一项通过基于荧光素酶的存活能力测定评估人类结直肠类器官镉毒性的标准化方案

摘要

该方案旨在建立人类结直肠类器官，并评估基于荧光素酶的ATP生物发光检测法，用于检测镉诱导的毒性。它通过量化类器官存活能力的剂量和时间变化，评估该检测的可行性和敏感性。

摘要

镉（Cd）被归类为一类致癌物，构成严重的全球环境问题。本研究旨在建立人类结直肠类器官模型，并评估基于荧光素酶的ATP生物发光检测法在检测结直肠类器官（COs）对镉暴露的毒性反应方面的可行性和敏感性。干细胞从人类结直肠组织中分离，并在基底膜基质中培养以生成COs。类器官细胞被根据不同暴露时间，采用分级的Cd浓度系列处理。以等体积比加入一种发光活性试剂，在室温下轻轻摇晃以促进裂解和试剂渗透，然后培养以使生物发光反应继续。荧光在多模式微板读取器上以发光模式记录。采用剂量-反应曲线拟合计算半最大抑制浓度并评估存活能力或相对存活能力的变化。原代干细胞成功从人类结直肠组织中分离出来，并用于生成一枚碳。暴露于铛铿酮会导致类器官代谢活动的剂量依赖性和时间依赖性降低;剂量-反应分析得出类器官的生存曲线和IC50值。本研究为利用人类COs进行环境重金属毒理学研究提供了方法学指导和实用见解。

引言

镉是一种天然存在的重金属，被归类为一级致癌物，已成为全球环境关注^焦点。人类接触铉铀主要通过吸入和饮食摄入实现。尽管慢性低剂量暴露与多种不良健康结果相关，但大幅减少其使用和环境释放^仍具挑战性 ^2,3。传统的二维培养物生长在平坦的基底上，缺乏组织结构、细胞极性和肿瘤微环境。因此，它们在体内重现镉暴露的异质性和真实毒理反应的能力^有限。此类系统无法充分模拟细胞间相互作用、基质依赖性生长或导致^药物耐药形成的生物过程5。从患者组织衍生的三维类器官系统相比传统二维^{细胞系提供了}更具生理相关性的平台6。类器官保留了原级组织的基因组特征、组织学结构和功能状态。这使肿瘤生长、演化及镉毒性敏感性建模更为准确，为疾病建模和毒^理学研究带来了明显优势7。CO拥有复杂的三维结构、细胞异质性以及自我更新^和自组织的内在能力^8,9。将CO移植到受体小鼠中可以促进肠道干细胞自我更新，调节宿主免疫微环境，从而产生^{保护效果 4}.2009年，佐藤等人首次证明单个成年Lgr5⁺肠干细胞可以自发组织和分化，形成覆盖所有肠道细胞^谱系的隐蔽绒毛结构。

肠道上皮是摄入后防止镋铀中毒的第一道防线。事实上，镉的口服生物利用度通常低于5%。CD诱导的肠道毒性表现为细胞间连接的破坏、细胞旁通透性增加以及炎症反应的诱导。此外，Cd扰乱肠道免疫功能，改变肠道微生物群的组成和稳态¹¹。根据暴露剂量和持续时间，Cd可能导致细胞周期失调，在某些情境下促进致癌性表型，而在其他情况下诱导细胞凋亡。铋铀会间接刺激活性氧（ROS）的产生，诱发氧化应激和氧化还原失衡。受体、激酶、磷酸酶、蛋白酶、粘附分子和转录因子的功能可以通过氧化还原信号调节。Cd还扰乱信号级联反应，改变ERK1/2、JNK（c-Jun N末端激酶）和p38 MAPK（p38有丝分裂原激活蛋白激酶）在多种细胞类型的激活状态¹²。通过激活MAPK级联反应中的ERK1/2，Cd可以促进细胞增殖和存活，抑制程序性细胞死亡，并促进异常过度增殖¹³。Cd可以直接或间接调控关键效应蛋白的表达和活性。例如，它下调肿瘤抑制因子p53，并上调抗凋亡蛋白如Bcl-2和Bcl-xL，最终破坏细胞凋亡和细胞周期稳态¹⁴。

