土壤基础呼吸法作为测定土壤管理措施与微生物活性影响的方法

摘要

本文介绍了一种利用红外气体分析仪（IRGA）测定土壤基础呼吸的实验方案，该方法可在受控条件下连续监测土壤CO₂动态，并对微生物活性进行可重复的评估。

摘要

土壤呼吸代表了二氧化碳（CO₂）从土壤向大气的转移，是仅次于总初级生产力的第二大陆地碳通量。由于土壤呼吸主要由土壤生物的代谢活动驱动，因此被广泛认为是土壤生物活性、碳周转以及环境或管理相关干扰影响的敏感指标。土壤呼吸整合了多种CO₂来源，包括植物根系和根际微生物的自养呼吸，以及与微生物分解有机质相关的异养呼吸。在没有外源底物或近期养分输入的条件下测得的微生物呼吸，被称为土壤基础呼吸（SBR）。

本文介绍了一种基于红外气体分析仪（IRGA）的实验方案，用于在受控的实验室条件下定量测定土壤呼吸速率（SBR）。为了单独分离出仅由微生物代谢贡献的异养呼吸组分，采用经过预处理、过筛并均质化的土壤样品，在标准化的水分和温度条件下进行培养，从而排除植物来源的CO₂通量，实现对随时间累积的C-CO₂释放量的定量测定，以此作为微生物生物量、活性及土壤健康状况的可靠指标。该实验方案包括土壤制备、水分调节、密封小瓶培养、基于IRGA的CO₂测定以及累积呼吸量的计算。

本研究采用红外气体分析仪（IRGA）评估了土壤基础呼吸（SBR），该方法可在受控条件下监测土壤CO₂动态。代表性结果表明，添加堆肥可增强来自塔贝爾納斯沙漠干旱土壤的微生物呼吸作用，说明有机改良剂对微生物过程具有显著促进作用。这些发现凸显了SBR作为反映土壤管理措施对微生物活性影响指标的实用性，特别是在退化的干旱环境中。从方法学角度看，基于IRGA的实验方案为与土壤碳动态相关的科研及教学应用提供了一种实用工具。

引言

土壤呼吸是一个核心的生物地球化学过程，包括二氧化碳（CO₂）从土壤表面向大气的通量。据估计，其作为陆地碳通量，规模仅次于总初级生产力¹，并对全球碳循环具有重要贡献²。该过程在陆地生态系统碳周转中起关键作用，并 increasingly 被用作土壤生物活性和土壤碳固持动态的敏感指标^3,4。

土壤呼吸来源于多种途径，通常可分为两个主要的生物组分：自养呼吸，来源于植物根系代谢及根际相关微生物；异养呼吸，与微生物对土壤有机质的分解作用相关^5,6。在特定条件下，非生物来源如碳酸盐风化⁷和光降解⁸也可能有所贡献。为了分离出仅由微生物代谢产生的异养呼吸组分，必须排除植物来源的CO₂通量。

在此背景下，微生物呼吸作用被定义为微生物（包括细菌、真菌、原生动物和藻类）通过有氧或无氧代谢过程产生 CO₂ 或消耗 O₂ 的活动。⁹在没有外源底物或近期养分输入的条件下测得的微生物呼吸称为基础呼吸¹⁰. 基础呼吸作用反映了原生微生物群落的内源性代谢活性，常被用作微生物生物量、活性及其对环境或人为干扰敏感性的替代指标^11,12.

为了准确评估基础呼吸作用，需在实验室条件下对经过预处理、过筛并均质化的土壤样品进行测量。该预处理过程能有效去除根系和大型土壤动物，从而消除自养呼吸的干扰，使研究聚焦于异养微生物活性。尽管过筛会改变原始土壤结构，但它提高了样品的均一性和可重复性，并有助于独立研究由微生物驱动的过程⁹。培养通常在受控的环境条件下进行，例如25 °C和土壤田间持水量的60%，以在不偏向特定功能类群的前提下优化微生物活性^13,14。在此背景下，土壤含水量和田间持水量是关键参数，因为微生物呼吸对水分可利用性高度敏感，而水分可利用性调控着底物扩散、氧气供应以及微生物代谢。因此，基础呼吸的测定通常在标准化的水分条件下进行，以田间持水量的百分比表示。培养期间释放的C-CO₂量被用作衡量基础呼吸的指标¹⁵。

