绿色合成来自本地新热带稀树草原植物的镁纳米颗粒，用于可扩展的纳米植物美容配方

摘要

本研究描述了利用来自新热带原生稀树草原的 斯特里芬德龙植物 提取物——绿色合成镁纳米颗粒的方案，随后将其纳入化妆品血清配方中进行评估。

摘要

本研究描述了利用新热带稀树草原原生植物 Stryphnodendron adstringens乙醇提取物，合成含镁基纳米颗粒的绿色合成方案，并将其纳入纳米植物化妆品配方中。该过程包括采集和制备植物材料，随后进行乙醇提取，其中植物化学物质作为镁离子的还原和稳定剂。纳米颗粒在受控条件下使用氯化镁和植物提取物合成，实现环保且不使用还毒剂的过程。通过动态光散射和原子力显微镜法，对纳米颗粒的性质进行表征，以评估尺寸分布、形态和胶体行为。该方案进一步描述了将合成纳米颗粒纳入美容血清配方的过程。稳定性通过监测器官性质、pH值和粘度来评估受控储存条件。该方法为生产植物介导的镁纳米颗粒和评估其在化妆品配方中的应用提供了一种可重复且可持续的方法。

引言

塞拉多植物地理区是南美洲最大的新热带稀树草原地层，代表了世界上生物多样性最丰富的热带稀树草原地区。该生态系统孕育了数千种富含二次代谢物的植物物种，如类黄酮、多酚、萜烯和酚酸，其中许多具有被证实的抗氧化、抗炎和光保护活性，这些作用对化妆品和制药行业具有重要意义 1,2,3,4 .这些植物化学物质被广泛用作功能性化妆品配方中的高价值活性成分。除了生物活性外，许多多酚和类黄酮中存在的羟基和羰基官能团，使它们能够作为溶液^5,6中金属离子的天然还原和稳定剂。这一化学特性在绿色纳米技术中被越来越多地探索，用于合成金属纳米颗粒，为开发源自新热带生物多样性2,3,4,5,6的可持续化妆品配方提供了有前景且尚未充分探索的机会。

传统上，纳米颗粒（NP）通过自上而下方法生产，即通过激光烧灼或溅射等物理方法将散装材料分解为纳米级颗粒;以及自下而上方法，通过化学或生物路径从更小单元组成NPs^。虽然化学和物理方法有效，但通常依赖有毒试剂、高能耗和复杂设备。这促使绿色化学方法兴起，强调纳米^{材料生产的}可持续性、环保性和安全性。

在此框架下，绿色合成的NPs获得了广泛关注。植物植物化学物质能够同时作为还原、稳定和封盖剂，实现金属及金属氧化物不涂种的高效合成，同时传统方法的局限性（需要专用设备、极端条件并产生有毒废物），这使得开发一种在适等条件下运行的绿色合成方案具有可扩展性， 并且不产生有害副产物6,7,8,9。在该策略探索的金属氧化物纳米颗粒中，镁纳米颗粒（MgNPs）相较银纳米颗粒（AgNPs）和氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）具有显著优势，因为MgNPs不具生物积累倾向，在人体细胞中表现出较低的细胞毒性，并且被美国食品药品监督管理局（FDA）认可为对^{人体应用普遍}安全的物质^。11。此外，使用Cerrado植物提取物合成的MgNPs预计将镁的抗氧化和抗菌特性与提取物中存在的生物活性植物化学物质结合，从而提升其相较于传统合成品的美容功能价值¹⁰。

在化妆品行业，纳米技术的应用通过提升活性成分的递送、稳定性和有效性，彻底改变了产品开发。自然护理品可以更深入皮肤，提供可控释放，保护敏感化合物免受降解，因此它们在针对皮肤老化、色素沉着、痤疮和防晒的配方中极具^价值。尽管有这些已有文献证明的优势，利用新热带稀树草原本地植物作为还原剂进行MgNPs的绿色合成，作为化妆品应用的还原剂，仍大多未被充分探索，且缺乏方法学标准化，这与亚洲、非洲和欧洲植物的广泛报道形成鲜明对比 11,12,13,14.大多数现有研究对NPs在功能性化妆品配方中的掺入及其在受控储存条件下的稳定性关注有限，11,14,15。本方案通过整合新热带植物群中MgNPs的绿色合成、将其纳入纳米植物美容血清，以及全面评估其物理化学和功能稳定性，以单一且可重复的方法学方式填补这一方法学空白。