在用于评估镉的细胞毒性效应的一氧化碳模型中，ATP含量测量被广泛用于评估类器官存活性。ATP是能量代谢的核心分子，直接反映了类器官的整体代谢状态和存活能力。镉暴露于CO中时，镉主要诱导线粒体功能障碍，加重氧化应激，并破坏类器官能量稳态。这些事件共同损害ATP的产生，最终降低类器官的存活能力。因此，ATP水平的变化可以作为镉诱导细胞毒性的稳健功能性读数。传统的细胞毒性检测包括比色MTT/CCK-8检测、活死染色和基于流式细胞术的分析。与这些方法相比，基于ATP的测定在三维类器官系统中具有明显优势。由于类器官结构复杂且空间异质性显著，传统的染色和成像方法常常受限于组织穿透力不足和定量准确性降低。相比之下，ATP检测依赖荧光素酶介导的生物发光反应，能够直接定量而不破坏类器官结构。ATP测量具有高灵敏度和宽广的动态范围。这使得能够检测从早期代谢抑制到类器官死亡的连续生物反应，便于在不同镉浓度下的准确剂量-反应分析。ATP水平全面反映了类器官的整体功能状态，优于依赖形态评估或单分子标记的方法。因此，该检测方法特别适合高通量毒性筛查，提供了更高的稳定性和可重复性。

利用ATP生物发光评估CO对镉暴露敏感性的核心原理是，萤火虫荧光素酶在ATP、^{Mg 2}⁺和O₂存在下催化D-荧光素的氧化，从而产生氧荧光素并发射光子。发射光的强度与样品中可测量的ATP含量成正比，且在定义的线性范围内。因此，发光作为细胞代谢活动或存活能力的间接定量替代。类器官嵌入在细胞外基质中，具有多层的三维结构。为此，ATP测定试剂具有优化的裂解缓冲液组成和工艺。这些优化改善了内部类器官细胞的破坏，促进ATP释放，并稳定了生物发光信号¹⁵。重要的是，ATP生物发光报告的是代谢活性，而非精确的细胞计数。例如，线粒体抑制剂即使在细胞仍然存活期间，也能在短时间内显著降低细胞ATP水平。相反，某些早期细胞死亡形式可能暂时保持相对较高的ATP水平。

尽管在镉（Cd）毒性评估中表现出更优越的生理相关性，结直肠类器官模型仍存在若干实际局限。与传统的二维（2D）细胞系相比，类器官培养更耗时且成本更高。此外，它们依赖动物来源矩阵，导致批次间变异性，限制了其在大规模高通量毒性筛查中的应用。虽然这些模型非常适合评估重金属对肠道上皮的直接毒理效应，但它们尚未完全取代体内评估系统毒性或复杂毒性动学过程的体内模型。

本研究以人类结直肠组织为原料，分离结直肠干细胞并在体外建立COs。类器官暴露于镉的浓度和暴露时间各异。随后使用多模微板读取器以发光检测模式测量发光。细胞存活率或IC50值通过特定微板读器操作软件计算和可视化。

