本方案详细介绍了针对患者外周血单个核细胞（PBMC）诱导多能干细胞（iPSC）建系过程中难以按照制造商说明书进行重编程时的故障排除步骤。该方案主要适用于冻存的血沉棕黄层样本，但也可用于纯化的PBMC细胞的重编程。
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摘要
摘要
人类多能干细胞（hPSCs）是疾病建模的重要工具。此外，干细胞可由成体体细胞重编程获得，称为诱导性多能干细胞（iPSC）。iPSC技术使得针对特定研究对象和人群的评估成为可能，并推动了个性化医学的发展。血液样本常规被采集并冷冻保存用于科研目的。这些样本可加工为“血沉棕黄层”（buffy coat），即含有白细胞和血小板的血液组分，或加工为外周血单个核细胞（PBMCs），后者是更为纯化的白细胞群体，不含嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、血小板或红细胞。两者均为易于获取且相对非侵入性的可重编程体细胞来源。已有多个研究报告了从PBMCs进行重编程的方法，而仅有一篇文献描述了从冷冻保存的血沉棕黄层中进行该过程。近期实践经验表明，文献中及厂商提供的PBMC重编程方案在应用于冷冻血沉棕黄层样本时均未能成功，因此需要采用本文所述的优化与故障排除策略。对于许多使用iPSC技术的研究人员而言，建立具有高成功率的详尽操作流程至关重要，尤其是在患者样本细胞数量稀少、采集时间间隔较长、来自有限的受试者群体或样本本身极为珍贵的情况下。本文确定了若干关键质控节点和故障排查策略，以提高对人类冷冻血沉棕黄层或纯化PBMCs进行重编程的成功几率。最终，该方案将帮助研究人员识别重编程成功的预测指标，并制定替代策略以提升成功获得iPSC的几率。
引言
人类多能干细胞（hPSC）技术是一种易于扩增且可再生的人类细胞来源，能够分化为体内任何类型的细胞，使研究人员得以研究在患者中难以获取或无法触及的细胞和组织类型。此外，诱导性多能干细胞（iPSCs）可直接从患者的体细胞中获得1。这使得特定患者的感兴趣细胞类型得以分化，为疾病建模和药物发现提供了极为宝贵的工具。因此，将体细胞重编程为iPSCs的严格、可重复且高效的方法至关重要。
成纤维细胞、尿液细胞和血细胞2,3是诱导多能干细胞（iPSC）制备中最常用的体细胞来源，但各自均存在一定的局限性。 成纤维细胞历来是最常用的重编程细胞类型3，但其获取过程相对有创，需进行皮肤活检，操作不便。可重编程的细胞也可来源于尿液样本，该方法采集简便且无创，但重编程过程必须在样本采集后48小时内使用新鲜样本启动4。血液则是获取可重编程细胞的优良来源，因其采集创伤小且易于获得。目前已有多种从外周血单个核细胞（PBMCs）进行重编程的技术方案，PBMCs是一类具有单个细胞核的血细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞5。由于PBMCs的密度低于其他血细胞，可通过密度梯度离心法从新鲜分离的全血样本中分离或纯化获得5。此外，全血经离心后可形成三层结构：血浆层、白膜层（buffy coat）和红细胞层6。白膜层中含有PBMCs，同时也包含血小板和少量红细胞。然而，在大多数生物样本库中，PBMCs并不易获得，而全血或白膜层则更为丰富且易于获取7。尽管生物样本库中存有大量白膜层样本，且其中含有可重编程的PBMCs，但目前极少有技术方案详细描述如何从冻存的白膜层中进行重编程8，使得这一资源尚未得到有效利用。
目前已有多种已发表的实验方案1,8,9以及市售试剂盒10可用于简化重编程流程；然而，这些方法并未深入探讨如何最大限度地提高难以重编程的患者供体细胞的重编程成功率。通常认为某些细胞本身就无法实现重编程，当这种情况发生时，许多研究人员可能会尝试使用不同类型的供体细胞或来自其他患者的细胞。然而，这对许多研究人员或患者群体而言可能并非可行的选择。与先前已发表的实验方案8,9不同，本实验方案包含一个设有检查点和判断标准的指导流程，可用于预测重编程是否成功，并采用了一种独特的方法：在冻存的血沉棕黄层解冻后，通过密度梯度离心法对其进行纯化。
