本方案描述了采用超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱联用技术（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS），结合网络药理学和分子对接方法，预测并验证益气清解方（YQQJ）治疗IgA肾病（IgAN）的物质基础。
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摘要
摘要
本研究采用超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）对益气清解方（YQQJ）中可溶于水及被血液吸收的成分进行表征，并结合网络药理学与分子对接技术，预测并验证YQQJ治疗IgA肾病（IgAN）的物质基础。利用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS分析YQQJ的水提物及含药血清样品，以表征其化学成分并鉴定入血化合物。化合物的鉴定基于标准参考数据库、已发表文献，并综合评估保留时间、前体离子质量精度、MS/MS碎片裂解模式及同位素分布。通过靶点预测数据库预测原型入血化合物的潜在作用靶点，同时从整合生物信息学平台收集IgAN相关靶点。通过蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析筛选核心靶点，并构建“成分-靶点-通路-疾病”网络以确定关键活性成分，进一步通过分子对接分析评估核心成分与靶点之间的相互作用。共鉴定出YQQJ水提物中的185种化合物，其中28种以原型形式进入血液循环。PPI分析识别出42个与YQQJ治疗IgAN作用相关的核心靶点。KEGG和GO富集分析显示，这些靶点参与细胞增殖、炎症反应和细胞凋亡等生物学过程，并显著富集于PI3K-Akt、MAPK和JAK-STAT等关键信号通路。分子对接分析表明，六个关键靶点（CASP3、IGF1R、JUN、STAT3、PRKCB和PIK3CA）与三种主要入血成分——脱乙酰基异钩藤酸（Deacetylasperulosidic acid）、京尼平苷酸（Geniposidic acid）和薯蓣皂苷元（Dioscin）——之间具有稳定的低结合能，提示存在较强的结合潜力。综合分析表明，YQQJ通过多成分、多靶点协同发挥对IgAN的治疗作用，其中脱乙酰基异钩藤酸、京尼平苷酸和薯蓣皂苷元可能是其发挥疗效的关键活性成分。
引言
IgA肾病（IgAN）是全球最常见的原发性肾小球肾炎之一。其临床表现具有高度异质性，通常表现为镜下或肉眼血尿，常伴有不同程度的蛋白尿、高血压和肾功能损害。早期研究表明，多达40%的患者在确诊后20年内进展至肾衰竭1；然而，近期证据显示预后明显更差，大多数患者在确诊后10–15年内即发展为肾衰竭，仅有少数患者能终身维持肾功能而不进展2,3,4。尽管近年来针对IgAN的治疗已取得临床进展，但其高昂的成本和相对较慢的起效速度仍是主要挑战，且其临床获益与风险的平衡仍存在争议5,6。
中医在治疗复杂疾病方面展现出独特的优势，具有疗效稳定、不良反应发生率相对较低以及多靶点协同作用等特点7。与单靶点药物不同，中医方剂通常含有多种生物活性成分，可同时调节多条生物学通路。这种多成分、多靶点的作用模式在治疗IgA肾病（IgAN）等复杂疾病方面具有潜在的治疗优势8。根据中医理论，IgAN并无特定的病名，通常归属于“血尿”、“水肿”、“腰痛”、“肾风”及“虚劳”等范畴。多数学者认为其核心病机为肺脾气虚，导致卫气失于固摄，风、湿、热、毒等外邪乘虚侵袭，最终损伤肾脏。虽然病变以肾为主，但心、肝、脾、肺亦可受累9。基于上述认识，大量研究聚焦于寻找具有补气、固表、清热、解毒、利湿等功效的中药及其方剂，用于IgAN的临床治疗10,11。
益气清解方（YQQJ）是本院肾病科治疗IgA肾病（IgAN）的一种有效经验方。该方由七味中药组成，包括Astragalus membranaceus（黄芪）、Lonicera japonica Thunb.（金银花）、Rheum palmatum L.（大黄）、Hedyotis diffusa Willd.（白花蛇舌草）、Dioscorea nipponica Makino（穿山龙）、Spatholobus suberectus Dunn（鸡血藤）和Plantago asiatica L.（车前草）。益气清解方可发挥益气固表、清热解毒、活血利尿的治疗作用12。临床研究证实，益气清解方可显著减少IgAN患者的蛋白尿和血尿，改善肾功能，缓解黏膜免疫相关症状，且具有良好的安全性12,13。
