大鼠大脑中动脉选择性永久性阻塞：研究运动与空间记忆障碍的实验方法

摘要

本研究的目的是建立一种可重复的方法，用于在大鼠中实施开颅术，随后进行永久性、选择性大脑中动脉阻塞，以应用于运动和空间记忆缺陷的实验研究。

摘要

缺血性卒中（IS）具有重要的临床意义，需要通过实验方法推动新型辅助疗法的开发。由于大鼠脑血管解剖结构与人类相似，因此被广泛用作IS的实验模型。然而，目前仍需建立能够更真实模拟人类缺血环境的方法，并优先采用选择性动脉阻塞的技术。在此背景下，本研究旨在建立一种可重复的大鼠开颅术联合大脑中动脉（MCA）永久性、选择性阻塞的方法，以标准化模型并降低在运动功能及空间记忆障碍研究中的技术难度。28只Wistar 大鼠（N = 28）被均分为两组：一组仅接受开颅术（假手术组，SHAM），另一组接受开颅术后选择性MCA阻塞（MCAO组）。术后第7天和第8天分别进行姿势测试和物体位置识别记忆测试。安乐死后采集脑组织标本，并制备尼氏染色的组织学切片。为验证该方法的可行性与有效性，我们制定了详细的手术操作流程，包括术前准备、麻醉、体位固定、开颅、MCAO及伤口闭合。实验结果显示，MCAO组在姿势测试（p = 0.015）和物体位置识别记忆测试（p < 0.001）中均表现出显著功能缺陷。组织学分析证实了该方法的选择性，损伤主要累及与海马相关的脑区，如外嗅皮层、内嗅皮层和梨状皮层，以及外囊，而深部脑结构得以保留。该实验方案被证实是一种可在大鼠中诱导选择性MCA缺血的可重复且有效的方法，为研究缺血性卒中的病理生理机制及治疗策略提供了一种可靠且技术上易于实施的实验工具。

引言

缺血性卒中（IS）中，梗死区域周围的缺血半暗带若能及时接受治疗，功能尚可恢复，治疗目标在于预防或减轻运动及记忆功能障碍¹。然而，诸如化学溶栓和机械取栓等疗法在临床实践中仍难以被广大人群获得²，因此有必要建立实验模型以探索更为普及的治疗策略。由于动物实验具有良好的可重复性，并能分析侧支循环情况，因而在研究中不可或缺³，其中大鼠被广泛应用于IS模型⁴。由于大脑中动脉（MCA）的血管直径与人类IS具有高度相关性⁵，在动脉闭塞的实验研究中，MCA成为主要的目标血管^6,7,8。

目前用于诱导脑缺血的最常用动物模型之一是基于尼龙线的血管内闭塞法，随后进行再灌注^9,10。然而，由于尼龙线在大脑中动脉（MCA）内精确定位存在差异，可能意外阻塞Willis环邻近血管，手术过程中需结扎颈外动脉（ECA）而产生侧支循环影响，以及闭塞持续时间不同等因素，导致在荟萃分析中出现结果不一致的情况^11,12。

在临床情况下，大多数患有缺血性卒中（IS）的患者并未实现脑部再灌注，且不表现出与颈外动脉（ECA）阻塞相关的下丘脑损伤或后遗症，这凸显了需要采用不伴随再灌注的实验方法来诱导选择性缺血。一种替代方法是通过开颅术实施永久性大脑中动脉阻塞（MCAO）。通过直接可视化大脑中动脉（MCA），选择性阻断可避免因颈外动脉结扎以及前脉络膜动脉、下丘脑动脉和大脑后动脉损伤所导致的损害¹³，从而产生更接近腔隙性梗死中所观察到的缺血效应。

近期研究表明，缺血性卒中（IS）的动物模型应表现出缺血区域与不良临床结局之间更密切的相关性^14,15。开发能够实现靶向诱导缺血且最大限度减少干扰实验结果的并发症的技术替代方案，似乎是目前最合适的策略。在此背景下，本方案旨在建立一种可重复的大鼠颅骨切除术后永久性、选择性大脑中动脉阻塞（MCAO）方法，以标准化模型并降低技术难度，用于运动功能和空间记忆缺陷的相关研究。该方法借鉴了经典研究^16,17,18,19 ，这些研究显示出较高的存活率，支持长期评估。

