从自组装间充质干细胞聚集体提取的细胞外囊泡的分离与治疗应用

摘要

该方案详细介绍了从自组装干细胞聚集体中高效分离大型细胞外囊泡（LEVs）及其在下颌骨再生中的治疗应用。

摘要

细胞外囊泡（EVs）是细胞间通信的重要介质，也是再生医学中有望成为无细胞的代理。在EV亚群中，大型细胞外囊泡（LEVs）因其丰富的促进再生载荷，特别适合组织修复。然而，用于生成功能性牙干细胞衍生LEV用于后续表征和治疗评估的标准化且可重复的方法仍然有限。利用顶端乳头干细胞（SCAPs）卓越的骨生成潜力，我们在低粘附条件下开发了三维培养模型，诱导自组装的SCAP聚集体。该模型模拟生理间充质缩合，显著增强细胞间相互作用并促进LEV分泌。提供关键培养参数和处理说明，以提升聚合一致性并最大化LEV产出，同时保持细胞活性。本文介绍了一种标准化方案，用于高效生产功能性SCAP衍生LEVs，包括3D骨材生成、差别离心分离、基于纳米颗粒跟踪分析（NTA）的颗粒尺寸分布和浓度分析，以及使用热交联水凝胶进行下颌骨缺损修复的治疗递送。该方法简化了LEV的生产，用于下游机制研究和颅面再生的临床前评估。这种优化的工作流程确保生物活性LEV的可重复制备，产量稳定且富含前骨质生成货物，促进基础研究并加速EV介导颅面重建的临床转化。在典型应用中，水凝胶加载LEV在缺陷部位提供局部储存，便于植入时的操作。该方法总体上提供了一个可扩展的平台，用于制备SCAP衍生的LEV，并凸显了标准化报告和转化研究设计的关键考虑因素。这一方法支持颅面电动车实验室的更广泛应用。

引言

细胞外囊泡（EVs）是由细胞释放的膜结合纳米颗粒，通过转移生物活性物质如蛋白质、微粒RNA和脂质来介导细胞间^通信。在EV亚群中，大型细胞外囊泡（LEVs）因其直接从细胞膜释放且固有富集促进再生分子而显著，非常适合组织修复和再生需求 ^4,5。在再生医学中，源自间充质干细胞（MSCs）的EV越来越被认可为可行的无细胞替代全细胞疗法的替代方案 ^6,7,8。它们重现了亲本MSC的旁分泌再生效应，同时避免了直接细胞移植的限制，如植入效率低、免疫原性和批量变^异性7,8,9,10。在MSC来源中，顶端乳头干细胞（SCAPs）表现出优越的骨生成和牙源分化潜力11,12,13，使得SCAP衍生的EV在口腔面骨和牙组织修复中尤具吸引力8。

值得注意的是，电动汽车的生物生成和功能深受细胞微环境的影响^14,15。传统的二维（2D）单层培养显著偏离原生组织环境^16,17，常常产生再生能力受损的胚胎¹⁸。相比之下，三维（3D）自组装MSC集合体复制了生理间充质缩合的关键方面，这一发育阶段特征为高细胞密度、密集的细胞间接触以及富集的细胞外基质（ECM），提供结构支持，并传递调节细胞粘附、迁移和命运决策的生化和机械信号 19,20,21.这种仿生三维微环境不仅增强了细胞间通讯和副分泌信号^22,23，还促进了EV的分泌，其产量更高，生物活性货物结构也改善了 24,25,26。利用三维自组装MSC聚合体因此成为获得功能强效电动车用于^{再生应用的}极具前景的策略。

尽管基于聚合的电动汽车具有明显优势，但用于隔离和表征其与三维系统的标准化协议仍然不充分。当前的电动车隔离方法，如差动离心，已经成熟，并为^{电动汽车生产提供了}可扩展的框架。同样，已有报道的MSC聚合方法，通常依赖维生素C诱导的细胞卷曲和二维培养细胞的聚集²⁸。然而，这些维生素C诱导聚集体中的ECM结构可能仍可能与原生间充质组织中空间组织化、凝聚状的微环境不同。相比之下，在低粘附条件下，无支架自组装有助于形成紧密的球形聚合体，这些聚合体近似间充质缩合的关键特征（^19,29）。目前，缺乏一套系统且可重复的工作流程，用于从此类低附着力诱导的3D SCAP聚合中分离并应用EV。从实际角度看，传统二维SCAP培养液产出的LEV通常在纳米粒子追踪分析（NTA）中约为11个11颗粒/mL区间，三维低粘附聚预计将使LEV产出增加数倍，同时保持后续应用的可重复性。为弥补这一空白，我们在此详细介绍了一套综合方案，利用SCAP固有的整骨/齿源功能，并通过3D低粘附聚优化MSC微环境。该方案能够可靠地生产高质量的LEVs，为推动颅面医学中无细胞再生疗法的标准化工具。