尽管该方剂已显示出良好的临床疗效，但由于中药方剂含有大量化学成分，其药理活性的物质基础仍难以阐明。仅基于色谱或质谱分析的化学成分分析可揭示方剂的整体化学组成，但无法确定哪些化合物被吸收进入体循环并直接产生治疗作用14。此外，传统的网络药理学研究主要依赖数据库预测，通常通过口服生物利用度和类药性等参数筛选候选化合物，这种方法可能遗漏在体内真正发挥药理活性的成分15。
为克服这些局限性，近期研究在中药研究中 increasingly 采用整合分析策略，结合超高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）、血清药化学与系统药理学方法16,17。血清药化学可鉴定给药后进入体循环的化合物，从而为筛选潜在生物活性成分提供药代动力学相关证据18。同时，UHPLC-Q-Orbitrap HRMS 能够在复杂的中药基质中实现化学成分的高精度检测与结构表征19。
与仅依赖化学成分分析或理论靶点预测的方法相比，本研究采用的整合性研究流程——包括基于超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）的成分鉴定、血清药化学筛选、网络药理学分析以及分子对接验证——具有多项方法学优势。UHPLC-Q-Orbitrap HRMS 能够对复杂化学成分进行全面且精确的鉴定。血清药化学通过筛选实际进入体循环的化合物，将候选成分限定于具有体内暴露特征的物质，从而提高后续网络分析的生物学合理性。基于实验确认的入血成分开展的网络药理学分析，可从系统层面探索多靶点作用机制，更真实地反映中药复方的整体药理特性。分子对接进一步对预测的化合物-靶点相互作用提供初步的计算验证，并为后续实验验证中候选分子的优先排序提供科学依据。综上所述，该整合性研究流程为阐明如益气祛瘀方（YQQJ）等复杂中药复方的物质基础与作用机制，提供了一种可靠、高效且符合生理相关性的研究策略。
当能够从动物或人体药代动力学研究中获得体内吸收数据时，该工作流程特别适用于研究复杂中药方剂的药理活性物质基础及其作用机制。它尤其适用于那些临床疗效明确但活性成分尚不清晰的方剂。然而，也应认识到若干局限性。首先，靶点预测的准确性依赖于公共数据库的质量和完整性；其次，该工作流程主要关注在体循环中检测到的原型化合物，未涵盖体内生成的生物活性代谢产物；第三，网络药理学分析所得的预测结果需要进一步的实验验证。尽管存在这些局限性，该工作流程仍为中药复方机制研究中的假设生成与靶点优先排序提供了高效且可靠的方法。
因此，本研究采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱法（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）系统表征玉屏祛湿剂（YQQJ）的水提物成分及其体内循环化合物，从而建立一个相对全面的潜在活性成分数据库。基于该数据集，结合分子对接验证的网络药理学分析，预测了YQQJ治疗IgA肾病（IgAN）的潜在药理活性成分，为后续机制研究提供了基础。
方案
所有涉及动物的实验程序均遵守中国动物福利委员会发布的《实验动物护理与使用指南》。本研究中的所有程序均经广安门医院动物实验中心机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。
1. 动物与药物给药
- 选取12只6周龄雄性Sprague–Dawley（SD）大鼠，体重为200–230 g。
- 将所有动物饲养于实验动物中心。
注意：维持饲养环境温度为20–26 °C，相对湿度为40–70%。采用12 h/12 h明暗循环，以模拟自然昼夜节律。 - 实验前在标准条件下适应性饲养7天，自由摄食和饮水。将大鼠随机分为两组（每组n = 6）：对照组和药物处理组。
- 参照人与动物间按体表面积折算的等效剂量20，通过口服灌胃方式向药物处理组给予YQQJ浓缩提取物，剂量为24.68 mL/(kg·day)。对照组同时给予等体积的蒸馏水，以确保处理同步。
- 连续给药1天，将每日总剂量均分为三次给予（例如08:00、13:00和18:00），以确保在1天内完成全部剂量。
注意：末次灌胃前禁食12 h，可自由饮水。 - 末次给药后2 h和8 h采集血液样本。通过腹腔注射1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉大鼠，从腹主动脉采血。