方案

该实验已获得苏州职业健康学院伦理委员会批准（批准号为SWYXLL202516）并按照医学伦理标准进行。本研究的所有受试者均提供了书面知情同意。

1. 人类结直肠组织的分离及CO的建立

1. 组织样本的运输与保存
   1. 实验前，将基底膜基质在4°C缓慢解冻，并将所需培养基平衡至室温。
   2. 立即将临床手术中提取的人类结直肠组织放入预冷却的组织保存液中（2–8°C）。
      注意：确保组织在运输过程中完全浸没。把样本送到实验室。
2. 在生物安全柜下，将组织放入6厘米培养皿中进行评估。使用手术刀和镊子小心切除可见的脂肪组织和肌肉层，同时保留上皮成分。
3. 将组织转移到一个6厘米的盘子中，内含3毫升磷酸盐缓冲生理盐水（PBS），并补充300微升抗生素。将组织切成2毫米×5毫米的碎片。
4. 将组织片段转移到50毫升离心管中。
5. 向管内加入10毫升预冷PBS和200微升0.5 M EDTA（最终浓度~10 mM）。
6. 将管子放在室温摇床上，以0.072克轻轻搅拌15分钟。
7. 使用产钳将组织转移到培养皿中，并在显微镜下检查。当墓穴结构显现或开始脱落时，进入下一步。
   注意：当EDTA处理后，隐穴结构在显微镜下变得可见，通常消化水平已达到足以分离隐穴的水平，隐穴开始从松弛的上皮组织碎片上脱落。完整的窝穴通常保留明显的腺体或管状形态，并有明显的中央腔，而过度消化则会产生大量解离的单细胞和坏死碎屑。
8. 当许多完整的窝穴显现，组织碎片松散半透明时终止消化，允许轻柔移液轻松释放窝穴。
   注意：延长EDTA孵育会破坏隐窝完整性，增加细胞碎片的积累，降低肠道干细胞的存活率，从而降低后续类器官形成效率。
9. 添加15毫升抗生素补充PBS以阻止EDTA消化。轻轻搅拌。
10. 在300× 克 下离心，4°C离心3分钟。
11. 去除上清液。
12. 加入1毫升完整细胞培养基，并将悬浮液转移到1.5毫升微离心管中。
13. 将悬浮液以300× 克 离心3分钟，然后丢弃上清液。
14. 将500微升基底膜基体加入1.5毫升微离心管，充分混合。
15. 混合过程中尽量减少室温暴露，并将基底膜基体冰封以防止过早凝固。
16. 将混合物滴入24孔板的每个孔中，形成液滴。
17. 将24孔板倒置，在37°C、含5%二氧化碳的温度下培养20分钟。
18. 每孔加入600微升CO培养基。
19. 从商业渠道获取结直肠类器官培养基和解离试剂，并严格按照制造商说明使用。
20. 为制备完整细胞培养基，需补充500毫升DMEM基础培养基，并加入50毫升胎儿牛血清（FBS）和5毫升青霉素-链霉素。通过轻柔倒置彻底混合溶液。

2. 暴露于镜的CO的敏感性测定

1. 96孔板中的CO电镀与培养
   1. 将每个孔中的培养基丢弃，加入500微升类器官解离液。轻轻上下移液器，将基底膜基质分散开来。
   2. 将处理好的平板放入37°C、5%二氧化碳培养箱进行消化，初次消化时间为10分钟。
   3. 将24孔板每个孔的消化液收集到15毫升离心管中，加入10毫升完整细胞培养基。
   4. 在300× 克 离心3分钟收集类器官并丢弃上清液。
   5. 加入1毫升全细胞培养基，通过移液彻底混合，然后将悬浮液转移到1.5毫升微离心管中。
   6. 在300× 克 下离心3分钟，然后丢弃上清液。
   7. 加入100微升基底膜基质，通过移液彻底混合。
   8. 在每孔播种约3,000–5,000个单细胞之前，先对类器官进行解离并在显微镜下估算单细胞数量。
   9. 保持所有实验组的播种密度相对一致，以确保类器官的重复生长和实验结果。
   10. 根据类器官解离后的显微镜评估及类器官培养研究中常用的先前报告条件调整播种范围。
   11. 在96孔板的每个孔中心加入6微升混合物。共使用30口井，技术复制三口。
   12. 将平板倒置，在37°C的5%二氧化碳培养箱中孵育15分钟。
   13. 在96孔板的每个孔中加入100微升类器官培养基。
   14. 在播种后正好7天开始镉处理。
       注意：这7天的培养期允许单细胞完全发育为结构完整的COs。
2. 镜氨酸浓度稀释
   1. 将3.67毫克氯化镉粉末溶解在2毫升无菌超纯水中，制备10毫米浓缩液，最终体积为2毫升。
   2. 通过0.22微米滤纸对2毫升10毫米镉溶液进行灭菌。
   3. 将灭菌镉溶液放入1.5毫升离心管中，储存在4°C，避免光照照射。
   4. 在整个实验过程中，请佩戴适当的个人防护装备（PPE），包括实验服、防护手套和安全护目镜。
   5. 所有相关操作应在化学烟雾罩内进行，以降低暴露风险。
   6. 将所有含镉废物分类和管理，包括含镉的培养基、移液器头、离心管和培养皿，归类为有害化学废物。
   7. 将这些材料丢弃在指定的重金属液体或固体废物收集容器中。
   8. 所有废弃物处理应严格按照机构指南和当地环境法规进行。
   9. 切勿将鎘废料当作普通实验室垃圾处理，也不要倒进水槽。
   10. 在24孔板的盖子上标注为4、3、2、1和0。
       注意：在最终浓度为40 μM、20 μM、10 μM、5 μM和0 μM时用镉处理类器官。镉原料溶液的稀释量采用以下标准公式计算：
               C₁ V₁ = C₂ V₂
3. 要制备4毫升20微米工作浓度，将8微升10毫米浓缩液加入3992微升的完整培养基中。充分混合溶液以确保均匀分布。
   1. 向标记为4的槽加入1.4毫升培养基，并在剩余的每个孔中加入700微升培养基。
   2. 从标记好的4号井中取出5.6微升培养基，加入5.6微升镉溶液。充分搅拌。
   3. 将700微升溶液从标有“4”的井转移到标有“3”的井，彻底混合。
   4. 从每口井重复转移和混合到下一口较低编号井（从“3”到“2”，“2”到“1”，“1”到“0”），每一步都要彻底混合。
      注意：不要在标记为0的井中执行任何操作。
   5. 将96孔培养基从培养箱中取出，丢弃现有培养基。
   6. 将96孔板的盖子从左到右标记为40 μM、20 μM、10 μM、5 μM和0 μM。
   7. 向每个标记井加入100微升含镉培养基。
   8. 把盘子放进孵化器。

