大鼠大脑中动脉选择性永久性阻塞：研究运动与空间记忆障碍的实验方法

摘要

本研究的目的是建立一种可重复的方法，用于在大鼠中实施开颅术，随后进行永久性、选择性大脑中动脉阻塞，以应用于运动和空间记忆缺陷的实验研究。

摘要

缺血性卒中（IS）具有重要的临床意义，需要通过实验方法推动新型辅助疗法的开发。由于大鼠脑血管解剖结构与人类相似，因此被广泛用作IS的实验模型。然而，目前仍需建立能够更真实模拟人类缺血环境的方法，并优先采用选择性动脉阻塞的技术。在此背景下，本研究旨在建立一种可重复的大鼠开颅术联合大脑中动脉（MCA）永久性、选择性阻塞的方法，以标准化模型并降低在运动功能及空间记忆障碍研究中的技术难度。28只Wistar 大鼠（N = 28）被均分为两组：一组仅接受开颅术（假手术组，SHAM），另一组接受开颅术后选择性MCA阻塞（MCAO组）。术后第7天和第8天分别进行姿势测试和物体位置识别记忆测试。安乐死后采集脑组织标本，并制备尼氏染色的组织学切片。为验证该方法的可行性与有效性，我们制定了详细的手术操作流程，包括术前准备、麻醉、体位固定、开颅、MCAO及伤口闭合。实验结果显示，MCAO组在姿势测试（p = 0.015）和物体位置识别记忆测试（p < 0.001）中均表现出显著功能缺陷。组织学分析证实了该方法的选择性，损伤主要累及与海马相关的脑区，如外嗅皮层、内嗅皮层和梨状皮层，以及外囊，而深部脑结构得以保留。该实验方案被证实是一种可在大鼠中诱导选择性MCA缺血的可重复且有效的方法，为研究缺血性卒中的病理生理机制及治疗策略提供了一种可靠且技术上易于实施的实验工具。

引言

缺血性卒中（IS）中，梗死区域周围的缺血半暗带若能及时接受治疗，功能尚可恢复，治疗目标在于预防或减轻运动及记忆功能障碍¹。然而，诸如化学溶栓和机械取栓等疗法在临床实践中仍难以被广大人群获得²，因此有必要建立实验模型以探索更为普及的治疗策略。由于动物实验具有良好的可重复性，并能分析侧支循环情况，因而在研究中不可或缺³，其中大鼠被广泛应用于IS模型⁴。由于大脑中动脉（MCA）的血管直径与人类IS具有高度相关性⁵，在动脉闭塞的实验研究中，MCA成为主要的目标血管^6,7,8。

目前用于诱导脑缺血的最常用动物模型之一是基于尼龙线的血管内闭塞法，随后进行再灌注^9,10。然而，由于尼龙线在大脑中动脉（MCA）内精确定位存在差异，可能意外阻塞Willis环邻近血管，手术过程中需结扎颈外动脉（ECA）而产生侧支循环影响，以及闭塞持续时间不同等因素，导致在荟萃....

方案

本方案遵循国家动物实验控制委员会（CONCEA）制定的实验动物护理与使用指南，并已获得巴拉那州西部州立大学（UNIOESTE）实验动物伦理委员会（CEUA）的批准，方案编号为25-23。

1. 术前准备

1. 准备手术器械、纱布、棉垫，并调整体视显微镜的位置（图1）。
2. 使用70%乙醇清洁手术台和设备。准备无菌手术器械，并采用无菌技术进行所有手术操作。

2. 麻醉

1. 使用氯胺酮（3.75 mL）、赛拉嗪（2.5 mL）和0.9%氯化钠（3.75 mL）的混合物诱导麻醉。按每100 g体重0.2 mL的剂量进行腹腔注射。通过后肢足垫或尾部夹捏反应确认麻醉深度。
2. 必要时，给予相当于最大剂量三分之一的追加剂量，以避免过量。
3. 腹腔注射预防性抗生素恩诺沙星（20 mg/kg）和镇痛剂盐酸曲马多（12 mg/kg）。
4. 测量直肠温度，并在整个手术过程中使用加热垫将体温维持在37°C（± 2°C）。

3. 定位

1. 将大鼠置于显微镜载物台上的棉垫上，呈侧卧位（....

结果

共使用28只雄性Wistar大鼠（10–12周龄，平均体重349 g），随机均分为两组：MCAO组（接受完整实验方案）和SHAM组（仅接受开颅手术步骤）。本研究中有3只动物在术中因静脉出血（2只MCAO组）或开颅过程中出现轻微皮质损伤（1只SHAM组）而被剔除并立即替换。另有1只MCAO组动物在术后第5天死亡。该模型的总体死亡率为3.6%。最终分析样本共包含27只动物。运动功能和空间记忆表现分别在术后第7天和第8天进行评估（图4，图5）。

术后第7天通过姿势测试评估运动功能。将大鼠用尾巴悬吊，观察其对侧前肢的运动情况（图4A）。无神经功能缺损的动物双侧前肢完全伸展，评分为0分；发生缺血性损伤的大鼠则表现为对侧前肢屈曲或内旋，评分为1分。所有假手术组动物评分为0（0 ± 0），而MCAO组动物评分为0.67 ± 0.52。Fisher精确检验显示两组间差异具有统计学意义（p = 0.015）（

讨论

自1975年以来，大鼠MCAO模型已被用作脑缺血的实验范式^16,17 ，并经过多年改进，在诱导神经功能损伤方面表现出良好的效果^{8,22,23,24,25,26,27,28}。由于直接进行神经外科手术进入大脑中动脉（MCA）存在技术难度，血管内缝线阻塞技术逐渐被广泛采用，目前已成为脑缺血研究中最常用的方法^12,

材料

本文使用的材料清单

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