以大脑下静脉（ICV）作为解剖学标志，本方案旨在消除以往被认为限制该方法应用的主要技术难点，从而实现对急性期和慢性期选择性脑缺血的有效研究。除对缺血脑区进行组织学分析外，还通过评估运动功能和空间记忆来验证所建立的损伤模型所诱导的功能缺陷。

方案

本方案遵循国家动物实验控制委员会（CONCEA）制定的实验动物护理与使用指南，并已获得巴拉那州西部州立大学（UNIOESTE）实验动物伦理委员会（CEUA）的批准，方案编号为25-23。

1. 术前准备

1. 准备手术器械、纱布、棉垫，并调整体视显微镜的位置（图1）。
2. 使用70%乙醇清洁手术台和设备。准备无菌手术器械，并采用无菌技术进行所有手术操作。

2. 麻醉

1. 使用氯胺酮（3.75 mL）、赛拉嗪（2.5 mL）和0.9%氯化钠（3.75 mL）的混合物诱导麻醉。按每100 g体重0.2 mL的剂量进行腹腔注射。通过后肢足垫或尾部夹捏反应确认麻醉深度。
2. 必要时，给予相当于最大剂量三分之一的追加剂量，以避免过量。
3. 腹腔注射预防性抗生素恩诺沙星（20 mg/kg）和镇痛剂盐酸曲马多（12 mg/kg）。
4. 测量直肠温度，并在整个手术过程中使用加热垫将体温维持在37°C（± 2°C）。

3. 定位

1. 将大鼠置于显微镜载物台上的棉垫上，呈侧卧位（图1A）。用一小软垫支撑头部，并将其调整至180°，以暴露颅骨左侧侧面。用胶带固定头部（图2A）。
2. 滴加润滑性眼药水，并用胶带将眼睑闭合。
3. 重新检查直肠温度，必要时调节加热装置。

4. 开颅术

1. 使用微型剃毛器或刀片在眶外侧缘与耳屏之间进行剃毛处理（约 1.6 cm × 0.5 cm）（图 1B）。
2. 先用 2% 氯己定擦洗剂，再用 0.2% 氯己定水溶液对剃毛区域进行消毒。
3. 使用直剪刀做长约 1 cm 的皮肤及皮下切口（图 1C），切口位置应保持在眶外侧缘后方 0.3 cm 及耳屏前方 0.3 cm 的范围内（图 2B）。
   ​注意：使用 Adson 镊子（图 1D）或止血钳牵开该层组织。
4. 使用电凝器识别并凝固浅颞血管的中颞支（图 1E）。
5. 使用 Freer 剥离器触诊颧弓（图 1F），并纵向切开颞肌筋膜。
6. 向头侧和尾侧分离颞肌，暴露颞骨和额骨以及部分咬肌。沿纵轴分离颧弓，并切除约 0.5 cm 的骨段（图 2C）。
   1. 注意事项：
      1. 使用压迫或电凝控制上颌血管的前深颞支出血。
      2. 避免做后斜向切口，以防损伤颞下颌关节。
      3. 避免损伤位于颧弓下方的眶外泪腺。
      4. 避免打开眶腔。
7. 在颧弓切除部位后方紧邻处，使用安装于低速旋转马达上的直径为 3.5 mm 的圆形金刚砂钻头钻开外侧颞骨（图 2D）（图 1G）。间歇性地用 0.9% 生理盐水冲洗，以防止热损伤。将小骨片保留在硬脑膜上（图 2E），并用 Halstead 镊子轻柔移除（图 1H）。
   ​注意：也可选用更小钻头进行颅骨切除，但会增加硬脑膜和脑组织损伤的风险。