方案

所有动物实验均经第四军事医科大学动物护理与使用委员会批准，并符合ARRIVE指南进行。人类样本的采集和使用已获得第四军事医科大学伦理委员会批准（批准号为IRB-REV-2022187）。采样前均获得所有捐献者的书面知情同意;对于未成年人或无法提供同意的捐赠者，则需获得其法定监护人的书面知情同意。所有试剂均经过无菌过滤，细胞培养程序在生物安全柜内进行以保持无菌（见 材料表）。将所有人类来源材料（牙齿、组织、初级细胞、调质培养基和EV制剂）视为潜在传染性。在经过认证的生物安全柜内，使用适当的个人防护装备（PPE），包括实验服、手套和眼部防护具，进行所有涉及人体样本的程序。在生物安全和废物处置方面，遵循机构BSL-2指南：将所有人为来源材料和受污染一次性物品作为BSL-2生物危害废物处理;使用后，使用机构认可的消毒剂消毒表面/设备。在有标签的容器中收集液态生物危害废物，并在处置前使用经批准的方法将其灭活。将锐器立即放入批准的锐器容器中（不得更换盖子）。将动物组织/尸体及麻醉/化学残留物视为受监管的生物危害/化学废弃物，并依相关法规通过机构服务处置。

1. 人类SCAP的分离与培养

注意：P/S是一种生物活性抗生素混合物，可能会引起皮肤/眼睛刺激或过敏反应。打开时放在BSL-2生物安全柜内的手柄;佩戴手套和护目镜;避免气溶胶产生;并按照机构化学废物指南处理废物。胶原酶I型（溶液）是一种生物活性酶，可能引起皮肤/眼睛刺激或过敏反应。BSL-2生物安全柜中的手柄;佩戴手套和护目镜;避免移液过程中溅射和气溶胶产生;并根据机构程序及时净化泄漏。在储存和使用过程中保护胶原酶I型免受光照影响（详见 材料表）。

1. 从健康供体（16–21岁）采集第三磨牙顶端未成熟，并用含1%青霉素/链霉素（P/S）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）彻底冲洗（见 材料表）。
2. 用无菌眼用镊子和剪刀从根尖切除乳头顶端组织，然后将其切碎成小块（<1 mm³）。
3. 将所有组织碎片转移到15毫升离心管中。将碎片与2 mg/mL胶原酶I型在37°C下消化1小时，每15分钟轻轻摇晃一次。
4. 通过添加等量的完全最小α必需介质（α-MEM）（见 材料表）来阻止消化。
   注意：胶原酶I型的消化时间不固定，取决于组织消化状态。密切监测，加入培养基让组织半侵蚀时终止消化。过度消化可能损害细胞存活能力。
5. 在4°C下以100× 克 离心分离细胞悬浮液5分钟，丢弃上清液，并将沉淀重新置于2毫升完整α-MEM中。
6. 将消化后的组织悬浮液播种到一个10厘米的培养皿中，加入8毫升完整的 α-MEM，最终每皿10毫升。
7. 在37°C的加湿培养箱中培养SCAPs，含5%二氧化碳。
   注意：持续监测培养，细胞通常在3至7天内从组织碎片中迁移并以放射状方式附着到培养皿上。如果组织存活率较低或5天内无细胞迁移，则切换至全套α-MEM补充20%血清。
8. 细胞传代时，当细胞融合度达到80–90%时，用5毫升PBS清洗残留培养基。随后，它们与2毫升0.25%胰蛋白酶-1 mM EDTA在37°C下孵育2分钟（见 材料表）。
   注意：胰蛋白酶-EDTA是一种刺激物，可能损伤皮肤和眼睛。请戴手套和护目镜，避免溅水和气溶胶形成，若接触及时用大量水漱口。按照机构指南处理含胰蛋白酶的液体废物。
9. 当显微镜下细胞变圆且细胞间接合受破坏时，轻柔地将细胞从培养皿中剥离，避免过度损伤结构。通过加入4毫升完整的 α-MEM 中和胰蛋白酶。
10. 通过温和、重复移液收集细胞，放入新的15毫升离心管中。在100 × g 离心5分钟后，丢弃上清液，将细胞沉淀重新置于完全的α-MEM中。将悬浮的细胞播种到新鲜的培养皿或水槽盘中。介质每两天更换一次。
    注意：确保用于聚合培养的SCAPs在第5段内。随着^30、31的通道数量增加，茎性和聚集能力下降，这可能降低骨材形成效率和功能性能。