该过程首先从选定个体中抽取血液，并分离外周血单个核细胞（PBMCs）或血沉棕黄层（buffy coats）。对于新实验，通常需要招募新的供体，在机构审查委员会（IRB）批准及签署适当知情同意书的前提下进行新鲜采血。下一步是体细胞扩增，即将冻存的血细胞解冻，并在促进造血干细胞和红系祖细胞增殖的条件下进行培养，这些血细胞是重编程的最佳候选细胞11。经过10至14天培养后，细胞应已准备好进行重编程，其标志为一种此前方案中未讨论过的独特形态学特征；随后通过接种携带Yamanaka因子Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4的仙台病毒对其进行转导1。转导后，细胞将开始表达Yamanaka转录因子，并回归到多能状态，这一过程再次表现为明显的形态学改变以及形成干细胞克隆的增殖现象。新生的克隆被逐一挑取，扩增并冷冻保存。经过十次传代后，通过验证干细胞标志物的表达以及向三个胚层分化的能力，可确认成功建立重编程的诱导多能干细胞（iPSC）系。
该方案最适合使用储存时间少于<1 个月的冻存血沉棕黄层（buffy coats），或解冻后至少有 100 万活细胞的、储存时间长达 2 年的冻存外周血单个核细胞（PBMCs）。然而，文中所述的质量控制节点也可用于指导从任何质量的血液样本中进行重编程问题的排查与解决。此外，关于将重编程获得的诱导多能干细胞（iPSCs）适应无饲养层条件的详细信息，可适用于任何 iPSC 重编程工作流程，无论起始体细胞类型如何。
本方案通过实际操作中的问题排查建立，详细阐述了从冻存的血沉棕黄层中重编程诱导多能干细胞（iPSCs）的方法，并鉴定了重编程成功的形态学指标，为难以重编程样本的处理提供了切实可行的操作指南。最终，实施这些策略可有效节约时间、经费、试剂和样本资源。
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方案
本方案遵循佐治亚大学人类研究伦理委员会的指导原则。所有涉及人类受试者的研究均按照世界医学协会《赫尔辛基宣言》的指导原则进行。根据受试者自述，其未患有以下疾病：囊性纤维化、慢性阻塞性肺疾病、结核病、哮喘、糖尿病或急性呼吸道感染。招募对象为年龄在18至50岁之间的健康志愿者，性别不限。孕妇被排除在研究之外。
1. 血沉棕黄层或外周血单个核细胞的提取与冷冻保存
决策标准：如果样本需要长期保存，最好选择选项2；如果缺乏PBMC纯化试剂，或样本仅需短期保存，则选项1较为合适。
- 方案 1：血沉棕黄层提取
- 根据世界卫生组织（WHO）最佳实践12进行静脉穿刺采血，采集 7–10 mL 全血至含抗凝剂的采血管中。将样本置于冰上保存。
- 将 7–10 mL 全血转移至 15 mL 圆锥形离心管中，使用水平转子离心机在 4 °C 条件下以 200 × g 离心 15 分钟（关闭刹车）。离心后应形成三层：上层为黄色血浆，中间层为白色血沉棕黄层，下层为红色红细胞。
- 使用无菌移液管小心吸取血浆，避免扰动血沉棕黄层。弃去血浆。将白色血沉棕黄层转移至新的 15 mL 圆锥形离心管中（约 1–2 mL）。
警告：将血浆弃置于适当的生物危害废物容器中。
注意：血沉棕黄层中少量血浆残留无妨，因其有助于细胞在解冻后恢复。 - 向血沉棕黄层中加入 DMSO，使终浓度为 10% (v/v) DMSO，立即分装至冻存管中（每管 1 mL），并在 -80 °C 冻存。次日将冻存管转移至液氮中长期保存。
注意：例如，对于 2 mL 血沉棕黄层，加入 200 µL DMSO，充分混匀后分装至 2 支冻存管中。每个样本通常可获得 1–3 支冻存管。
- 方案 2：外周血单个核细胞（PBMC）纯化
- 根据世界卫生组织（WHO）最佳实践12进行静脉穿刺采血，采集 7–10 mL 全血至含抗凝剂的采血管中。将样本置于冰上保存。
- 在新的 15 mL 圆锥形离心管中加入 4 mL 密度梯度液 1，小心地将 4 mL 血液叠加于密度梯度液 1 上方。
- 使用水平转子离心机在室温下以 400 × g 离心 30 分钟（关闭刹车）。离心后上层为血浆，中间层为 PBMC，其余血液成分位于下层。
- 收集中间的 PBMC 层至新的 15 mL 圆锥形离心管中，随后用 1× PBS 洗涤 2–3 次：每次在水平转子离心机中以 350 × g 在室温下离心 5 分钟（开启刹车）。弃去上清液。若无需冻存而需立即开始重编程，请直接进入步骤 2.3.4。
警告：将上清液弃置于适当的生物危害废物容器中。 - 将细胞沉淀重悬于冻存液（90% 血清 + 10% DMSO）中，立即分装至冻存管中（每管 1 mL），并在 -80 °C 冻存。次日将冻存管转移至液氮中长期保存。
注意：可使用专门用于 PBMC 分离的采血管替代密度梯度离心法从新鲜血液中纯化 PBMC。也可使用市售的替代冻存液进行细胞冻存。每个样本通常可获得 1–4 支冻存管。
2. 准备用于体细胞扩增的样本
- 培养基制备
- 通过分装 45 mL EM 基础培养基制备扩增培养基（EM）9，加入 127.8 µL 抗坏血酸（L-ascorbic acid）（由 100 mM 储液配制成 50 µg/mL）和 450 µL 青霉素-链霉素溶液（100x 储液）。