5. 大脑中动脉闭塞（图3）

1. 使用6 mm × 0.25 mm的超细针切开硬脑膜。
   注意：避免损伤邻近的皮层血管。
2. 在颅骨开窗下方识别下脑静脉（ICV），并在其上方垂直走行的中脑动脉（MCA）（图3A，C）。在颅骨开窗区域的中央，识别位于基底部且最粗大的MCA分支。
3. 使用精细持针器，将不可吸收的8-0聚丙烯缝线环绕MCA（图3B和图1I），打三个结以闭塞血管（图3C）。
   注意：也可使用其他不可吸收缝线，如尼龙线、棉线或丝线。
4. 确认远端血流消失。若存在额外的MCA分支，也应予以结扎。
5. 用生理盐水冲洗术区，并根据需要使用电凝或轻柔压迫止血。
   ​注意：避免凝固脑组织，以防产生组织学或神经炎症性伪影。

6. 封闭

1. 在可能的情况下，重新对合硬脑膜。
2. 逐层缝合深层肌肉，并使用可吸收的4-0缝线缝合颞肌筋膜（图3D）。
3. 采用可吸收的4-0聚乳酸-羟基乙酸共聚物910缝线，以连续缝合方式关闭皮下和皮肤层。
   注意：避免留出暴露的缝线末端。推荐使用连续缝合。
4. 使用0.2%的氯己定水溶液清洁手术部位。
5. 在动物从麻醉中恢复期间保持其体温。在将其送回笼子前监测其体温。整个手术过程（从皮肤切开至伤口闭合）通常持续30分钟至45分钟。
6. 术后在手术后12小时经腹腔给予第二剂盐酸曲马多（12 mg/kg），用于术后镇痛。术后第二天给予第二剂预防性抗生素。

结果

共使用28只雄性Wistar大鼠（10–12周龄，平均体重349 g），随机均分为两组：MCAO组（接受完整实验方案）和SHAM组（仅接受开颅手术步骤）。本研究中有3只动物在术中因静脉出血（2只MCAO组）或开颅过程中出现轻微皮质损伤（1只SHAM组）而被剔除并立即替换。另有1只MCAO组动物在术后第5天死亡。该模型的总体死亡率为3.6%。最终分析样本共包含27只动物。运动功能和空间记忆表现分别在术后第7天和第8天进行评估（图4，图5）。

术后第7天通过姿势测试评估运动功能。将大鼠用尾巴悬吊，观察其对侧前肢的运动情况（图4A）。无神经功能缺损的动物双侧前肢完全伸展，评分为0分；发生缺血性损伤的大鼠则表现为对侧前肢屈曲或内旋，评分为1分。所有假手术组动物评分为0（0 ± 0），而MCAO组动物评分为0.67 ± 0.52。Fisher精确检验显示两组间差异具有统计学意义（p = 0.015）（

讨论

自1975年以来，大鼠MCAO模型已被用作脑缺血的实验范式^16,17 ，并经过多年改进，在诱导神经功能损伤方面表现出良好的效果^{8,22,23,24,25,26,27,28}。由于直接进行神经外科手术进入大脑中动脉（MCA）存在技术难度，血管内缝线阻塞技术逐渐被广泛采用，目前已成为脑缺血研究中最常用的方法^12,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
阿德森有齿镊	ABC stainless	L47-P4-164	其他公司可能提供不同选择
卡斯特罗维霍持针器	Golgran	135-3	其他公司可能提供不同选择
电凝器	Chunguang medical	128	其他公司可能提供不同选择
弗里尔骨膜剥离器	ABC stainless	47P4-819	其他公司可能提供不同选择
哈尔斯特德弯钳	ABC stainless	AI1055	其他公司可能提供不同选择
微型钻机	Nail drill	ZS-710	其他公司可能提供不同选择
小型剃毛器	Kemei	KM-666	其他公司可能提供不同选择
Prolene	Ethicon	8730H	8-0 规格缝线
体视显微镜	Alltion	ASM-112	其他公司可能提供不同选择
直剪刀	ABC stainless	L23-W4	其他公司可能提供不同选择
外科敷料垫	Cremer	158595	其他公司可能提供不同选择
外科纱布	Cremer	198669	其他公司可能提供不同选择
温度计	G-Tech	DMT-2027	其他公司可能提供不同选择
Vicryl	Ethicon	VCP346H	4-0 规格缝线