通过基于荧光素酶的活性检测法评估镉对人类结直肠类器官毒性的标准化方案

摘要

本方案旨在建立人结直肠类器官，并评估基于荧光素酶的ATP生物发光法检测镉诱导毒性的可行性。通过定量分析类器官活力随剂量和时间的变化，评价该方法的可行性与灵敏度。

摘要

镉（Cd）被归类为1类致癌物，是全球严重的环境问题之一。本研究旨在建立一种人源结肠直肠类器官模型，并评估基于荧光素酶的ATP生物发光法检测结肠直肠类器官（COs）对镉暴露毒性反应的可行性与灵敏度。从人结肠直肠组织中分离干细胞，并在三维基底膜 基质中培养以生成类器官。类器官分别暴露于不同浓度梯度的镉溶液中，并设置不同的暴露时间。以等体积比加入发光型活力检测试剂，在室温下轻轻摇动以促进细胞裂解和试剂渗透，随后孵育以使生物发光反应进行。使用多功能微孔板检测仪在发光模式下记录发光信号。通过剂量-反应曲线拟合计算半数抑制浓度（IC50），并评估类器官活力或相对活力的变化。研究成功从人结肠直肠组织中分离出原代干细胞，并用于生成类器官。镉暴露导致类器官代谢活性呈剂量依赖性和时间依赖性下降；剂量-反应分析获得了类器官的存活曲线及IC50值。本研究为人源结肠直肠类器官在环境重金属毒理学研究中的应用提供了方法学指导和实践依据。

引言

镉是一种天然存在的重金属，被归类为1类致癌物，已成为全球性的环境问题¹。人类接触镉主要通过吸入和饮食摄入。尽管长期低剂量暴露与多种不良健康后果相关，但显著减少其使用和向环境释放仍然具有挑战性^2,3。传统的二维培养在平坦基质上生长，缺乏组织结构、细胞极性和肿瘤微环境，因此在模拟体内异质性以及对镉暴露的真实毒理学反应方面能力有限⁴。此类系统无法充分模拟细胞间相互作用、基质依赖性生长或药物耐药性发展的生物学过程⁵。源自患者组织的三维类器官系统相比传统二维细胞系提供了更具生理相关性的研究平台⁶。类器官保留了原始组织的基因组特征、组织学结构和功能状态，从而能够更准确地模拟肿瘤生长、演化过程以及对镉毒性的敏感性，在疾病建模和毒理学研究中具有明显优势⁷。结肠类器官（COs）具有复杂的三维结构、细胞异质性，以及内在的自我更新和自组织能力^8,9。将COs移植到受体小鼠体内可促进肠道干细胞的自我更新，并调节宿主免疫微环境，产生保护性效应⁴

方案

本实验经苏州卫生职业技术学院伦理委员会批准（批准号：SWYXLL202516），并依照医学伦理标准进行。本研究所有受试者均签署了书面知情同意书。

1. 人结直肠组织的分离及类器官的建立

1. 组织样本的运输与保存
   1. 实验前，将基底膜基质在 4 °C 条件下缓慢解冻，并将所需培养基平衡至室温。
   2. 临床获取的人结直肠组织应立即放入预冷的组织保存液（2–8 °C）中。
      注意：确保运输过程中组织完全浸没于保存液中，并尽快将样本转移至实验室。
2. 在生物安全柜中，将组织置于 6 cm 培养皿中进行评估。使用手术刀和镊子小心去除可见的脂肪组织和肌层，保留上皮成分。
3. 将组织转移至含有 3 mL 磷酸盐缓冲盐水（PBS）并添加 300 µL 抗生素的 6 cm 培养皿中，将组织切成 2 mm × 5 mm 的碎片。
4. 将组织碎片转移至 50 mL 离心管中。
5. 向离心管中加入 10 mL 预冷的 PBS 和 200 µL 0.5 M EDTA（终浓度约 10 mM）。
6. 将离心管置于摇床上，在室温下以 0.072 g 轻柔振荡 15 分钟。
7. 用镊子将组织转移回培养皿，并在显微镜下观察。当隐窝结构变得可见或开始脱落时，进入下一步。
   注意....