- 血液样本于室温下直立静置1 h，随后在4 °C条件下以450 ×g离心5 min。检查上清液（血清）是否澄清且无溶血现象。转移上清血清并储存于–80 °C，用于后续分析。
2. 溶液的配制
- 测试溶液的制备
- 根据处方收集愈青祛疾（YQQJ）的全部生药材。向煎煮容器中加入4倍体积的纯化水，浸泡20分钟。
注：纯化水与药材的加水量按4:1（v/w）的比例加入。 - 将混合物加热至沸腾，然后用小火继续煎煮30分钟。用纱布过滤，收集滤液。药渣再加4倍体积水重复煎煮30分钟，再次过滤。
- 合并两次滤液。使用旋转蒸发仪（水浴温度设定为60 °C）将合并后的滤液浓缩，直至浓度达到3 g/mL（w/v，相当于生药量）。
- 确认浓缩提取物为深色黏稠液体，无可见沉淀。于4 °C保存备用。
- 根据处方收集愈青祛疾（YQQJ）的全部生药材。向煎煮容器中加入4倍体积的纯化水，浸泡20分钟。
- 对照品溶液的制备
- 准确称取以下对照品：去乙酰基钩藤酸（Deacetylasperulosidic acid）、京尼平苷酸（Geniposidic acid）、龙胆酸（Loganic acid）、莫诺苷（Morroniside）、绿原酸（Chlorogenic acid）、獐牙菜苷（Sweroside）、车前子胍基酸（Plantagoguanidinic acid）、大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（Rhein-8-O-β-D-glucopyranoside）、染料木苷（Genistin）、芹菜素-7-葡萄糖苷（Apigenin-7-glucoside）、木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（Diosmetin-7-O-β-D-glucopyranoside）、毛蕊异黄酮（Calycosin）、原薯蓣皂苷（Protodioscin）、染料木素（Genistein）、木犀草素（Diosmetin）、伪原薯蓣皂苷（Pseudoprotodioscin）、芒柄花素（Formononetin）、3-羟基-9,10-二甲氧基pterocarpan（3-Hydroxy-9,10-dimethoxyptercarpan）、芦荟大黄素（Aloeemodin）、大黄酸（Rhein）、薯蓣皂苷（Dioscin）。
- 将每种化合物溶于甲醇中，涡旋混合1分钟，然后在室温下超声处理10分钟，以确保完全溶解。
- 用甲醇将各溶液稀释，使每种对照品的最终浓度均为10 µg/mL。
3. 样品制备
- YQQJ 提取物样品的制备
- 取 100 µL YQQJ 水提物至 1.5 mL 离心管中。加入 300 µL 甲醇，涡旋振荡 1 分钟。在 1800 × g、4 °C 条件下离心 10 分钟。确保所得上清液澄清且无悬浮颗粒。
- 取 100 µL 上清液，与 100 µL 超纯水混合，进行 1:1 稀释。轻轻涡旋混匀后转移至自动进样瓶中用于分析。
- 含药血清样品的制备
- 取 100 µL 血清至 1.5 mL 离心管中。加入 300 µL 甲醇，涡旋振荡 10 分钟以确保蛋白完全沉淀。在 1800 × g、4 °C 条件下离心 10 分钟。
- 吸取 270 µL 上清液转移至洁净离心管中。使用真空离心浓缩仪在 120 × g、37 °C 条件下蒸发至干燥，持续 4 小时，直至出现可见的固体残留物。
- 用 90 µL 50% 甲醇水溶液重新溶解残留物。涡旋振荡 1 分钟使残留物完全溶解，然后再次在 1800 × g、4 °C 条件下离心 10 分钟。
- 取 80 µL 最终澄清的上清液转移至自动进样瓶中用于分析。
4. 分析条件
- 色谱条件
- 使用配备色谱柱的超高效液相色谱（UHPLC）系统进行色谱分离。
- 采用二元流动相（A相：含0.1%甲酸的水；B相：乙腈）。按照表1所示的梯度洗脱程序，以0.3 mL/min的流速进行洗脱。设置柱温为40 °C，进样体积为6.0 µL。
注意：色谱柱规格为2.1 mm × 100 mm，填料粒径1.8 µm。
- 质谱条件
- 使用配备加热电喷雾电离（HESI）探针的四极杆-轨道阱质谱仪（quadrupole-orbitrap mass spectrometer）分析样品。
- 参数设置如下：电离电压：3.7 kV（正离子模式）/ 3.5 kV（负离子模式）；毛细管温度：320 °C；鞘气压力：30 psi；辅助气压力：10 psi；脱溶剂温度：300 °C；鞘气和辅助气：氮气；碰撞气：氮气，1.5 mTorr。