该方案特别适用于通过测定经预培养土壤的基础呼吸来评估微生物活性的受控实验室培养研究。在标准化的温度和湿度条件下，利用均质化样品比较经不同管理措施（如有机改良）或其他干扰处理的土壤时，该方法尤为有用。由于排除了植物来源的 CO₂ 输入，该方法最适合用于评估土壤呼吸的异养组分，而非田间条件下的总土壤呼吸。

已开发出多种用于量化土壤呼吸的分析技术，这些技术在灵敏度、通量和操作复杂性方面各不相同^9,16经典方法包括碱吸收后滴定法、电导法系统、气相色谱法和红外气体分析法。基于碱的方法具有较高的稳健性和相对较低的成本，但时间分辨率有限，且可能受到二氧化碳吸收不完全或泄漏的影响。电导法可实现连续测量，但可能受温度和离子强度的干扰。气相色谱法能够精确测定顶空气体中的二氧化碳浓度，并可同时检测其他气体，但需要专用仪器和经过培训的技术人员，通量可能受限。相比之下，红外气体分析仪（IRGA）可在受控培养条件下快速、重复地监测二氧化碳浓度，因此特别适用于时间分辨的微生物呼吸测量。然而，IRGA测量也需要适当的校准，并严格控制培养条件以确保可重复性，且可能受到信号漂移、水蒸气干扰以及在高二氧化碳浓度下可靠性降低的影响。近年来的新进展扩大了基于红外和非色散红外（NDIR）技术的土壤呼吸系统的可及性，包括适用于实验室和野外应用的低成本腔室式和传感器式平台。 ^24,25在密闭小瓶培养过程中，应根据预期的呼吸速率调整顶空与土壤的比例以及测量时间间隔，以避免培养期间二氧化碳过度积累。近期已发表基于红外气体分析仪（IRGA）的实验方案，以支持在受控培养条件下对土壤呼吸进行标准化的实验室测定。^26,27，且联合国粮农组织（FAO）近期提出的协议中也包含了土壤呼吸测量的标准化方法指南^28. 在此更广泛的背景下，基础呼吸作用也可被视为长期农业试验中土壤健康评估的一个组成部分。它反映了微生物的代谢活性和碳的矿化作用，而诸如二氧化碳激增、高锰酸盐可氧化碳和土壤有机碳等指标则捕捉了土壤功能的其他互补性方面。²⁹在本研究中，我们使用了红外气体分析仪（IRGA） t用于量化培养土壤样品的基础呼吸速率。该方法可在培养期间对CO₂释放通量进行重复监测，从而评估在特定水分和温度条件下微生物的代谢活性。以下方案描述了用于测定不同管理条件下土壤基础呼吸的实验室操作步骤。