- 向 4 mL EM 中加入 2 µL 干细胞因子（SCF）（由 100 µg/mL 储液配制成 50 ng/mL）、2 µL 白细胞介素-3（IL-3）（由 20 µg/mL 储液配制成 10 ng/mL）、16 µL 促红细胞生成素（EPO）（由 500 U/mL 储液配制成 2 U/mL）、4 µL 胰岛素样生长因子 1（IGF1）（由 40 µg/mL 储液配制成 40 ng/mL）以及 4 µL 地塞米松（dexamethasone）（由 1 mM 储液配制成 1 µM），配制 EM + 细胞因子13。EM + 细胞因子需在配制当天使用。
注意： 也可使用其他市售的扩增培养基系统。
- 选项 1：从冻存的白膜层中纯化外周血单个核细胞（PBMC）
决策标准：若步骤 1 中选择了选项 1（即白膜层提取），则在步骤 2 中选择选项 1（即从冻存白膜层中纯化 PBMC）。- 取出密度梯度溶液 2，使其恢复至室温。通过反复倒置瓶子充分混匀。无菌操作将 3 mL 密度梯度溶液 2 转移至 15 mL 圆锥形离心管中。
- 另准备一支 15 mL 圆锥形离心管，加入 12 mL 杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco’s phosphate buffer saline, DPBS）。
- 从液氮中取出冻存的白膜层小瓶，置于冰上直至准备解冻。在 37 °C 水浴中轻轻摇动以缓慢解冻，当仅剩少量冰晶时即取出。
- 小心地（逐滴）将小瓶内容物转移至含 DPBS 的离心管中。用 1 mL DPBS 冲洗小瓶，并将冲洗液加入含回收细胞的离心管中。
- 使用水平转子离心机，在室温下以 200 x g 离心 10 分钟。小心吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于含 1% 胎牛血清（FBS）的 4 mL DPBS 中。
- 将白膜层混合物轻轻铺加在密度梯度溶液上方，注意避免混合。使用水平转子离心机，在室温下以 800 x g 离心 20 分钟，关闭刹车。
- 用移液器小心吸除上层血浆层，避免扰动血浆与梯度液之间的界面。再用移液器吸取界面处的 PBMC 层（图 1A），转移至一支洁净的 15 mL 管中。
注意：其余各层应弃置于适当的生物危害废物容器中。 - 用 3 mL EM 洗涤 PBMC，在室温下以 200 x g 离心 10 分钟。小心吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 2 mL EM + 细胞因子中，接种至 12 孔板的一个孔中。
- 将培养板置于 37 °C、5% CO2 和 20% O2 的培养箱中培养。
- 选项 2：冻存 PBMC 的解冻
决策标准：若步骤 1 中选择了选项 2（即 PBMC 纯化），或担心冻存白膜层细胞活力较低（例如冻存时间超过 1 个月）（图 1B），则在步骤 2 中选择选项 2（即解冻冻存 PBMC）。- 准备一支含 12 mL DPBS 的 15 mL 圆锥形离心管。
- 从液氮中取出冻存 PBMC 小瓶，置于冰上直至准备解冻。在 37 °C 水浴中轻轻摇动以缓慢解冻，当仅剩少量冰晶时即取出。
- 小心地（逐滴）将小瓶内容物转移至离心管中。用 1 mL DPBS 冲洗小瓶，确保回收全部细胞。
- 使用水平转子离心机，在室温下以 200 x g 离心 10 分钟。小心吸除上清液，将细胞沉淀（图 1C）重悬于 2 mL EM 中，取 10 µL 进行台盼蓝排斥实验以测定细胞活力并获得细胞计数14。
注意：上清液应弃置于适当的生物危害废物容器中。 - 将 1.0 x 106–2.0 x 106 个细胞/mL 接种于 2 mL EM + 细胞因子中，加入 12 孔板的一个孔内。将培养板置于 37 °C、5% CO2 和 20% O2 的培养箱中培养。
3. 体细胞扩增（解冻后第1天）
- 小心地从每个孔中移除 1 mL 用过的培养基。用过的培养基可收集到另一个孔或离心管中，以便检查是否丢失了细胞。
- 用 1 mL 新鲜的 EM + 细胞因子替换用过的培养基。
- 重复步骤 3.1 和 3.2，每隔一天拍摄一次 PBMC 的图像，直至观察到明显的形态学变化，即出现明亮且呈圆形的大、小细胞（图 2A，分别以橙色和蓝色箭头指示），这些即为需要重编程的红系前体细胞。此过程大约需要 10–14 天。
注意：未表现出上述形态特征的细胞，通常缺乏较大的圆形细胞（图 2B），很可能无法成功重编程，并可能已死亡（图 2C）。