该方案的总体目标是描述一种标准化、可重复且可扩展的MgNPs绿色合成方法，使用原生于塞拉多新热带稀树草原的斯特 林根植物Stryphnodendron adstringens，作为还原剂和稳定剂，从而利用其内在的生物活性特性在面部精华配方中发挥作用。从 弦线链草 合成的MgNPs用于人体局部应用，是一种新型纳米配方，目前受巴西专利保护（BR 10 2025 015416 1）。拟议的实验设计代表了一种可持续且生物相容性的NP生产方法，避免使用传统NP合成中常用的毒性还原剂，同时促进具有潜在生物活性的植物化学物质的掺入。该方案特别适合寻求环保纳米颗粒制造方法的研究人员，用于化妆品、制药或生物医学应用，尤其是在富含类黄酮和多酚的植物提取物可用时。由于这些化合物具有天然还原和稳定作用，该方案可轻易适应其他具有相似植物化学特征的植物，从而根据当地植物材料的可得性，将其应用于不同生物地理区域的本地植物群。

方案

1. 植物材料

1. 选片与文献
   1. 选择生长在自然环境代表区域的健康 S. adstringens 植物进行树皮采集。记录采样地点、采集日期、使用GPS设备地理坐标及采集时的当地环境条件。
   2. 利用专门的分类文献对新热带稀树草原物种进行植物鉴定。请咨询合格的^分类学家确认鉴定。
   3. 收集并分离代表性的植物材料以供标本馆记录，包括营养和生殖结构（如叶子、花朵、果实和小枝条）。
      注意： 采集标本馆材料时，应与用于实验程序的树皮分开采集。使用标准标本馆技术压榨和干燥植物材料，安装凭证标本，并将其存放于公认的标本馆以确保可追溯性。
2. 树皮收集
   1. 采集（联邦生物研究院、联邦化学工业局）树干 31–39 阶段的树皮，对应之前物候学研究中描述的营养生长阶段^16,17。
      注意： 将收集的物质存放在深色袋中，以防止次级代谢物的降解，也防止次级代谢物的降解。
3. 湿度测定
   1. 用分析天平称重树皮样本。将材料分为三份，记录初始重量。
   2. 将树皮样本放入105°C的烤箱中。 将样品晾干至重量恒定。
      注意： 当两次连续测量相差不超过1毫克时，重量恒定，表示水分完全去除。
   3. 将样品从烤箱取出，冷却至室温，并记录最终重量。使用以下方程计算含水量和干物质：
      
      干物质（%） = 100 - 湿度（%）
      其中：
      W1 = 空容器重量
      W2 = 容器重量 + 干燥前样品
      W3 = 容器重量 + 干燥后样品

2. 提取物制备

注意： 所有涉及危险物质的程序均遵循国际公认的化学安全指南¹⁸。

1. 用流动水冲洗新鲜采集的树皮，去除土壤、灰尘和表面杂质。
2. 将树皮样本放入36°C的烤箱，烘烤72小时。用刀磨机将干树皮磨成细粉。
3. 称重200克树皮粉，转移到Erlenmeyer瓶中。加入1000毫升98%乙醇。
   注意： 乙醇极易燃烧。避免接触点火源，并在通风良好的区域工作。
4. 密封瓶子，在室温下保存72小时，避免光照。每24小时搅拌一次混合物。
5. 先用金属网过滤提取物，然后用漏斗过滤棉花以去除残留杂质。

