/μL，以确保高效的电泳分离和在西方印迹分析中高质量的信号检测。
      注意：RIPA缓冲液含有洗涤剂和刺激物。使用个人防护装备。
   2. 短暂地将混合物旋转，然后在冰上孵化样品15至30分钟，并轻轻摇晃。
      注意：此阶段彻底混合对于完全破坏膜和最佳蛋白质释放至关重要。涡旋不足可能导致裂解不完全，且复制体间蛋白质浓度不一致。
   3. 将裂解液离心，压力为12,000–14,000 x g ，离心10–15分钟。仔细收集上清液。
   4. 使用高灵敏度的双金戊酸（BCA）蛋白质分析法测定sEV裂解液的总蛋白浓度。
      注意：由于高灵敏度的BCA检测范围较低（0.5–20 μg/mL），推荐采用高灵敏度的BCA检测法，而非标准BCA检测，从而能够准确定量纯化后sEV制剂中通常较低的蛋白质浓度。按照试剂盒的流程进行检测。
2. 西部印迹分析。
   1. 将蛋白质样本与5个SDS-PAG样本加载缓冲液混合。
      注意：为检测CD63，使用非还原的5倍加载缓冲液（不含β-尯基乙醇）制备样本，并在70°C下培养10分钟。这些条件保留构象表位，防止该四斯宾素蛋白因热引起的聚集。对于其他标志物，包括ALIX（ALG-2相互作用蛋白X）、TSG101（肿瘤易感基因101）和Calnexin，使用含有10%β尣基乙醇的还原5倍加载缓冲液，并在95°C加热5分钟以确保蛋白质完全变性。
   2. 将预制样品（通常为总蛋白20–40微克）装入预制梯度凝胶（4%–12%）中。
   3. 按照制造商的建议，将蛋白质分子量标记加载到指定的井中。
   4. 在运行缓冲液中以恒定电压100伏运行胶体。
   5. 继续运行1–1.5小时，或直到装填染料到达胶体底部。
      注意：运行时间可能因电泳系统和凝胶比例而异。
   6. 使用湿式转移系统，在400 mA下将蛋白质从凝胶转移到PVDF膜，持续30分钟。
      注意：传输时间可能因所用缓冲器品牌而异。
   7. 在含0.2% Tween-20（TBS-T）的三叉缓冲盐水中制备无蛋白阻断缓冲液中封闭膜，室温下轻轻搅拌30分钟。阻断缓冲液配方不含血清蛋白、生物素或磷酸化蛋白，以最大限度减少非特异性结合和背景干扰。
   8. 将膜与稀释的特异性初级抗体一起在含蛋白稳定剂和抗体保留剂的无血清抗体稀释缓冲液中，在4°C（12–16小时）并轻微搅拌下孵育。
   9. 在摇杯上轻轻搅拌，用洗涤缓冲液（TBST，含0.2%Tween-20）清洗膜。
   10. 将该膜与相应的二级抗体一起在室温下培养1小时，并轻轻搅拌。
   11. 再用洗涤缓冲液在摇床上轻轻搅拌，再次清洗膜。
   12. 用化学发光底物观察蛋白质带。
       注意：化学发光基材可能刺激皮肤和眼睛。请佩戴合适的手套和安全眼镜。按照机构有害废物指南处理基材。

5. 通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）对sEV的表征

1. 按照制造商说明，打开纳米颗粒追踪分析仪和注射器泵模块，让系统至少平衡30分钟后再进行测量。
2. 将EV样品轻柔解冻在冰上，并用无菌、无颗粒、含磷酸盐缓冲盐水（PBS）稀释样品，以达到推荐测量范围内的最佳颗粒浓度（约1 x 10⁸ 至1 x 10⁹ 颗粒/mL）。
3. 将稀释后的样品注入无菌注射器，缓慢注入测量腔，确保无气泡进入。
4. 调整摄像机的水平和焦点，以清晰地看到单个粒子表现出布朗运动。
5. 使用注射器泵在恒流条件下为每个样品录制三段60秒视频，以确保颗粒分布一致。
6. 使用NTA软件分析录制视频，检测阈值设为12，模糊大小设为自动，最大跳跃距离设为自动。
7. 利用软件的自动分析功能生成颗粒粒径分布和浓度曲线。
8. 导出原始数据、颗粒粒径分布图和浓度测量数据以进行进一步统计分析。
9. 用无菌无颗粒水彻底清洗测量舱，再倒入70%乙醇，再用无菌无颗粒水冲洗，以防止样品间交叉污染。