4. 转导（解冻后10–14天）
- 准备仙台病毒
- 根据批次特异性的滴度值，使用制造商提供的产品文件中的计算公式，计算转导 2.0 × 105 个细胞所需的每种病毒体积，其中 KOS:c-Myc:Klf4 的感染复数（MOI）为 5:5:3，按制造商建议操作。
- 从冷冻箱中取出病毒，保持在冰上直至开始解冻。逐一将病毒在 37 °C 水浴中轻轻旋转解冻。
- 配制分装液，将三种病毒按适当体积混合，用于以 MOI 5:5:3 的条件转导 2.0 × 105 个细胞。将分装液于 -80 °C 冻存，直至使用。
警告：所有接触过仙台病毒的废弃物必须彻底用漂白剂处理。
注意：制造商建议根据实际细胞计数结合 MOI 计算来确定添加的病毒体积，但本方案中使用 2.0 × 105 的近似值已证明有效。分装使用可更经济，并减少病毒的冻融次数。
- 转导当天（第 0 天）
- 如果外周血单个核细胞（PBMCs）前一天未换液，则移除 1 mL 旧培养基，并加入 1 mL 新鲜 EM + 细胞因子。将病毒分装液在冰上解冻后直接加入孔中，轻轻摇晃培养基混匀。
- 用封口膜包裹培养板，在室温下使用水平转子离心机以 350 × g 离心 90 分钟。随后将培养板置于 37 °C、5% CO2、20% O2 的培养箱中过夜。
警告：所有接触过仙台病毒的废弃物必须彻底用漂白剂处理。
- 转导后第 1 天（第 1 天）
- 将细胞收集至 15 mL 圆底离心管中。用 2 mL EM 洗涤孔壁，并在显微镜下检查以确保所有细胞均已收集。在室温下以 300 × g 离心 10 分钟。
- 小心吸除上清液，用 2 mL EM + 细胞因子重悬细胞，转移至 12 孔板的新孔中，并将培养板放回 37 °C、5% CO2、20% O2 的培养箱中继续培养。
警告：所有接触过仙台病毒的废弃物必须彻底用漂白剂处理。
5. 将转导细胞重铺至饲养细胞上
- 准备饲养细胞
- 向43.5 mL的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中加入5 mL胎牛血清（FBS）（终浓度10%）、0.5 mL最低必需培养基非必需氨基酸溶液（MEM-NEAA）（来自100倍储存液）、50 µL 2-巯基乙醇（55 µM，来自55 mM储存液）以及0.5 mL抗生素-抗真菌剂（来自100倍储存液）。
- 通过将600 µL明胶（0.1%，来自2%储存液）加入12 mL DPBS中，分装至6孔板中每孔2 mL，制备明胶包被的6孔板。室温孵育20分钟。
- 取出冻存的经辐照小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）冻存管，在37 °C水浴中轻轻旋转使其缓慢融化。
- 将细胞悬液逐滴加入含有10 mL DPBS的15 mL锥形管中，并用额外1 mL DPBS冲洗冻存管。在室温下以200 × g 离心5分钟。
- 小心吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL成纤维细胞培养基中。取10 µL进行台盼蓝排斥实验以测定细胞活力并获得细胞计数14。
- 从6孔板中移除明胶溶液，并以2.5 × 104 个细胞/cm2 的密度接种经辐照的MEFs。在37 °C、5% CO2 和20% O2 条件下的培养箱中孵育6–48小时。
注意：必须在转导细胞传代前准备好饲养细胞板。当经辐照的MEFs在传代前孵育约2天时效果最佳，但至少孵育6小时也可满足要求。
- 传代转导细胞
- 制备iPSC培养基：在90 mL DMEM/F12中加入10 mL FBS（终浓度10%）、1 mL MEM-NEAA（来自100倍储存液）、1 mL L-谷氨酰胺（2 mM，来自200 mM储存液）、1 mL青霉素-链霉素（来自100倍储存液）、100 µL 2-巯基乙醇（55 µM，来自55 mM储存液）以及100 µL成纤维细胞生长因子2（FGF2）（10 ng/mL，来自10 µg/mL储存液）。每次换液时新鲜添加L-抗坏血酸（50 µg/mL）。
- 在转导后的第3天，将转导孔中的所有培养基和细胞收集至15 mL锥形管中。用至少1 mL额外的EM冲洗孔板，并在室温下使用摆动转子离心机以300 × g 离心10分钟。
- 将细胞沉淀重悬于6 mL iPSC培养基中。吸除含经辐照MEFs的3个孔中的培养基。
- 将转导的细胞接种至这3个含经辐照MEFs的孔中（每孔2 mL）。在37 °C、5% CO2 和20% O2 条件下的培养箱中孵育。
6. 蚁群出现前的维持培养