3. 抗氧化活性评估

1. 在甲醇中制备100 mM DPPH（2,2-二苯基-1-picrylhydrazyl）溶液。
   注意： 甲醇有毒且极易燃。在排气柜内使用，并佩戴适当的个人防护装备。 DPPH具有刺激性，吸入或摄入可能有害。避免直接接触和吸入。
   注意： 在低光环境下进行检测，保护溶液免受光照影响，同时注意甲醇和DPPH的操作，务必戴手套进行。
2. 将乙醇S . adstringens 树皮提取物稀释于甲醇中，得到0.1%至5%（v/v）的浓度。准备与阳性对照相同浓度的维生素C溶液。
3. 向96孔板的每个孔注入100微升DPPH溶液。
4. 每孔加入50微升提取物或维生素C溶液。
   注意： 使用DPPH+甲醇作为负对照，单独使用甲醇作为空白。所有测量都要四倍进行。
5. 将培养盘在室温下、黑暗中孵育30分钟。
6. 用分光光度计测量515纳米的吸收。
7. 使用以下公式计算激进扫气活动：
   
   其中：
   ABS控制=DPPH+甲醇的吸附度
   ABS样品=DPPH吸光度+提取物

4. 细胞存活率分析

1. 在RPMI-1640培养基中培养正常人类皮肤成纤维细胞（NHDF），补充10%胎儿牛血清和1%青霉素-链霉素。保持细胞温度为37°C，二氧化碳含量为5%。
2. 将种子细胞放入96孔板中，每孔3个×10个^4个细胞 ，培养24小时。
3. 将培养基替换为100微升新鲜培养基，并加入50微升萃取液。潜伏24小时。
4. 去除培养基，向每个井加入10微升MTT溶液。潜伏4小时以形成福尔马赞。
   注意： MTT试剂有毒，应戴手套并佩戴适当的防护装备处理。避免皮肤和眼神接触。
5. 加入60微升溶解溶液（异丙醇中的HCl）以溶解晶体。
   注意： 盐酸具有腐蚀性，可能导致严重烧伤。使用适当的防护设备，并在排气罩内工作。异丙醇易燃，应在通风良好的区域远离点燃源处处理。
6. 用分光光度计测量540纳米的吸收。
   注意： 细胞存活能力检测在处理组和未处理对照组中进行，每种条件均在四倍孔中分析。
7. 计算细胞存活率的方法包括：
   细胞存活率（%） = （ABS样本提取物/ABS细胞控制）×100
   其中：
   ABS细胞控制=仅含细胞和培养基的未处理对照阱吸收率。
   ABS样品提取物=含有植物提取物处理细胞的阱吸收率。

5. 镁纳米颗粒的绿色合成

1. 向无菌反应管中加入9890微升蒸馏水。
2. 加入100微升植物提取物。
3. 加入10微升1 M MgCl₂，最终浓度为10 mM。
   注意： 氯化镁可能会引起刺激。请佩戴适当的防护装备，避免接触眼睛和皮肤。
   注意： 碱基反应由1%（v/v）提取物+10 mM MgCl₂组成，总体积为10 mL。为了优化NP形成，可以在保持最终体积和MgCl₂浓度的同时调整提取物浓度。
4. 充分搅拌以均匀化溶液。
5. 在75°C下孵育18小时。
   注意： 高温可能导致烧伤。处理加热样品时请使用适当的防护设备。
   注意： 颜色变化可能表明纳米颗粒的形成。
6. 让混合物冷却至室温后再进行表征。

6. 纳米颗粒表征

1. 动态光散射（DLS）
   1. 将~750微升的纳米颗粒悬浮液转移到测量单元中。
   2. 将电池放入仪器中，在25°C下进行测量。
   3. 使用适当的检测模式获取颗粒尺寸数据。
   4. 对每个样本进行三份分析，每次测量分五次子样本。
2. 原子力显微镜（AFM）
   1. 将10微升纳米颗粒悬浮液沉积在新切割的云母上。
   2. 将样品放入干燥器中晾干2小时。
   3. 用20微升过滤蒸馏水轻轻冲洗云母片三次。将样品放回干燥器，在室温下再干燥2小时。
      注意： 冲洗可以去除多余的盐分，提升图像质量。
   4. 根据制造商说明，通过进行仪器设置和激光校准来配置原子力显微镜。获取扫描面积为500×500纳米的NP表面图像。
      注意： AFM用于定性评估表面粗糙度，并可视化由 S. adstringens合成的MgNPs的形态特征，生成高分辨率的三维表面图像。

