方法文章

从冻存的血沉棕黄层样本重编程诱导多能干细胞系

DOI：

10.3791/70522

⸱

2026年4月10日

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1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Interdisciplinary Neuroscience, University of Georgia, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Georgia, 4Department of Infectious Diseases, College of Veterinary Medicine, University of Georgia, 5Division of Pediatric Endocrinology, Emory University School of Medicine, 6Dysautonomia Center, New York University Langone Health, 7Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Emory University School of Medicine, 8Stem Cell Core, Columbia Stem Cell Initiative, Columbia University, 9Department of Cellular Biology, University of Georgia

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案详细介绍了从患者外周血单个核细胞（PBMC）诱导生成诱导性多能干细胞（iPSC）过程中出现问题时的排查步骤，这些样本在按照制造商说明书操作后仍难以重编程。本方案主要针对冻存的血沉棕黄层样本，但也可适用于纯化的PBMC的重编程。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

人类多能干细胞（hPSCs）是疾病建模的重要工具。此外，成体体细胞可被重编程为诱导性多能干细胞（iPSC）。iPSC技术使得针对特定研究对象和人群的评估成为可能，并推动了个性化医学的发展。血液样本常规被采集并冷冻保存用于科研。这些样本可加工为“血沉棕黄层”（buffy coat），即含有白细胞和血小板的血液组分，或加工为外周血单个核细胞（PBMCs），后者是更为纯化的白细胞群体，不含嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、血小板或红细胞。两者均为易于获取且相对非侵入性的可重编程体细胞来源。已有多个研究报告了从PBMCs进行重编程的方法，但仅有一篇文献描述了从冷冻保存的血沉棕黄层中进行该过程。近期实践经验表明，文献中及厂商提供的PBMC重编程方案在应用于冷冻血沉棕黄层样本时均未能成功，因此需要采用本文所述的优化与故障排除策略。对于许多使用iPSC技术的研究人员而言，建立具有高成功率的详尽操作流程至关重要，尤其是在患者样本细胞数量稀少、采集时间间隔较长、来自有限的受试者群体或样本本身极为珍贵的情况下。本文确定了若干关键检测节点和故障处理策略，以提高对人类冷冻血沉棕黄层或纯化PBMCs进行重编程的成功概率。最终，该方案将帮助研究人员识别重编程成功的预测因素，并制定替代策略以提升成功获得iPSC的几率。

引言

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人类多能干细胞（hPSC）技术是一种易于扩增且可再生的人类细胞来源，可分化为体内任何类型的细胞，使研究人员能够研究在患者中难以获取或无法触及的细胞和组织类型。此外，诱导性多能干细胞（iPSCs）可直接从患者的体细胞中获得1。这使得能够分化出患者特异性的目标细胞类型，为疾病建模和药物发现提供了极为宝贵的工具。因此，将体细胞重编程为iPSCs的严格、可重复且高效的方法至关重要。

成纤维细胞、尿液细胞和血细胞2,3是诱导多能干细胞（iPSC）制备中最常用的体细胞来源，但各自均存在一定的局限性。 成纤维细胞是重编程历史上最常用的选择3，但其获取较为困难，需通过具有一定侵入性的皮肤活检获得。可重编程的细胞也可来源于尿液样本，其优点是获取简便且无创，但重编程过程必须在样本采集后48小时内使用新鲜样本开始4。血液则是获取可重编程细胞的优良来源，因其采集创伤小且易于获得。目前已有多种从外周血单个核细胞（PBMCs）进行重编程的方案，PBMCs是一类具有单个细胞核的血细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞5。由于PBMCs的密度低于其他血细胞，因此可通过密度梯度离心法从新鲜分....