- 转导后的第4、5、6天，每天向每孔加入1 mL新鲜的iPSC培养基。这可在重编程细胞逐渐贴附于饲养层时，减少不必要的干扰，同时为其提供新鲜营养。
- 转导后的第7天，移除所有旧培养基，每孔更换为2 mL新鲜iPSC培养基。此后每隔一天用iPSC培养基换液一次，直至克隆开始出现。
- 配制hES培养基：取78 mL DMEM/F12，加入20 mL无血清添加剂（20%）、1 mL MEM-NEAA（100倍）、1 mL L-谷氨酰胺（由200 mM母液配制成2 mM）、1 mL青霉素-链霉素（100倍）、100 µL 2-巯基乙醇（由55 mM母液配制成55 µM）和100 µL FGF2（由10 µg/mL母液配制成10 ng/mL）。每次换液时新鲜添加L-抗坏血酸（50 µg/mL）。
- 当出现小克隆后，继续每隔一天使用hES培养基换液，以维持转导细胞的生长（图3A）。
注意：克隆最早可在转导后7天出现。若转导后三周内仍未见克隆出现，则后续出现的可能性极低。
7. 当菌落生长至较大尺寸时进行挑取（图3B）
注意：有时转导的细胞会发生形态学变化，但不会形成类似干细胞的克隆集落（图3C）。此类集落不被视为能够成功建立iPSC细胞系的克隆。
注意：从克隆出现开始，iPSC 细胞系需要适应实验室偏好的 hPSC 培养条件。本方案将展示如何将 iPSC 细胞系适应于无饲养层条件，在包被了连环蛋白（VTN）的培养板上培养，并使用化学成分明确且商业可得的 hPSC 培养基进行换液。如果克隆无法良好适应新条件，可能需要更温和的过渡方式，例如将其挑取至饲养细胞层上，并使用 hES 培养基进行培养。
- 通过解冻并充分混匀VTN制备VTN包被板。对于24孔板，准备12 mL DPBS加入120 µL VTN（从500 µg/mL储备液中稀释至终浓度5 µg/mL），每孔加入0.5 mL VTN溶液。室温孵育1小时。
- 将一瓶hPSC补充剂在4°C条件下过夜解冻，以制备hPSC培养基。解冻后，将10 mL hPSC补充剂加入500 mL hPSC基础培养基中。
- 通过移除24孔板各孔中的VTN溶液，并向每孔加入含0.5 µL Y-27632（从10 mM储备液稀释至10 µM）的0.5 mL hPSC培养基，完成挑取前的板面准备。
- 在无菌条件下，将新板、含有转导细胞/克隆的6孔板、无菌注射器针头以及p200移液器和吸头带至体视显微镜下。
- 将含有转导细胞及已出现克隆的培养板置于体视显微镜上，利用显微镜定位待挑取的一个克隆，打开板盖以暴露目标孔。
- 无菌操作打开注射器，暴露针头。在显微镜引导下，用针尖沿克隆边缘划线，使其与周围饲养层细胞分离。
- 使用针尖将克隆切割成若干大小相近的片段。若克隆片段尚未从板底脱落，可用针头侧面将其刮下或铲起，使其悬浮于液体中。
警告：使用后的针头应丢弃至专用锐器容器中。 - 使用p200移液器并在显微镜下重新定位已挑取的克隆。用移液器吸取悬浮的克隆，转移至已准备好的24孔板中的一个孔内。尽量将整个克隆完整转移至孔中，避免带入其他克隆或饲养层细胞。
- 将培养板置于37 °C、5% CO2 和20% O2 的培养箱中培养。
- 每天更换1 mL hPSC培养基，持续喂养挑取的克隆，直至其融合生长。
注意：不同克隆之间可能存在遗传差异。每个24孔板孔中仅可含一个挑取的克隆。每个挑取的克隆需赋予唯一标识符，并从此作为独立的细胞系进行后续操作。为确保重编程实验的严谨性，建议至少挑取24个克隆，并对其中至少3个进行扩增与表征。
8. 扩增
- hPSC 维持
- 挑选的菌落生长至体积较大、呈圆形且边缘发亮时，即可进行分割（图 4A）。菌落挑取时会分裂成多个碎片。如果一个孔中有多个菌落，应在它们生长到相互接触并开始分化之前将其分开。
- 准备VTN包被的6孔板：对于6孔板，配制12 mL含120 µL VTN（从500 µg/mL母液稀释至终浓度5 µg/mL）的DPBS溶液，每孔加入1 mL VTN溶液。室温孵育1小时。VTN溶液可替换为DPBS，于37 °C、5% CO₂条件下储存备用。2 一个月后，在将要进行传代的孔中，吸除DPBS，并加入1 mL hPSC培养基。
- 吸出待传代孔中的培养基，用 1 mL DPBS 洗涤一次。吸除 DPBS，加入 500 µL 0.5 mM EDTA 解离缓冲液（用含 0.9 g NaCl 的 500 mL DPBS 配制，过滤除菌）15. 37 °C、5% CO₂条件下孵育2 2分钟，直至菌落开始松解，每个菌落内的细胞开始变圆并相互脱离。