方案

1. 准备工作

1. 样品采集：
   1. 按土壤发生层采集样品，或在表层研究时采集0–10 cm深度的样品。
      注意：使用已消毒的工具和手套，以避免微生物污染。
   2. 将样品放入保温袋中，并用冷藏箱运送到实验室。
   3. 若无法立即进行土壤预处理，需将样品保存在4°C（最好不超过48小时）。
   4. 在进行处理和培养前，让样品在室温下平衡至少2小时。
2. 材料准备与土壤预处理：
   1. 将实验室器具浸入10%次氯酸钠溶液或70%乙醇中消毒30分钟，然后用蒸馏水彻底冲洗，并在使用前自然晾干。
      注意：操作这些化学品时需佩戴手套、实验服和护目镜。
   2. 将样品在室温下放置2小时以达到稳定状态。
   3. 将样品过2 mm筛，用镊子去除根系和粗大杂质。
   4. 每次使用后，用消毒液清洗筛子，并用纸巾擦干。
3. 测定土壤含水量（土壤中水分的含量）和田间持水量（土壤能够保持的水量）¹⁷。
   1. 土壤含水量计算：取20 g样品置于瓷坩埚中，在烘箱中于105°C下烘干24小时，测定土壤含水量¹⁸ [公式1]。
      [公式1]
   2. 使用“理查兹”压力膜装置测定田间持水量¹⁹。
      1. 将土壤样品置于由塑料环限定的装置陶瓷板上。
      2. 加入蒸馏水至饱和状态，静置至少24小时；随后施加−0.33 bar（−33 kPa）的压力，持续24小时；然后根据公式1再次测定土壤含水量。
4. 测定土壤密度（g·mL^-1）。将已知体积且已称重的容器装满烘干土壤样品，记录土壤质量。土壤密度即为容器的质量与体积之比。
5. 培养样品的制备：
   1. 将培养箱温度设定为25 °C。UNE-EN ISO 16072:2002标准（土壤质量：微生物呼吸测定的实验室方法，https://www.iso.org/standard/32096.html）建议采用该温度以确保不同研究之间的可比性。
   2. 估算水分条件：根据初始土壤含水量，计算每份样品达到田间持水量60%所需的蒸馏水体积^20,21。该水分水平即为实验开始时的设定值，在培养期间无需再调整水分。
   3. 土壤用量的选择：所用土壤量可根据其有机质含量进行调整（有机质含量越高，所需土壤量越少）²¹。然而，建议以20 g作为参考用量。
   4. 将样品放入100 mL玻璃瓶中，加入蒸馏水至达到田间持水量的60%。用隔垫密封瓶口，并将瓶子放入培养箱中。

2. CO₂ 浓度测量

1. 测量间隔：
   1. 根据土壤预期的呼吸速率，在选定的时间间隔内进行 CO₂ 测量，以避免小瓶顶空中 CO₂ 过度积累。
   2. 避免 CO₂ 浓度超过 10%（100 000 ppm），以防抑制微生物活性。若浓度超过此阈值，应缩短测量间隔。在后续展示的代表性示例中，前一周每天测量一次，之后每 3 至 4 天测量一次。
2. 使用红外顶空气体分析仪（IRGA）测量 CO₂ 浓度（%）
   1. 每次测量前，根据制造商说明，使用零点标准气（无 CO₂ 的空气或氮气）和至少一种在测量范围内已知 CO₂ 浓度的量程标准气对 IRGA 进行校准。根据制造商说明验证仪器稳定性，并校正基线漂移。在样品测量前记录校准参数。
   2. 在材料清单中所述的 IRGA 设备上，连接一根带毛细管的针头至仪器。
   3. 将针头穿过隔垫插入小瓶，抽取一定量气体，并记录 CO₂ 浓度（%）。
   4. 对每个样品重复读数，直至信号稳定。
3. 样品再平衡处理
   1. 每次测量后，将小瓶在洁净、防尘且无气流干扰的区域打开（最好在层流洁净台内）放置半小时，以更新瓶内空气，防止厌氧条件产生。在此通气过程中，不得混合或搅动土壤。
   2. 使用隔垫重新密封小瓶，并将其放回培养箱中。
4. CO₂ 校正
   1. 设置一个不含土壤但其他操作条件相同的空白小瓶，用于空白对照。
   2. 从样品值中减去空白值，以消除环境 CO₂ 的影响。
      注意：避免在打开的小瓶附近呼气，否则可能导致结果偏差。

3. 土壤基础呼吸（SBR）的计算

1. 通过从瓶的总体积中减去土壤（容重）和所加水占据的体积，确定瓶内顶空体积（Vhs）[公式 2]。
2. 利用容重测量值估算土壤体积，并根据所添加的水分计算水的体积。在所有后续计算中使用此校正后的顶空体积。
3. 瓶内顶空体积（Vhs）的确定：指瓶体积减去土壤体积和含水量后的体积 [公式 2]。
   [公式 2]
4. 瓶内 CO₂ 体积的估算
   1. 根据红外气体分析仪（IRGA）测得的 CO₂ 浓度（%），结合瓶的有效顶空体积，获得瓶内 CO₂ 体积 [公式 3]。
      