6. 透射电子显微镜（TEM）对sEV的表征

1. 使用碳涂层200网铜网格。如果有，使用辉光放电系统对网格进行30秒的辉光放电。
2. 将10微升sEV悬浮液（再悬浮于无菌过滤PBS中）涂于电网，并在室温下孵育2–5分钟。
3. 用滤纸轻轻触摸网格边缘去除多余液体。
4. 通过依次将装有样品的表面放置在三滴超纯水上来清洗网格。
5. 在网格上涂抹10微升2%磷酸溶液（pH 7.0），并在室温下培养1–2分钟。
   注意：磷钨酸是一种腐蚀性酸性试剂，可能刺激皮肤、眼睛和呼吸道。按照机构安全指南进行操作，同时佩戴适当的个人防护装备，包括手套和护目镜。按照批准的危险化学废物程序处理染色废弃物和受污染物质。
6. 用滤纸去除多余的染色，让网格在室温下完全自然风干至少10分钟。
7. 使用以80 kV加速电压运行的透射电子显微镜观察这些栅极。
8. 以适当放大倍率拍摄代表性图像以评估囊泡形态。

Results

通过多模态特征分析，成功分离出人类髌骨下脂肪垫（IPFP）组织中的小型细胞外囊泡（sEVs）。

透射电子显微镜（TEM）显示，分离的囊泡表现出典型的杯状形态，具有明确定义的脂质双层膜，这与sEVs的结构特征一致（见图1）¹¹。

图1：小型细胞外囊泡（sEV）的透射电子显微镜（TEM）。 代表性的透射电子显微镜图像，展示了从髌下脂肪垫（IPFP）组织分离出的典型杯状形态和...

Discussion

该方案提供了一种可重复且实用的工作流程，用于通过切除培养并进行差别超离心，从人类颌骨下脂肪垫（IPFP）组织中分离出小型细胞外囊泡（sEV）。分离出的囊泡通过补充的表征方法得到验证，包括透射电子显微镜（TEM）、纳米粒子跟踪分析（NTA）以及对已^建立EV标记的Western blot检测1。TEM确认存在具有特征形态的膜包囊泡，NTA显示出与sEV群体一致的大小分布，西方印迹分析确认了CD63、Alix和TSG101的存在，同时确认无Calnexin，表明细胞器污染极小。这些发现共同证明了该方案在从IPFP组织中分离结构完整且分子验证的sEVs的有效性和可靠性。

该方案的一个关键方法特征是采用组织外植培养而非酶促消化进行胚胎采集。酶解离方法，如胶原酶消化，可以破坏细胞膜，诱导EV相关表面蛋白的人工蛋白水解，可能改变囊泡组成并引入非囊泡性污染物¹³。相比之下，移植培养保持组织完整性，使活细胞在生理相关条件下分泌囊泡，从而形...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 mL PET离心管	希马克（Eppendorf Himac Technologies）	5720411148	聚对苯二甲酸乙二醇酯，26 x 90毫米
70 & micro;m 细胞过滤	北京兰杰克科技	560049	用于组织碎片清除
抗Alix抗体	上海阿威斯生物技术	7215年公元。	sEV阳性标志
抗Calnexin抗体	上海阿威斯生物技术	公元5839年	负性标记（内质网污染）
抗CD63抗体	亲和生物科学	东风2305	四斯潘宁标记
抗TSG101抗体	上海阿威斯生物技术	5985公元	sEV阳性标志
BCA蛋白质检测套件	上海亚美生物技术	ZJ102	用于蛋白质定量
细胞培养瓶（T175）	NEST生物技术	560229	对于IPFP的移植培养
离心管（50毫升）	生物补充	560041	对于初始低速步进
外泌体耗尽胎牛血清	Cyagen生物科学	FBSNE-01061	用于组织培养
HRP山羊抗兔IgG	上海阿威斯生物技术	AB0101	WB的二级抗体
即时蛋白质加载缓冲液（变性、还原、5&倍;）	上海亚美生物技术	LT101	对于蛋白质变性
微型BCA蛋白质检测套件	热力科学	23235	用于蛋白质定量
Millex-GP滤芯单元（0.22和微型; m)	北京兰杰克科技	560360	无菌，用于囊泡过滤
纳米颗粒跟踪分析仪	马尔文泛林	纳米视线 NS300	用于尺寸和浓度分析
全闪无冰快速传输缓冲器	上海亚美生物技术	PS201S	用于Western blot蛋白转运
磷钨酸（2%）	西格玛-奥尔德里奇	P4006	用于TEM负染色
蛋白质加载缓冲液（变性、非还原、5倍）	上海亚美生物技术	LT103	对于蛋白质变性
无蛋白快速阻断缓冲液（5&倍）	上海亚美生物技术	PS108	对于阻断膜
RIPA裂解缓冲液	北京太阳生物科技有限公司有限公司	R0010	用于sEV蛋白提取
TBS（20次以上;）	北京太阳生物科技有限公司有限公司	T1080	用于准备洗涤缓冲
透射电子显微镜	日立	HT7800	用于形态特征
Tris/MOPS/SDS电泳缓冲器	上海亚美生物技术	PS120	用于蛋白质分离
Tween-20	北京太阳生物科技有限公司有限公司	T8220	用于准备洗涤缓冲
超速离心机	希马克（Eppendorf Himac Technologies）	CP100NX	高速隔离系统
超灵敏化学发光检测套件	上海亚美生物技术	SQ201	用于蛋白质带可视化
通用抗体稀释缓冲液	上海亚美生物技术	PS119L	针对一级/二级抗体