- 从培养箱中取出培养板，吸除EDTA解离缓冲液。使用P1000移液器，加入1 mL hPSC培养基，轻轻吹打至细胞集落完全脱离并略微分散。将含细胞的1 mL培养基转移至新的6孔板中，该孔板预先加入1 mL新鲜hPSC培养基。首次传代按1:1比例进行，即将原培养板中的全部细胞转移至新培养板中。
- 将细胞置于37 °C、5% CO₂的培养箱中2 和 20% O₂2. 每天饲喂iPSCs，直至培养孔长满，准备传代。
注意：干细胞形态差（图4B可通过调整传代方案来减轻（），例如提前传代、缩短EDTA孵育时间或调整传代比例。 - 接种至10 cm培养皿中。
- 当6孔板中各孔的细胞达到融合状态后，用VTN包被10 cm培养皿（将7 mL DPBS与70 µL VTN（由500 µg/mL储备液稀释至5 µg/mL）混合，室温孵育1 h）。
- 重复分割操作步骤，此次从6孔板扩增至10 cm组织培养皿（分割比例为1:1）。每10 cm培养皿使用7–10 mL hPSC培养基。
- 当10 cm培养皿中的细胞达到融合状态时，重复此传代过程。每次传代时记录传代次数。传代比例取决于细胞形态和密度，通常比例为1:10，即将原始培养皿中十分之一的细胞转移至新的培养皿中。
- 冻存与储备液制备
- 经过约3次传代后，将细胞扩增至四个10 cm组织培养皿中，用于制备早期传代储备。当10 cm培养皿中的细胞达到汇合状态时，即可进行冻存。
- 准备冻存管并放入冰箱预冷。确保标签上注明细胞系、克隆号、传代次数和冻存日期。
- 准备冻存培养基：90% hPSC 培养基和 10% DMSO，每管需要 1 mL（每 10 cm 培养皿对应冻存 3 管）。
- 按照常规进行传代操作，每个10 cm培养皿使用4 mL 0.5 mM EDTA解离缓冲液。
- EDTA孵育后，吸除EDTA。轻柔地向培养皿中加入10 mL hPSC培养基。
- 用移液管轻轻吹打培养基，将细胞从培养皿上洗下。细胞会很容易地从培养皿底部脱落并悬浮于培养基中。仅吹打2–5次，以轻柔地分散细胞团块，但避免将细胞完全解离为单细胞。
- 200 × g 离心 5 分钟 g 在室温下。吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于冻存液中。
- 立即在 -80 °C 下进行隔热并冷冻。将冷冻后的冻存管转移至液氮罐中，用于长期保存。
- 在完成鉴定后，以相同方式制备更多冻存菌种。
9. iPSC 的表征：
- 干性标志物的表达。在扩增至少10代后，当24孔板中的集落准备进行传代时，使用4%多聚甲醛固定，并通过免疫组织化学染色检测干性标志物NANOG。集落通常需要经过至少10代培养才能转为仙台病毒（SeV）阴性，可通过免疫荧光予以确认。图4C).
- 测试多能性能力：三胚层 分化。通过成功分化为三个胚层中的每一层来确认iPSC的多能性。每种分化均起始于一盘汇合的10 cm培养皿，细胞应呈现良好的hPSC形态（图 4A).
- 外胚层16
- 分化开始前一天（第-1天）：将iPSC接种于基质包被的24孔板，密度为2.6 × 105 细胞/厘米²2 在含 Y-27632（终浓度 10 µM）和 XAV-939（终浓度 2 µM）的 hPSC 培养基中。
- 第0天至第1天：每孔加入1 mL分化基础培养基，含LDN（终浓度100 nM）、SB（终浓度10 µM）和XAV（终浓度2 µM）。
- 第2天至第7天：使用含LDN（终浓度100 nM）和SB（终浓度10 µM）的分化基础培养基，每孔1 mL进行培养。从第3天起，每隔一天换液一次。
- 第8天：用4%多聚甲醛固定，通过免疫组织化学染色检测外胚层标志物PAX617 并确认多能性标志物 NANOG 的丢失（图4D).
- 中胚层18:
- 分化开始前一天（第 -1 天）：将 iPSC 接种于基质包被的 24 孔板，密度为 2.5 × 105 细胞/厘米²2 在含 Y-27632（终浓度 10 µM）的 hPSC 培养基中。
- 第0天：使用添加L-抗坏血酸（终浓度64 µg/mL）、亚硒酸钠（终浓度13.6 ng/mL）、全转铁蛋白（终浓度10 µg/mL）、化学成分确定的脂质浓缩液（100倍）、CHIR（终浓度5 µM）的DMEM/F12培养基进行换液。
- 第1天: 使用DMEM/F12培养基，添加L-抗坏血酸（终浓度64 µg/mL）、亚硒酸钠（终浓度13.6 ng/mL）、全转铁蛋白（终浓度10 µg/mL）、化学成分确定的脂质浓缩液（100倍）、肝素（终浓度0.6 U/mL）进行培养。
- 第2天：使用4%多聚甲醛固定，然后进行BRACHYURY-T免疫组织化学染色19 并确认多能性标志物 NANOG 的丢失（图 4E).