- 采用全扫描/dd-MS2模式采集数据。全扫描参数设置如下：分辨率70000，自动增益控制目标值1×106，最大隔离时间50 ms，m/z扫描范围100 – 1500。
- dd-MS2数据采集参数如下：分辨率17500，自动增益控制目标值1×105，最大隔离时间50 ms，选择前n个（n≤10）最强的母离子进行碎裂，并启用动态排斥机制，隔离窗口m/z为2，碰撞能量分别为10 V、30 V和60 V，强度阈值为1×105。
5. 质谱数据的处理
- 使用专业的数据处理软件处理获取的质谱数据。进入“导入数据”模块并上传原始数据文件。
- 执行峰提取模块，进行峰解卷积以归类加合离子并生成化合物特征。
- 检索参考化合物数据库、靶向预测数据库及相关已发表文献，用于候选物鉴定。
- 基于高分辨质谱数据，采用两种互补的鉴定策略进行化合物鉴定。
- 基于参考标准品匹配的鉴定。通过与真实参考标准品比较来确认化合物。仅当满足以下所有条件时，方可接受鉴定结果：
- 质量准确性：前体离子和碎片离子的质量误差必须在 ±5 ppm 范围内。
- 谱图相似性：实验测得的 MS/MS 谱图与参考标准品 MS/MS 谱图之间的余弦相似性得分必须 ≥ 0.85。
- 同位素分布：同位素模式匹配得分必须 ≥ 90%。
- 色谱行为：检测到的化合物与参考标准品之间的保留时间偏差必须 < 0.2 分钟。
注：满足上述所有条件的化合物标注为 MSI 1 级，代表已确认的结构鉴定。
- 基于高分辨质谱数据和计算机模拟谱图预测的鉴定。对于无可用参考标准品的化合物，基于精确质量测量和计算谱图预测进行初步鉴定。仅当满足以下条件时，方可接受注释：
- 质量准确性：前体离子的质量误差必须在 ±5 ppm 范围内，碎片离子的质量误差必须在 ±10 ppm 范围内。
- 谱图相似性：使用 Progenesis QI 算法，将实验测得的 MS/MS 谱图与基于化合物 SMILES 结构生成的理论 MS/MS 谱图进行比较。余弦相似性得分 ≥ 0.60 的匹配结果可被接受。
- 同位素分布：同位素模式匹配得分必须 ≥ 90%。
- 色谱行为预测：实验保留时间与机器学习预测保留时间之间的偏差必须 < 1.0 分钟。
注：该保留时间预测模型是基于在相同色谱条件下分析的 2000 多种参考化合物的实验色谱数据训练而成。满足这些条件的化合物标注为 MSI 2 级，代表具有高结构可信度的初步鉴定化合物。
- 基于参考标准品匹配的鉴定。通过与真实参考标准品比较来确认化合物。仅当满足以下所有条件时，方可接受鉴定结果：
6. 网络药理学
- 鉴定血液吸收成分及IgAN相关靶点
- 将鉴定出的YQQJ原型血液吸收成分导入靶点预测数据库。选择 "Homo sapiens" 作为目标物种，获取其潜在靶点。将这些靶点记录为YQQJ中血液吸收化合物的靶点集合。
- 使用关键词“IgA肾病”从整合的生物信息学平台中检索IgAN相关疾病靶点。整合多个来源的结果以最小化偏差。
注： 使用蛋白质数据库将所有检索到的靶点统一转换为基因符号（Gene Symbol）格式，以确保一致性。
- 构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络并鉴定核心靶点
- 合并YQQJ血液吸收化合物的靶点集合与IgAN疾病靶点集合，并提取其交集。
- 将交集靶点上传至PPI平台21。配置参数：将物种设为 Homo sapiens，置信度分数设为0.90，并剔除所有未连接的节点。
- 将PPI数据导入可视化软件22。启动拓扑分析插件，计算度中心性（DC）23、介数中心性（BC）24和接近中心性（CC）25。
- 通过筛选拓扑参数值（DC、BC和CC）高于中位数的节点，确定YQQJ对抗IgAN的核心治疗靶点。
- 构建并分析“YQQJ–血液吸收成分–靶点–通路–疾病”整合网络
- 准备节点属性文件：创建一个包含两列的电子表格。第一列标记为 节点名称，第二列标记为 节点类型。为每个节点分配以下五种类别之一：方剂、血液吸收成分、交集靶点、通路或疾病。
- 准备网络相互作用（边）文件：创建一个电子表格，定义节点之间的连接关系（例如，血液吸收成分到交集靶点）。确保所有节点名称与节点属性文件中的名称一致，以避免映射错误。
- 导入并构建网络：启动网络可视化软件。进入 文件 > 导入 > 网络 以加载边文件。在预览窗口中，将列映射为 源节点 和 目标节点，然后点击 确定 生成初始图谱。
- 映射节点属性并设置可视化样式：通过 文件 > 导入 > 表格 导入节点属性文件。打开 样式 面板，将 节点类型 列映射到特定的视觉属性，包括节点形状、填充颜色和大小。