2. SCAP聚合的自组装

1. 通过胰蛋白酶处理采集3–5个SCAP，100 × g 离心5分钟，再悬浮于α-MEM中，补充10% EV耗尽的胎牛血清（FBS）和1% P/S（见 材料表）。
   注意：通过在150,000 克、4 摄氏度下离心，准备EV耗尽的FBS×以去除EV和其他杂质³²。
2. 用血细胞计计数细胞，并在超低附着的24孔板中每孔播种1×^10个5 细胞。将介质容积调整为每井500微升以保持悬浮状态。
3. 在37°C下与5%二氧化碳共孵育72小时，每48小时更换培养基。
4. 每天在倒置光学显微镜下监测骨料形成情况。当骨料直径达到200–400微米，呈现紧凑、光滑边缘的结构时，收集EVs。
   注意：定义一个生产“批次”为从同一细胞通道同一天播种的SCAP聚合中收集的调质培养基中分离出的LEV，并在同一采集窗口（72小时）内保持相同的培养条件下。每批批次通过离心独立处理。播种后48小时更换培养基，并补充同样量的新鲜培养基。LEV生产时，在播种后48小时和72小时分别收集调质培养基，并将采集的培养基（0–48小时和48–72小时分馏）合并为一批。将调制培养液保持在4°C，并进行LEVs分离处理。

3. 从SCAP聚合中分离和表征EV

1. 用于隔离大型LEV的差动离心
   1. 将含有SCAP聚集体的培养基收集到15毫升离心管中。
   2. 在800× 克 离心机温度4°C下离心10分钟，去除完整的集合体和大块细胞碎片。
   3. 将上清液转移到新的15毫升管中，并在2500 × g 离心机加热，4°C下离心15分钟，以消除残留的血小板和小细胞碎片。
   4. 小心将上清液转移到无菌的1.5毫升锥形管中，并在16,800×克下以4°C离心30分钟，沉淀LEV。
      注意：使用1.5毫升锥形管以提高LEV产率。
   5. 丢弃上清液，将沉淀重新悬浮于1毫升无菌PBS中，然后以16,800× 克 在4°C离心机下离心30分钟，使用固定角度转子（兼容标准台式离心机）为LEVs进行沉淀。
   6. 将减速/制动设置为“减速”或“低速”档（通常是制动等级1或2），以防止LEV颗粒在最终减速阶段被重新悬挂。
   7. 丢弃上清液，将最终LEV沉淀液重新置于50微升无菌PBS中。请立即使用悬浮液（24小时内），或将其保存在4°C。 避免冷冻以减少生物活性损失。
      注意：准备约80口骨料井，以获得足够的LEV，用于典型的下游实验。LEVs样品建议用于即时表征或治疗应用，而非长期储存。如果需要更长时间储存，可以分割LEV悬浮液（例如每管5–10微升），以避免反复的温度波动和冻融循环。将分量速冻放在干冰上，储存在−80°C下，用于短期长保存（例如1–3个月）。冰冻一次后立即使用。注意，冷冻可能降低生物活性，并改变颗粒的恢复率和粒径分布;因此，尽可能使用新制备的LEV进行功能性研究。储存后质量控制时，使用NTA重新测量颗粒浓度和粒径分布，只有当数值保持在预定接受范围内时才继续测量。 此外，在本协议中，NTA颗粒浓度作为主要定量方法，以避免与基于蛋白的测定法如BCA相关的囊泡损失，从而最大化后续应用的产率。
2. 颗粒大小和浓度的NTA
   注意：NTA使用市售纳米颗粒跟踪分析仪（见 材料表）进行，以评估颗粒大小分布和颗粒浓度。
   1. 将1微升LEV悬浮液（摘自第3.1节第6步）稀释于1499微升无菌PBS中，置于无菌1.5毫升锥形管中，充分混合。
   2. 启动兼容软件，并用10毫升超纯水填充样本细胞。确认每帧背景粒子计数<为10，以确保系统干净（见 材料表）。
   3. 用预先准备好的标准溶液校准仪器。将软件参数设置为：灵敏度70，快门70，最小面积5，最小亮度20。执行“自动校准”以确保激光聚焦。调整标准稀释度，直到软件显示的颗粒数为50–400（最好是~200），然后运行校准程序。
      注意：通过在1毫升蒸馏水中重组1微升校准珠，制备标准溶液，以制备初级溶液。将100微升主溶液稀释于25毫升蒸馏水（1：250,000稀释），并以4°C储存，保存时间可达1周。
   4. 分析前用5毫升蒸馏水冲洗样品细胞。
   5. 用1毫升蒸馏水冲洗通道，确认检测界面上的粒子计数为<10。
   6. 用无菌1毫升注射器以恒定速度0.5 mL/s注射稀释后的LEVs样本1毫升。
      注意：手动控制注射器以保持稳定的注射速度。
   7. 进行粒子分析并生成报告。在软件中创建新的测量，选择“大小/浓度”模式。将采集设置为3次录制，每次录制60秒，25°C，使用步骤3中的相同检测参数（灵敏度70，快门70，最小面积5，最小亮度20）。
   8. 开始采集并确认屏幕上的粒子计数保持在每帧50–400个（最好是~200个）;如果超出该范围，停止并调整样品稀释度，然后重复步骤6。采集后，运行分析以获取平均尺寸、模态尺寸、D10/D50/D90和颗粒浓度（颗粒数/毫升）。然后将结果和尺寸分布图导出为.csv和.pdf（或等效报告格式），并将测量文件保存以便记录。