3. 添加发光活性试剂

1. 将发光活性试剂从−20°C的冷冻室取出，让其在室温下解冻。以1：1体积比例加入发光活性试剂。
2. 将2.5毫升发光活性试剂加入一次性试剂储罐中。
3. 加入2.5毫升结直肠类器官培养基，并通过移液彻底混合。
4. 使用废物抽吸系统从96孔板的每个孔中移除类器官培养基。避免从井中吸入基底膜基质。
5. 将一次性试剂储液中200微升溶液转移到含CO的96孔板的每个孔中，并通过高强度移液彻底混合。移液时避免引入气泡。
6. 将培养皿置于室温下孵育25分钟。在室温下孵化，避免光照。

4. 发光可行性试剂测量

1. 打开针对特定微板读取器的操作软件（补充图1A）。
2. 点击立即阅读（补充图1B）。
3. 点击新（补充图1B）。
4. 点击阅读（补充图1C）。
5. 选择荧光（补充图1D）。
6. 选择荧光纤维（补充图1D）。
7. 点击确定（补充图1D）。
8. 选择全盘（补充图1E）。
9. 点击全部清除（补充图1F）。
10. 选择目标96孔板上的相应位置，共计15孔（补充图1G）。
11. 点击确定（补充图1G）。
12. 将96孔板放入仪器中（补充图1H）。
13. 选择使用盖子（补充图1I）。
14. 点击确定开始测量（补充图1I）。
15. 测量完成后，点击导出将数据导出到Excel（补充图1J）。

5. 数据处理与分析

1. 能够进行非线性回归的开放统计数据分析软件。（补充图2A）
2. 选择XY数据表（补充图2A）。
3. 将 X 设置为数字（补充图 2A）。
4. 将Y设为输入，在并排子列中复制数值，并输入3个重复（补充图2A）。
5. 数据进入（补充图2B）。
6. 点击分析（补充图2C）。
7. 点击XY分析（补充图2D）。
8. 点击非线性回归（曲线拟合）（补充图2D）。
9. 点击确定。（补充图2D）。
10. 选择剂量-反应-抑制（补充图2E）。
11. 选择对数（抑制剂）与归一化反应——可变斜率（补充图2E）。
12. 点击确定以运行分析（补充图2E）。
13. 点击文件（补充图2F）。
14. 点击导出（补充图2F）。
15. 点击确定（补充图2G）。

结果

人类CO的建立
我们成功从组织样本中分离出结直肠骨髓结构，在低倍和高倍显微镜下均清晰观察到典型的骨髓形态。在体外培养过程中，孤立的窝穴逐渐扩展，并表现出有序的形态成熟过程（图1A，B）。到培养第3天和第6天，结构完整的结直肠类器官已形成，主要表现出球形或早期芽状结构（见图1C，D）。