结果

人结肠类器官的建立
我们成功地从组织样本中分离出结直肠隐窝结构，在低倍和高倍显微镜下均清晰观察到典型的隐窝形态。在体外培养过程中，分离的隐窝逐渐扩张，并表现出有序的形态成熟过程（图1A、B）。培养至第3天和第6天时，已形成结构完整的结直肠类器官，主要呈现球形或早期出芽样结构（图1C、D）。

类器官对镉暴露的敏感性
将类器官接种至96孔板中，继续培养5天，随后用浓度为0、5、10、20和40 µM的镉进行处理。暴露72小时后，采用基于ATP的发光检测法测定相对发光单位（RLU），并对数据进行分析和可视化。结果显示，随着镉浓度的增加，类器官的存活能力显著呈剂量依赖性下降（图2A）。暴露于10 µM、20 µM和40 µM镉的类器官表现出明显的RLU值降低（

讨论

本研究建立了一种利用类器官（COs）进行镉暴露及ATP活力检测的标准化实验流程，用于评估镉对类器官存活能力的影响。该流程重点优化了类器官的解离及96孔板接种步骤，以提高实验的可重复性以及后续ATP检测结果的稳定性。尽管当前实验方案主要聚焦于建立用于镉毒性评估的三维结直肠癌类器官模型，但大量研究表明，传统二维细胞培养与三维类器官模型在药物反应、细胞间相互作用、组织结构及毒理学特征方面存在显著差异。与二维单层培养相比，类器官能更真实地模拟体内组织的空间结构、细胞异质性及 肿瘤的体内类似微环境，具有更高的生理相关性。由于缺乏复杂的细胞间及细胞与细胞外基质（ECM）之间的相互作用，二维培养在重金属暴露下的反应可能无法准确反映真实的体内毒理学过程¹⁶相反，本研究建立的类器官（CO）模型能够有效模拟肿瘤组织的三维生长动态，为评估镉诱导的毒性提供了高度符合生理相关性的平台。

在类器官传代过程中，消化时间严格控制在约10分钟。该优化措施可防止消化不完全（导致细胞聚集体过大）以及过度消化（产生过多单细胞）。通过精确控制消化程度，我们获.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 μm 细胞筛	BIOLOGIX	15-1100
15 mL 离心管	BIOFIL	CFT011150
1 mL 移液器吸头	浙江百迪生物科技有限公司	H808633
200 μL 移液器吸头	浙江百迪生物科技有限公司	H808214
24 孔板	Corning Incorporated	3524
50 mL 离心管	CLUXCELL	321050
96 孔板	Corning Incorporated	220400
BioTek Cytation 5	BioTek Co., LTD	16280004	特定微孔板读板仪的操作软件。
氯化镉，10 g	Sigma	202908-10G
Cell Counting-Lite 3D 发光细胞活力检测试剂盒	Vazyme	DD1102-01/02/03	以 1:1 体积比使用的发光型活力检测试剂。
人结肠类器官培养试剂盒 Plus（扩增）	Mogenel Biotechnology	MA-0817HOO1HLP
Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基	thermo fisher	6125552
镊子	Beyotime	FS019
冰盒	Beyotime	FBX078
低温高速离心机	安徽中科中佳科学仪器有限公司	KDC-40
Matrigel	Mogenel Biotechnology	82755	基底膜基质
类器官解离溶液	Mogenel Biotechnology	MB-0818L01L	类器官解离溶液
青霉素-链霉素	Beyotime	C0222
磷酸盐缓冲液（1×PBS）	杭州富德生物技术有限公司	FD7032
移液器	RUINING	Pipet-Lite XLS
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software		特定微孔板读板仪的操作软件。
剪刀	Beyotime	FS001
组织消化溶液	Mogenel Biotechnology	MB-0818L06L/MB-0818L06S