- 内胚层20
- 分化开始前一天（第 -1 天）：将iPSC以1.0 × 10⁵细胞/孔的密度接种于基质包被的24孔板中5 细胞/厘米²2 在含 Y-27632（终浓度 10 µM）的 hPSC 培养基中。
- 第0天至第4天: 在 d0 时，用 DPBS 洗涤，并加入含 L-谷氨酰胺替代物（100 倍）、FBS（终浓度 0.5%）和 Activin A（终浓度 100 ng/mL）的 RPMI 培养基进行培养。从 d0 开始，每天以相同培养基更换培养液。
- 第5天：使用4%多聚甲醛固定，通过免疫组织化学染色检测内胚层标志物SOX1721 并确认多能性标志物 NANOG 的丢失（图4F).
注意：分化操作按照先前发表的方案进行。根据我们的经验，基质涂层可以相互替代。
- 外胚层16
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结果
该实验方案的成功可在多个阶段进行追踪。表1汇总了已应用本方案的样本情况。起始样本为冻存一周的外周血单个核细胞层（buffy coat）或冻存的外周血单个核细胞（PBMC），若解冻后样本质量良好，并在细胞扩增后呈现明显的可重编程形态特征，则7次中有6次成功实现了重编程（表1，类别1）。另有两份在相似条件下采集和保存的buffy coat样本，其质量和形态学表现类似，但被用于建立其他检测方法，而非进行重编程。相反，若起始样本为长期冻存（> 6年）的buffy coat，无论其解冻后质量如何，在体细胞扩增后均不会呈现可重编程的形态特征，也无法成功重编程（表1，类别2）。为节约资源，扩增后未呈现可重编程形态特征的样本不应进行转导操作（表1，类别3）。
总体重编程的成功与否取决于扩增后的外周血单个核细胞（PBMCs）/血细胞的健康状况，而这又与细胞的保存条件密切相关。冻存的血样在解冻后立即加入DPBS时，若细胞能够扩散（良好），表明状态较好；若出现致密...
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讨论
诱导多能干细胞（iPSC）技术在生物医学领域具有巨大潜力，可用于疾病机制研究、个性化医疗以及“培养皿中的临床试验”22,23。从血液样本中高效且可灵活调整的iPSC重编程方案是释放iPSC技术广阔前景的关键，因为血液样本易于采集，并且在生物样本库中通常 readily available。尽管已有多种文献报道了从纯化的外周血单个核细胞（PBMC）进行重编程的方案，但本方案重点介绍从纯度较低的血液样本（即冻存的血沉棕黄层）中进行重编程的方法，并明确了重编程过程中的关键检测节点，以便于评估实验成功与否，从而最大限度地减少时间和资源的浪费。
成功重编程的第一个关键步骤是拥有高质量的起始样本（图5，CK1）。从新鲜血液中纯化的外周血单个核细胞（PBMC）是重编程最方便的起始样本；然而，在本方案中，详细描述了从冻存的白膜层等非理想样本开始实现成功重编程的步骤。解冻白膜层后通过密度梯度...