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方案

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本方案遵循佐治亚大学人类研究伦理委员会的指导原则。所有涉及人类受试者的研究均按照世界医学协会《赫尔辛基宣言》的指导原则进行。根据志愿者的自述报告，其未患有以下疾病：囊性纤维化、慢性阻塞性肺病、结核病、哮喘、糖尿病或急性呼吸道感染。招募年龄在18至50岁之间、性别不限的志愿者。孕妇被排除在研究之外。

1. 血沉棕黄层或外周血单个核细胞的提取与冷冻保存

决策标准：如果样本需要长期保存，最好选择选项2；如果缺乏PBMC纯化试剂，或样本仅需短期保存，则选项1较为合适。

  1. 方案一：血沉棕黄层提取
    1. 根据世界卫生组织（WHO）最佳实践指南12进行静脉穿刺采血，采集7–10 mL全血至含抗凝剂的采血管中。样本采集后立即置于冰上保存。
    2. 将7–10 mL全血转移至15 mL锥形离心管中，使用水平转子离心机在4 °C条件下以200 × g离心15分钟，关闭刹车。离心后应形成三层：上层为黄色血浆，中间层为白色血沉棕黄层，底层为红色红细胞。
    3. 使用无菌移液管小心吸取上层血浆，避免扰动中间的血沉棕黄层，弃去血浆。将白色血沉棕黄层转移至新的15 mL锥形离心管中（约1–2 mL）。
      警告：血浆应弃置于适当的生物危害废物容器中。
      注意：....

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结果

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该实验方案的成功可在多个阶段进行追踪。表1汇总了已应用本方案的样本情况。起始样本为冻存一周的外周血单个核细胞层（buffy coat）或冻存的外周血单个核细胞（PBMC），若解冻后样本质量良好，并在细胞扩增后呈现明确的可重编程形态，则7次中有6次成功实现了重编程（表1，类别1）。另有两份在相似条件下采集和保存的buffy coat样本，其质量和形态也类似，但被用于建立其他检测，而非进行重编程。相反，若起始样本为长期冻存（> 6年）的buffy coat，无论其解冻后质量如何，在体细胞扩增后均不会呈现可重编程的形态，也无法成功重编程（表1，类别2）。为节约资源，扩增后未呈现可重编程形态的样本不应进行转导（表1，类别3）。

总体重编程的成功与否取决于扩增后的外周血单个核细胞（PBMCs）/血细胞的健康状况，而细胞健康状况又受储存条件的影响。冻存的血样在解冻后立即加入DPBS时，若细胞能够扩散（良好），表明状态较好；若出现致密液滴直接沉降至管底而未.......

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讨论

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诱导多能干细胞（iPSC）技术在生物医学领域具有巨大潜力，可用于疾病机制研究、个性化医疗以及“培养皿中的临床试验”22，23。从血液样本中高效且可调节的iPSC重编程方案是释放iPSC技术广阔前景的关键，因为血液样本易于采集，并且在生物样本库中通常 readily available。尽管已有多种文献报道了从纯化的外周血单个核细胞（PBMCs）进行重编程的方案，但本方案重点介绍从纯度较低的血液样本（即冻存的血沉棕黄层）中进行重编程的方法，并明确了重编程时间线中的关键检测节点，以便于评估实验成功与否，从而最大限度地减少时间和资源的浪费。

成功重编程的第一个关键步骤是拥有高质量的起始样本（图5，CK1）。从新鲜血液中纯化的外周血单个核细胞（PBMC）是重编程最方便的起始样本；然而，在本方案中，详细描述了从冻存的白膜层等非理想样本开始实现成功重编程的操作步骤。解冻白膜层后通过密度.......

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披露

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我们声明，本研究在无任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行。