      [公式 3]
5. 土壤样品释放的 CO₂ 摩尔数的估算：
   1. 通过理想气体定律方程 （P ∙ V = n ∙ R ∙ T） [公式 4] 求解 n，代入此前在 [公式 3] 中计算得到的 V 值，获得土壤样品释放的 CO₂ 摩尔数。
      [公式 4]
6. CO₂ 通量的估算（mg C-CO₂ kg^-1 干土 day^-1）
   1. 需将多次测得的 %CO₂ 值累加，并结合以下因素，使用 [公式 5] 估算最终的 CO₂ 通量：i) 根据土壤含水量校正样品质量；ii) 考虑 1 摩尔 CO₂ 相当于 12 g 碳（即 12000 mg C）。
      
      [公式 5]
      其中：
      P = 瓶内气体压力。应等同于大气压（atm）。需根据所在地点进行校正。
      Vhs = 瓶内气体顶空体积（L）
      [% CO₂ ]= 使用红外气体分析仪（IRGA）测得的 CO₂ 浓度
      R = 气体常数 = 0.082 L·atm·K⁻¹·mol⁻¹
      T = 培养温度（开尔文，K）
      dry soil​ = 干土质量（kg）
      t = 培养时间（天）
      本实验方案的流程总结见 图 1。

图1：基于红外气体分析仪（IRGA）的土壤基础呼吸测定流程，涵盖土壤取样、预处理、培养、IRGA测量及计算步骤。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

本文所示结果来自一项实验，该实验通过向低肥力土壤中添加堆肥以提高土壤肥力参数和微生物活性。原始土壤采自西班牙东南部的“塔贝纳斯沙漠”（Tabernas desert）地区，该区域属半干旱气候，土壤发育贫瘠²²。采集了约40 kg农田表层30 cm的土壤样品，运至实验室后经2 mm筛分，获得细土组分。将细土分装于6个花盆（体积为10 L）中，其中三个花盆以10%（w:w）的比例添加由 sewage sludge 和作物残渣制成的堆肥进行改良。

每隔一段时间将样品混合并保持湿润（田间持水量的60%），以促进堆肥与土壤的融合。实验开始后一个月和三个月时，分别对每个花盆取样。土壤的主要特性见表1。

...

样品

讨论

土壤呼吸是微生物活性和有机质分解的敏感指标，可提供有关土壤管理影响的重要信息^23,24。本文所述的实验方法提供了一个简单而有效的框架，可在受控的实验室条件下通过测量CO₂排放量来定量评估土壤微生物活性²⁵，该方法基于并更新自García等（2003）的研究²¹。通过采用重复测量的培养实验设计，可分析累积和每日的CO₂通量，从而深入了解土壤呼吸的时间动态及其生态系统的功能特征^29,3。

上一节所述实验评估了通过添加堆肥增加有机质后干旱土壤的微生物学响应。结果明确显示，有机质增强了土壤的呼吸动态，提高了累积和每日的 CO₂ 排放量。与未添加的对照组相比，经改良的干旱土壤（T+堆肥）表现出显著更高的累积 CO₂ 排放量，这与以往关于土壤中使用有机改良剂的研究结果...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2 毫米筛
带隔垫的密封烧瓶或小瓶（100 mL）
分析天平
压力板提取仪	Soil Moisture Equipment Corp，美国加利福尼亚州戈莱塔	1600F1	用于计算田间持水量
去离子水或灭菌蒸馏水
培养箱设备	VWR Inc.，美国宾夕法尼亚州拉德诺	IL 250R PREMIUM
永久性标记笔
红外气体分析仪 CO2 浓度测定仪	Ametek Inc.，美国宾夕法尼亚州伯温	CheckMate 4	https://www.ametekmocon.com/products/headspacemapgasanalyzers/checkmate-4
等温运输袋和箱			用于将土壤样品运送至实验室
实验室烘箱			必须能够设定为 105ºC
层流通量室	CRUMA	HZ-1	步骤 2.3 中为可选设备
用于紧密封住小瓶的隔垫塞
土壤样品			应从研究区域代表性地采集。
灭菌试剂			可使用次氯酸钠溶液（10%）或乙醇（70%）