CO对镉暴露的敏感性
CO被植入96孔板中，再培养5天，随后用0、5、10、20和40微米浓度的镉处理。暴露72小时后，进行了基于ATP的发光测定以测量相对发光单位（RLU），并对数据进行了分析和可视化。结果显示，镉浓度增加时类器官存活率会显著下降（见图2A）。暴露于10微米、20微米和40微米镉的CO表现出显著降低的RLU值（见图2B）。暴露于5 μM Cd的结直肠类器官中未见显著毒性。与存活性数据一致，形态分析显示镉处理的结直肠类器官结构发生显著变化，包括类器官尺寸减小、上皮结构严重破坏及结构逐渐破碎（见图2C）。这些发现表明结直肠类器官对镉诱导的细胞毒性高度敏感。

图1：人类结直肠窝的分离及结直肠类器官培养的建立。 （A） 具有代表性的人类结直肠窝影像。（10×）。（B）单一地下室的高倍放大视图（20×）。（C）CO在培养3天后的代表性图像（4×）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：Cd诱导的细胞毒性和形态变化。 （A）暴露于不同浓度镉的CO的相对剂量-响应曲线。横轴表示镉浓度，纵轴表示类器官的相对存活性。（b） 经过不同浓度镉处理后CO的相对RLU值。X轴表示镉浓度，Y轴表示相对RLU值。单向方差分析 *P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。（C）未处理（0 μM）和Cd处理CO在5 μM、10 μM、20μM、40μM下的代表性明场图像。 请点击此处查看该图的更大版本。

补充图1：使用特定微板读卡器操作软件的详细16步RLU检测工作流程。 （A） 软件图标。（B） 软件启动接口。（C）设置菜单。（D）分析选择界面。（E） 盘式配置菜单。（F）默认车牌布局。（G）根据实验板布局配置井位。（H）正在加载微型板。（I）仪器启动RLU测量。（J） 数据导出。请点击这里下载此文件。

补充图2：数据导出后，统计数据分析软件中进行数据处理和统计分析。 （A） 主屏幕。（B） 数据录入表。（C） 分析对话。（D） 分析参数菜单。（E） 非线性回归配置菜单。（F） 文件选项菜单。（G） 数据导出对话框。请点击这里下载此文件。

讨论

本研究建立了一套标准化的镉暴露和ATP存活率测定方案，利用CO评估镉对类器官存活性的影响。该方案特别优化类器官解离和96孔板化步骤，以增强实验重现性和后续ATP测定读数的稳定性。尽管当前实验方案主要聚焦于建立用于评估镉毒性的三维结直肠癌类器官模型，但大量研究表明，传统的二维细胞培养与三维类器官模型在药物反应、细胞间相互作用、组织结构和毒理学特征上存在显著差异。与二维单层相比，类器官更忠实地复现肿瘤的空间结构、细胞异质性以及体内类似微环境，具有更优越的生理相关性。由于缺乏复杂的细胞间和细胞-细胞外基质（ECM）相互作用，二维培养对重金属暴露的反应可能无法准确捕捉真实的体内毒理过程¹⁶。相反，本研究建立的CO模型有效模拟肿瘤组织的三维生长动态，为评估Cd诱导毒性提供了高度生理相关的平台。

类器官传递过程中，解离时间严格保持在约10分钟。这种优化防止了不完全解离导致细胞聚集过大的情况，同时避免了过度解离导致单细胞过多的情况。通过精确控制解离程度，我们获得了相对均匀的类器官结构，提升了后续药物治疗和ATP存活率检测的一致性。

我们采用了高通量96孔培养系统，并将基底膜基质板容量标准化为每孔6微升。这种标准化通过确保所有井间器官密度和生长特性一致，最大限度地减少了井间变异性，最终提高了实验重现性和数据可比性。通过结合ATP发光测定与使用统计数据分析软件的剂量-反应曲线分析，我们实现了镉暴露后类器官存活能力变化的稳健定量评估。总体而言，本研究建立了一套高度可重复的类器官模型在环境毒理学和重金属暴露应用的实验方案。

在COs培养过程中，将隐穴沉淀与基底膜基质彻底混合，是确保COs正常形成和稳定生长的关键步骤。基底膜基质的比例应保持在70%以上（基底膜基质体积>70%）。推荐的基底膜基质体积为：96孔板每孔6微升，48孔板每孔20微升，24孔板每孔25微升。基质聚合后，向孔中增加以下体积：96孔板每孔100微升，48孔板每孔300微升，24孔板每孔500微升。应避免将培养基直接移液到基底膜基体穹顶上，因为这可能破坏三维结构。为保持表型和遗传稳定性，本研究限制结直肠类器官的使用最多为4次。