7. 纳米植物美容配方

1. 加热阶段
   1. 将29.7克净水、0.50克羟基纤维素（HEC）和3克甘油装入不同容器。
   2. 将水放入磁性搅拌器中，轻轻搅拌至70–75°C。
   3. 搅拌时逐渐加入HEC到加热水中，避免结块。
      注意：补水可能需要15–30分钟。
   4. 加入甘油，搅拌至均匀。
2. 冷却阶段
   1. 分别在单独的烧杯中，分别加30克纯水、3克烟酰胺、33.3克由 S. adstringens合成的MgNPs、0.3克低分子量透明质酸，以及0.2克苄醇和脱氢乙酸，形成冷却阶段。
   2. 将烟酰胺完全溶解在室温水中。
   3. 加入透明质酸，搅拌至均匀。
   4. 加入 S. adstringens MgNPs，轻轻搅拌。
   5. 加入防腐剂并搅拌均匀。
3. 混音
   1. 将加热相冷却至~40°C。
   2. 搅拌时，慢慢将冷却阶段加入加热阶段。
   3. 测量配方的pH值。对于含有烟酰胺的血清制剂，目标pH值为5.0–6.5是合适的。
      注意： 烟酰胺的pH值在中性到微酸性之间保持稳定。如有需要，可使用少量柠檬酸或氢氧化钠来调节pH值。

8. 外观稳定性评估

1. 初步稳定期（12天）
   1. 准备四个化妆品血清的复制样品，装在密封容器中。
   2. 对样品进行连续六次冻融循环。样品在50°C下保存24小时，然后在−5°C下保存24小时，每48小时完成一个完整循环。
   3. 每次循环结束后，通过目视检查配方外观、颜色、气味和相分离的变化，记录器官特性。
   4. 使用校准的数字pH计在室温下测量四个样品的pH值。根据设备制造商的说明，使用旋转粘度计测定粘度。
      注意： 10%的变异≤可以接受。超过该阈值的变化可能表明配方不稳定，应进一步调查。如果配方通过初步研究，进行加速稳定性测定。
2. 加速稳定（90天）
   1. 准备八份化妆品配方样品。四个样本储存在50°C，四个样本储存在4°C。
   2. 评估时间为0、1、7、15、30、60和90天。
   3. 通过目视检查配方的外观、颜色、气味和相分离变化，评估并记录器官特性。
   4. 使用校准的数字pH计在室温下测量样品的pH值。根据设备制造商的说明，使用旋转粘度计测定粘度。
      注意： 稳定性评估是根据巴西卫生监测机构¹⁹号制定的指导方针进行的。在美国，稳定性测试遵循FDA的建议²⁰。在欧盟，稳定性评估符合欧盟第1223/^{2009 21}号条例，要求必须包含化妆品安全报告（CPSR）。该法规附件I要求有记录的稳定性数据，以支持化妆品配方的安全性和保质期，测试通常遵循统一指南ISO/TR 18811：^{2018 22}《化妆品稳定性测试指南》进行。

结果

植物树皮的干燥过程是保护生物活性化合物并确保其在食品、制药和化妆品行业中适用性的关键步骤。相反，干燥不足会导致过度变色、香气流失、微生物污染以及生物活性化合物降解，从而影响生树皮的质量。 表1 总结了区分正确干燥与不当干燥植物材料的标准。

这些因素共同强调，充分干燥不仅是一种保护技术，更是维持富含酚类化合物植物功能和工业价值的关键因素，这些植物具有潜在的美容应用价值。适当干燥可将含水量降至安全水平，防止微生物生长，并保持酚类化合物、单宁和类黄酮的完整性，这些成分与抗氧化能力直接相关 23,24,25。植物提取物抗氧化活性的评估决定了其生物学潜力和潜在的工业应用。提取物应表现出剂量依赖性反应和低IC₅₀值，表明在低浓度下具有有效性（见图1A...