4. LEVs在下颌骨再生中的治疗应用

1. LEV载荷水凝胶的制备
   1. 准备Pluronic F-127库存（20%含水/真空）。将Pluronic F-127粉末加入无菌PBS中，最终浓度为20%（w/v），并在4°C下搅拌过夜，直到完全溶解且均匀（见 材料表）。整个制备过程中，溶液温度保持在4°C，以避免过早凝胶化。
      注：20%（w/v）Pluronic F-127在4°C时为液态，并在~20–25°C（视管子/房间而异）进行热凝胶化;在37°C时，它会变成稳定的凝胶。
   2. 在寒冷条件下装载LEV。预冷管子、移液器尖端和水凝胶至4°C。 通过温和移液和短暂低速涡旋，将50微克LEV（相当于两块24孔骨料板的LEV）与1毫升20%Pluronic F127混合，以确保均匀分布。将混合物放在冰上或4°C，直到着床。
   3. 操作/使用指导（为了可重复性）。在冰上快速进行装注和注射器/注射头装填。如果混合物温度超过~20–25°C，粘度升高并可能开始凝胶化;此时，使用前应恢复至4°C，直到材料完全可流动。置入缺损后，在体温（37°C）下原位进行凝胶化。
2. 小鼠下颌骨缺损模型的建立
   1. 通过腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉8周大的C57Bl/6小鼠（雄性或雌性）（见 材料表）。
      注意：戊巴比妥钠是一种强效镇静剂/麻醉剂，如果误注射、摄入或吸入对人体有毒。准备和施打时使用安全的锐器操作（不要重新套针;立即丢弃在锐器容器中），佩戴手套和护目镜，避免皮肤接触，并按照机构的管制药物政策储存和记录使用情况。通过检查小鼠是否有缺失角膜反射以及夹足时没有肢体外缩，确认麻醉效果良好。涂抹保护性眼药膏以防止角膜干燥。
   2. 剃除左下颌区域的毛发，交替用10%的聚维酮碘和75%乙醇消毒。
      注意：75%乙醇高度易燃;远离点火源使用，确保通风良好。聚维酮碘可能引起皮肤/眼睛刺激或过敏反应;戴手套，避免接触眼睛或黏膜，及时清理洒出的液体。
   3. 沿下颌边缘做一个1厘米纵向切口，钝地切除软组织以暴露下颌角。
   4. 使用牙科钻机并连续盐水冲洗，形成直径2毫米的圆形骨缺损，以防止热损伤（见 材料表）。
      注意：密切监测术中出血，使用小棉球控制出血，保持手术视野畅通，降低感染风险。避免用电钻接触周围软组织，以防止缠绕。
3. LEV载水凝胶的植入
   1. 将LEV-水凝胶混合物装入无菌注射器，注入骨缺损处，确保完全填充。
      注意：每只小鼠给予~10微克LEV。需要两块24孔的SCAP骨料板才能产生足够的LEV，以支持n=5只小鼠的实验。
   2. 对照组注射等量的Pluronic F-127水凝胶，不含LEV。
   3. 用4-0可吸收缝线缝合切口，并使用皮下止痛药（卡普罗芬，5毫克/公斤）以缓解术后疼痛（见 材料表）。
      注意：卡洛芬是一种具有药物活性的非甾体抗炎药（NSAID），如果误注射或接触皮肤/眼睛，可能会有害。请戴手套，避免利器伤害，将针头/注射器丢弃在锐器容器中，并按照机构药品废弃程序处理未使用的药物和受污染物质。
   4. 将老鼠放在加热毯上，直到麻醉恢复，然后转移到单独的笼子，允许自由获取食物和水。
      注意：在小鼠恢复足够意识以维持胸骨卧姿之前，不要让它们单独行动。只有在小鼠完全康复后才应将其送回群体饲养。