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披露
我们声明，本研究在无任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行。
致谢
根据机构审查委员会（IRB）协议编号UGA# 2012-10769-06、NYU# s21-01701、Emory# 2024P008659和Emory# 000002114，招募了人类受试者，并获得其参与献血的知情同意。本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）下属国家普通医学科学研究所的支持，资助编号分别为J. Art获得的5T32GM142623、V. Michopoulos获得的R01MH115174以及N. Zeltner获得的R01NS114567。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 cm 标准组织培养皿 | Falcon | 353003 | |
| 12 孔板 | Falcon | 353043 | |
| 15 mL 圆锥形试管 | Fisher | 7200886 | |
| 24 孔板 | 康宁 | 7200740 | |
| 4% 甲醛溶液 | 赛默飞世尔科技 | J19943-K2 | |
| 6 孔板 | Fisher Scientific | FB012927 | |
| accuSpin1R | Fisher Scientific | 75003449 | |
| 激活素A | Bio-techne | 338-AC | |
| AF488-驴 α 山羊 | invitrogen | A11055 | |
| AF555-驴 α rbt | invitrogen | A31572 | |
| AF647-驴 α m | invitrogen | A31571 | |
| AF647-驴 α rbt | invitrogen | A31573 | |
| 抗生素-抗真菌素（100X） | Fisher | 15 240 096 | |
| Basix 聚苯乙烯刻度吸管 | Fisher | 14955233 14955234 14955235 14955236 | |
| BD 结核菌素注射器 | Fisher | 14-826-87 | |
| BD Vacutaine 玻璃单个核细胞分离（CPT）管 | Fisher Scientific | 02-685-125 | PBMC分离用采血管 |
| BD 含K2EDTA的Vacutainer塑料采血管：Hemogard封口 | Fisher Scientific | 02-657-32 | 抗凝剂包被的采血管 |
| β-巯基乙醇 | Fisher | 21 985 023 | |
| 牛明胶 | Sigma | G1393 | |
| Brachyury-T 抗体 多克隆山羊 IgG | R&研发 | AF2085 | |
| CellDrop BF | Denovix | CellDrop BF | |
| 离心 5702 | Eppendorf | EP022628102-1EA | |
| 化学成分明确的脂质浓缩液 | Fisher | NC9022744 | |
| CHIR 99021 | R&研发 | 4423 | |
| CO2 培养箱 | Sanyo | MCO-20AIC | |
| 冷冻保存储存系统 | Custom Biogenic Systems | V-1500AB | |
| CryoStor CS10 | 干细胞技术 | 100-1061 | 替代冻存液 |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai 重编程试剂盒 | Fisher | A16517 | |
| 地塞米松 | Sigma | D2915 | |
| DMEM | Fisher | 11965118 | |
| DMEM/F12 | Fisher | 11330057 | |
| DMSO | Fisher | BP231-1 | |
| DPBS 1X 不含钙镁 | Fisher | MT21031CM | |
| EDTA | Fisher | AM9262 | |
| 促红细胞生成素（EPO） | Bio-Techne | 287-TC-500 | |
| Essential 6 培养基（E6） | Fisher | A1516401 | 分化基础培养基 |
| Essential 8 培养基（E8） | Fisher | A1517001 | hPSC 基础培养基 |
| EVOS FL 显微镜 | 赛默飞世尔科技 | AMF4300 | |
| 胎牛血清 | VWR | 45000-734 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子（FGF2） | Bio-techne | 233-FB/CF | |
| Geltrex | Fisher | A1413202 | 基质包被 |
| Gibco MEM 非必需氨基酸溶液（100X） | Fisher | 11140050 | |
| Glutamax | Fisher | 35050061 | L-谷氨酰胺替代物 |
| 肝素 | 干细胞技术 | 7980 | |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | 密度梯度溶液 1 |
| 全转铁蛋白 | Sigma | T0665 | |
| 人干细胞因子（SCF） | Peprotech | 300-07-100UG | |
| 胰岛素样生长因子1（IGF1） | Peprotech | 100-11-100UG | |
| 白细胞介素-3（IL-3） | Peprotech | 200-03-2UG | |
| Isotemp 210 水浴箱 | Fisher Scientific | 210 | |
| Knockout-血清替代物（KSR） | Fisher | 10828028 | 无FBS补充剂 |
| L-抗坏血酸 | Sigma | A4544-100G | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| L-谷氨酰胺 | Fisher | 25030081 | |
| 淋巴细胞分离液 | 干细胞技术 | 7801 | 密度梯度溶液 2 |
| Matrigel | 康宁 | CB-40234 | 基质包被 |
| 小鼠胚胎成纤维细胞 | Fisher | A34964 | |
| Nanog 多克隆山羊 IgG | R&研发 | AF1997-SP | |
| Nunc 生物样本库与细胞培养冻存管 | Fisher Scientific | 12-565-163N | |
| 青霉素/链霉素 | Fisher | 15140122 | |
| 纯化的兔多克隆抗 Pax-6 抗体 IgG | Biolegend | 901301 | |
| QBSF-60 无血清培养基 | Quality Biological | 160-204-101 | EM基础 |
| 无血清细胞冻存培养基 | 赛默飞世尔科技 | 12648010 | 替代冻存液 |
| 重组人玻璃连接蛋白（rhVitronectin, VTN） | Fisher | A31804 | |
| RPMI 1640 培养基 | Fisher | 11875093 | |
| SB431542 | R&研发 | 1614 | |
| 仙台病毒HN单克隆抗体小鼠IgG2a | Invitrogen | 14649482 | |
| 亚硒酸钠 | Sigma | S5261 | |
| Sox17 抗体 多克隆 山羊 IgG | R&研究与开发 | af1924 | |
| StemSpan 红系扩增添加剂 | 干细胞技术 | 2692 | 替代性商用扩增培养基添加剂 |
| StemSpan SFEM II 培养基 | 干细胞技术 | 9605 | 替代性商用扩增培养基 |
| 超低温冰箱 | 赛默飞世尔科技 | TSX60086A | |
| 通用移液器吸头-带滤芯 | VWR | 76322-132 76322-134 76322-150 76322-156 | |
| XAV939 | Bio-techne | 3748/10 | |
| Y-27632 二盐酸盐 | BioGems | 1293823 |
参考文献
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