当隐穴或CO直径达到约600微米或出现变暗和生长停滞时，应及时进行传代，以便后续的敏感性分析。在酶解过程中，消化过程应在显微镜下监测。如果CO未充分解离为小细胞簇或单细胞，消化时间可根据类器官大小和解离状态逐渐延长。应避免一次性长时间消化，以最大限度减少过度消化和细胞存活能力丧失的风险。

用以下公式计算每口井的相对可行性，并以重复井的平均百分比作为每个浓度的响应值

 

ATP生物发光测定法基于萤火虫荧光素催化的D-荧光素氧化，从而产生光子发射。由于其高灵敏度、兼容基于板的高通量格式以及标准化的商业试剂盒，该方法已被广泛应用于类器官模型¹⁷的初步毒性筛查。

必须考虑几个混杂因素。某些化学物质可能通过化学干扰或酶抑制直接抑制荧光素酶酶反应，导致信号熄灭。三维细胞外基质的背景发光、类器官尺寸和密度的异质性，以及不完全的裂解过程，都可能带来显著的孔间和批次间变异性。仅凭ATP发光无法准确区分细胞死亡的模式，也无法阐明其潜在的毒理学机制¹⁸。

为提升方法学可靠性，建议采用系统性的质量控制措施。使用制造商推荐或已验证的裂解缓冲液，并在必要时延长裂解时间、机械解离或冻融循环，以提高基质内细胞裂解效率。其次，在测定优化过程中进行ATP尖突回复原实验，以评估测试化合物或裂解环境对发光反应的直接抑制潜力。第三，利用ATP标准曲线确认线性检测范围，并严格控制试剂添加、培养和板读数之间的时间，以最大限度减少技术变异。最后，在每个检测中包含空白对照、载对照和负对照，并纳入足够的技术重复样本，以评估和校正边缘效应及批次相关变异。近年来，开发出多种类器官优化的可存活性检测方法，其裂解化学效果更好且信号稳定性增强，这些配方在三维毒性测定中普遍表现出优异性能¹⁹。总之，本研究采用人类CO作为环境重金属毒理学的体外模型，建立了一种高通量、灵敏的ATP生物发光检测法，以评估类器官对镉暴露的敏感性。本研究为类器官研究系统中的毒性评估提供了实用的实验参考和方法指导。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 μm cell strainer	BIOLOGIX	15-1100
15 mL centrifuge tubes	BIOFIL	CFT011150
1mL pipette tips	浙江百迪生物科技有限公司	H808633
200 μL pipette tips	浙江百迪生物科技有限公司	H808214
24-well plates	康宁公司	3524
50 mL centrifuge tubes	CLUXCELL	321050
96-well plates	康宁公司	220400
BioTek Cytation 5	BioTek 公司	16280004	特定微孔板阅读器的操作软件。
Cadmium chloride,10g	Sigma	202908-10G
Cell Counting-Lite 3D Luminescent Cell Viability Assay	Vazyme	DD1102-01/02/03	1:1体积比的发光活力试剂。
Human Colonic organoid Kit Plus(Expansion)	Mogenel Biotechnology	MA-0817HOO1HLP
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	thermo fisher	6125552
Forceps	北京博莱生物科技有限公司	FS019
Ice box	北京博莱生物科技有限公司	FBX078
Low-temperature high-speed centrifuge	安徽中科中嘉科仪器有限公司	KDC-40
Matrigel	Mogenel Biotechnology	82755	基底膜基质
Organoid Dissociation Solution	Mogenel Biotechnology	MB-0818L01L	Organoid Dissociation Solution
Penicillin-Streptomycin	北京博莱生物科技有限公司	C0222
Phosphate-buffered saline (1XPBS)	Fdbio 科学生物科技有限公司	FD7032
Pipettes	RUINING	Pipet-Lite XLS
GraphPad Prism 8.0	GraphPad 软件		特定微孔板阅读器的操作软件。
Scissors	北京博莱生物科技有限公司	FS001
Tissue Digestion Solution	Mogenel Biotechnology	MB-0818L06L/MB-0818L06S