结果

根据实验流程，关键步骤包括SCAP分离、骨团形成、LEVs提取和治疗植入均已成功完成（见图1）。供体临床阻生的第三磨牙表现出未成熟的顶尖，且根尖乳头组织完整附着于开放性根管孔周围，确认了SCAP的适当来源（见图2A）。体 外培养时，具有丰富细胞突起的纺锤形SCAP从顶端乳头组织迁移，并在3天内逐渐汇合，形成典型的涡旋状排列（见图2B）。流式细胞术确认了CD90阳性和CD45阴性SCAP表型（见图3A）。自续能力得益于CFU的成立和EdU的合并（见图3B）。通过阿利扎林红S和油红O染色（见图3C）展示了多谱系分化潜力。免疫荧光染色显示间充质标志物呈阳性（Nestin）和上皮标志物阴性（CK14）谱（<...

讨论

对无细胞再生疗法日益增长的兴趣使间充质干细胞衍生的LEVs成为全细胞移植的有前景替代方案，因为它们能够在无细胞方法风险的情况下递送生物活性分子。然而，LEV疗法的临床转化因缺乏能够充分保留和增强LEV功能的生理相关培养系统而受阻。传统的二维单层培养与支持间充质干细胞在体内功能的原生微环境有显著差异，导致LEVs再生潜力有限^18,24。为解决这一限制，我们开发了一套基于自组装三维SCAP聚合的协议，建立了标准化且可扩展的工作流程，不仅提升LEV产率，也提升了其在临床环境中的功能相关性。

本研究引入了一种高效的无支架培养系统，通过低粘附性聚合的SCAPs重现干细胞生态位的关键生理特征。与表现出异常细胞间通信和旁分泌信号的二维培养，或引入外源伪影的依赖支架聚集方法不同，三维自组装SCAP聚集体紧密模拟高细胞密度、富含细胞外基质的微环境，有利于MSC分化^...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1毫升带针头注射器	BD	300841	麻醉
10厘米细胞培养皿	科宁	353003	细胞培养
15毫升聚苯乙烯离心管	科宁	352095	细胞培养
75%乙醇消毒剂	海尸海诺	HS-750	运营
可吸收缝线4-0	金环医疗	R413	运营
台式离心机	威根斯	公元187年	电动车隔离
二氧化碳孵化器，150升，通用型	热扑鱼	51032874	细胞培养
胶原酶I型	热扑鱼	17100017	细胞培养
棉球	德罗亚尔	30-033	运营
弯曲操作剪刀	JZ外科器械	J21040	运营
牙科移动涡轮单元	卡沃	S609C	运营
电子天平	志柯	ZK-DST	细胞培养
埃彭多夫管道	埃彭多夫	3810X	电动车隔离
镊子，没事	JZ外科器械	JD1020	运营
脱毛霜	Veet	1.00097E+11	运营
高速球形刺刀	登茨普利西罗纳	E0123	运营
高速手腕	卡沃	KV-1-008-1644	运营
倒置显微镜	Mshot	MF53-N	细胞培养
MEM与alpha;（最低必需介质 & alpha;）	热扑鱼	12561056	细胞培养
纳米粒子跟踪视频显微镜PMX-120	粒子度量	ZetaView PMX120	纳米颗粒追踪分析
青霉素-链霉素（P/S）	热扑鱼	15140122	细胞培养
戊巴比妥钠	西格玛-奥尔德里奇	57-33-0	麻醉
磷酸盐缓冲盐水（PBS）	热扑鱼	10010023	细胞培养
普鲁罗尼克F-127	西格玛-奥尔德里奇	P2443	EV植入
聚维酮碘溶液	巴克斯特	PROSL500	运营
特殊胎儿牛血清（FBS）	热扑鱼	12664025	细胞培养
无菌纱布块	获胜	10-000-681	运营
桌面高速微离心机	日立	CT15E	电动车隔离
钻头	Biomet 微固定	01-9182	运营
胰蛋白酶-EDTA	热扑鱼	25200072	细胞培养
超低附着24孔板	科宁	3473	细胞培养
漩涡混合精灵	科学产业	SI0425	EV植入