讨论

本文介绍的方案描述了利用S. adstringens提取物及其掺入纳米植物美容血清配方的MgNPs绿色合成的可重复流程。确保结果可靠，有几个关键步骤。首先，植物材料的采集和记录必须严格标准化，包括准确记录地理坐标、环境条件和物候阶段，因为植物生理和次级代谢物含量的变异性会直接影响提取物的组成，从而影响NP还原和稳定的效率^16,17。

含水量是一个基本参数，因为植物材料中过多的水分会促进化合物的化学和微生物降解，从而损害提取物的标准化和稳定性，²³。因此，在加工过程中监测水分水平非常重要，以确保可重复性，因为植物材料的含水率通常在60%到80%之间。此外，干燥条件需要严格控制，因为过高温度会降解易热的次级代谢物，尤其是挥发性化合物，从而影响提取物的组成和生物活性^24,25

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔板	西格玛-奥尔德里奇	M0812	细胞检测
苄醇与脱氢醋酸	西格玛-奥尔德里奇	1,09,626	防腐剂
离心管（15 mL / 50 mL）	猎鹰（康宁）	430766	采样处理
柠檬酸	西格玛-奥尔德里奇	C0759	pH调节
CO2 孵化器	热飞世科学	3110	用于细胞培养的CO2培养箱
棉滤材料	本地供应商	LH R/260	过滤
干燥器	默克 	BAF424002141	干燥
DPPH（2,2-二苯-1-苦肼）	西格玛-奥尔德里奇	D9132	抗氧化测定
烘干烤箱	诺瓦与伊库特;蒂卡	400/5NDR	用于干燥植物材料的烤箱
简易烤箱	钢铁	SSE-85L	用于外观稳定性检测的烤箱
Erlenmeyer瓶 1000毫升	VIDROLABOR	76200B01000	提取
乙醇（98%）	Dinamica-Quimica contemporanea	P.10.0051.015.36	萃取溶剂
胎儿牛血清（FBS）	Gibco（Thermo Fisher）	ES-009-C	补充
冷冻室	盖洛帕	GTPC-575	用于稳定性测定的冷冻柜
甘油	植物木	TBV084.003904.086	保湿剂
透明质酸（低分子量）	植物木	J201220136	补水剂
盐酸（HCl）	西格玛-奥尔德里奇	1,00,317	MTT溶解
羟基纤维素（HEC）	植物木	AH230641697	增稠剂
异丙醇	西格玛-奥尔德里奇	100995	MTT溶解
刀具磨坊	7实验室	920Willye 4×四刀	研磨叶子、根、种子和块茎
氯化镁（MgCl2）	西格玛-奥尔德里奇	1,01,872	纳米颗粒合成
磁性搅拌器;热板	伊卡	5030000	混音
甲醇	西格玛-奥尔德里奇	900641	DPPH测定
云母板	热飞世科学	NC9655733	AFM制备
微板读器	热飞世科学	Multiskan GO 1510-03581	微板读器
MTT试剂	西格玛-奥尔德里奇	CT01-5	细胞存活率测定
NHDF细胞	BCRJ	0089	人类皮肤成纤维细胞
烟酰胺	植物木	211847	活性成分
烤箱	Termo Scientific	PR305225M	干燥
青霉素&达什;链霉素	Gibco（Thermo Fisher）	15140122	抗生素
pH表	数字医疗	DM-220	用于稳定性测定中的单调pH值
移液器和吸头......	埃彭多夫	30078551	液体处理
纯净/蒸馏水	默克（Milli-Q）	ZIX7010T0C	一般用途
冰箱	金属弗里奥	VB40W	用于稳定性测定的冰箱
旋转粘度计	诺沃斯特	VISC-5SA	用于稳定性测定中的粘度测量
RPMI-1640 中型	Gibco（Thermo Fisher）	11875093	细胞培养
比例	BEL 工程	HPBG-2285	材料称重秤
扫描探针显微镜	岛津	SPM-9700HT	AFM，扫描探针显微镜
氢氧化钠（NaOH）	Dinamica-Quimica contemporanea	P.10.0594.024.00	pH调节
分光光度计	热飞世科学	A51119700C	吸收
维生素C（抗坏血酸）	西格玛-奥尔德里奇	PHR1008	正向对照
Zetasizer Pro	马尔文泛林	Zetasizer Pro	用于动态光散射和ζ粒子