致谢

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根据机构审查委员会（IRB）协议编号UGA# 2012-10769-06、NYU# s21-01701、Emory# 2024P008659和Emory# 000002114，招募了人类受试者，并获得其献血的知情同意。本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）下属国家普通医学科学研究所的支持，资助编号分别为J. Art获得的5T32GM142623、V. Michopoulos获得的R01MH115174以及N. Zeltner获得的R01NS114567。本内容的全部责任由作者承担，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10厘米标准组织培养皿猎鹰353003
12孔板猎鹰353043
15毫升锥形管费舍尔7200886
24孔板科宁7200740
4%对甲醛溶液热力科学J19943-K2
6孔板费舍尔科学FB012927
accuSpin1R费舍尔科学75003449
Activin A生物技术338-AC
AF488-驴子和alpha;山羊InvitrogenA11055
AF555-驴子和alpha;RBTInvitrogenA31572
AF647-驴子和alpha;mInvitrogenA31571
AF647-驴子和alpha;RBTInvitrogenA31573
抗生素-抗真菌药（100X）费舍尔15 240 096及nbsp;
Basix 聚苯乙烯血清学移液器费舍尔14955233
14955234
14955235
14955236
BD结核菌素注射器费舍尔14-826-87
BD瓦库泰因玻璃单核细胞制备（CPT）管费舍尔科学02-685-125PBMC分离血液收集管
BD 带K2EDTA的真空塑性血液收集管：血异物闭合费舍尔科学02-657-32抗凝结涂层血液收集管
B-巰基乙醇费舍尔21 985 023及nbsp;
牛明胶西格玛G1393
短克尤里-T抗体多克隆山羊IgGR&DAF2085
CellDrop BF德诺维克斯CellDrop BF
离心机5702埃彭多夫EP022628102-1EA
化学定义的脂质浓缩物费舍尔NC9022744
Chir 99021 R&D4423
CO2 孵化器三洋MCO-20AIC
低温保存储存系统定制生物系统V-1500AB
CryoStor CS10干细胞技术100-1061替代冷冻介质
CytoTune-iPS 2.0 仙台重编程套件费舍尔A16517
地塞米松西格玛D2915
DMEM费舍尔11965118
DMEM/F12费舍尔11330057
DMSO费舍尔BP231-1
DPBS1次，不含CAMG和NBSP;费舍尔MT21031CM
EDTA费舍尔AM9262
红细胞生成素（EPO）生物科技287-TC-500
Essential 6 中等（E6）费舍尔A1516401区分基数 
Essential 8 中质（E8）费舍尔A1517001高中干细胞基质
EVOS FL 显微镜热力学AMF4300
胎牛血清VWR45000-734
FGF 基础版（FGF2）生物技术233-FB/CF 
Geltrex（盖尔特雷克斯）费舍尔A1413202基质涂层
Gibco MEM 非必需氨基酸溶液（100X）费舍尔11140050
谷他max费舍尔35050061L-谷氨酰胺替代物 
肝素干细胞技术7980
1077号历史西格玛10771密度梯度解1 
全转铁素西格玛T0665
人类干细胞因子（SCF）Peprotech300-07-100UG
胰岛素样生长因子1（IGF1）Peprotech100-11-100UG
白介素-3（IL-3）Peprotech200-03-2UG
等温210水浴费舍尔科学210
敲除血清替代（KSR）费舍尔10828028FBS免费补充剂 
L-抗坏血酸西格玛A4544-100G
LDN193189斯坦金特04-0074
左旋谷氨酰胺费舍尔25030081
淋巴复流干细胞技术7801密度梯度解2
马特里格尔科宁CB-40234基质涂层
小鼠胚胎成纤维细胞费舍尔A34964 
纳米多克隆山羊IgGR&DAF1997-SP
NUNC生物样本库与细胞培养低温管费舍尔科学12-565-163N
青霉素/链霉素费舍尔15140122
纯化抗Pax-6抗体兔子多克隆IgG生物传说901301
QBSF-60 无血清培养基优质生物160-204-101电磁基座
恢复细胞培养液冷冻培养基赛莫飞世尔科学12648010替代冷冻介质
rhVitronectin（VTN）费舍尔A31804
RPMI 1640 中型费舍尔11875093
SB431542R&D1614
仙台病毒HN单克隆抗体小鼠IgG2aInvitrogen14649482
苏达亚硒矿西格玛S5261
Sox17抗体多克隆山羊IgGR&DAF1924
StemSpan红细胞扩增补充剂干细胞技术2692替代商业膨胀介质补充
StemSpan SFEM II 介质干细胞技术9605替代商业膨胀媒介
超低温冷冻柜赛莫飞世尔科学TSX60086A
通用移液器吸头——过滤式VWR76322-132<> 76322-134< > 76322-150< > 76322-156
XAV939生物技术3748/10
Y-27632 二盐酸盐生物宝石1293823

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Ray, A., et al. An overview on promising somatic cell sources ut....

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