- 执行拓扑分析：进入 工具 > 分析 网络以进行拓扑计算。基于度值筛选并识别核心活性成分和关键治疗靶点。
注： 使用与步骤6.2中描述相同的拓扑参数，以确保核心节点识别的一致性。 - 导出网络图像：完成网络布局调整。进入 文件 > 导出 > 网络 为图像，保存优化后的可视化结果。
- GO富集分析与KEGG通路分析
- 提交基因列表：打开基于网页的功能注释平台。进入 步骤1：提交基因列表 区域，上传先前筛选出的核心靶基因列表26。
- 选择物种：在 步骤2：输入物种 和 步骤3：分析物种 的下拉菜单中，选择 H. sapiens.（人类），以确保分析在正确的生物学背景下进行。
- 配置自定义分析：选择 自定义分析 模式。在 富集 类别中，勾选以下数据库：基因本体（GO）分子功能（MF）、GO生物过程（BP）、GO细胞组分（CC） 和 京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路。
- 设置显著性阈值：将P值截断设为 < 0.01，最小富集倍数设为 ≥ 1.5，最小重叠数设为 ≥ 3。其余参数保持默认设置。
- 执行分析：点击 富集分析 按钮提交任务，并等待计算完成。
- 获取并导出结果：访问生成的分析报告页面。点击下载按钮，以电子表格格式导出详细的富集数据，以及相应的条形图和热图。
7. 分子对接验证
- 从结构生物学数据库中下载核心靶点的高分辨率（< 2.50 Å）三维蛋白结构以及核心入血成分的二维化学结构27。
- 启动分子对接软件，并导入已下载的结构文件。
- 依次执行以下预处理步骤：进入 Edit > Remove Water，以去除水分子；选择 Edit > Remove Heteroatoms，以删除非标准残基。
- 进入 Edit > Hydrogens > Add > Polar Only，添加极性氢原子。通过 File > Save > Write PDBQT 将处理后的结构保存为 PDBQT 格式。
- 使用 Grid > Grid Box 工具定义对接位点。根据需要自适应调整网格盒尺寸（20–100 Å），以确保完全覆盖预测的结合区域。
- 初始化对接参数：通过 Docking > Macromolecule > Set Rigid Filename 选择受体，并通过 Docking > Ligand > Open 打开配体。对接参数设置如下：搜索次数（exhaustiveness）= 32，能量范围（energy range）= 3 kcal/mol，最多保留 10 种结合构象。对于含有共结晶配体的蛋白，对接网格盒以该配体的质心为中心，并延伸 8.0 Å；对于无共结晶配体的蛋白，则使用 DoGSiteScorer 预测结合口袋，覆盖范围约为 90%。
- 选择拉马克遗传算法（Lamarckian Genetic Algorithm, LGA）作为搜索策略。通过 Docking > Run AutoDock 执行模拟计算。
- 根据计算得到的结合能（对接评分）评估结合亲和力28。
注：结合能越低，表明预测的生物活性越强，蛋白-配体复合物的结构稳定性越高。通常以≤ -5.0 kcal/mol 作为阈值，用于判断具有有利结合稳定性的相互作用。
结果
玉屏祛湿汤水提取物中化学成分的分析
在方案4建立的条件下，对玉屏祛湿汤（YQQJ）水提取物进行成分分析。采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）在正负离子全扫描模式下对YQQJ水提取物进行成分轮廓分析，所得基峰离子色谱图（BPI）如图1所示。在此基础上，结合自建化学成分数据库与MS/MS谱图特征分析，成功鉴定了水提取物中的185种化合物，详细信息汇总于补充表1。用于化合物鉴定的代表性MS/MS谱图匹配及碎片裂解模式见补充图1。化合物类别统计分析显示，黄酮类和萜类化合物为YQQJ中的主要成分，共94种，占比最高。
血吸附的玉屏祛风煎成分
为明确YQQJ给药后体内的直接生物活性物质，对给药后采集的血清样本进行了分析。空白血清的BPI色谱图（图2) 被纳入作为对照，以区分药物来源的化合物与内源性血清成分。根据含药血清的BPI结果图3)，共鉴定出28种进入血液的原型成分，主要包括黄酮类、萜类和甾体类化合物。通过对元胡止痛浸膏提取物、空白血清和含药血清中代表性化合物的提取离子色谱图（EICs）进行分析，进一步证实了药物来源的成分在体循环中的存在（补充图2）。其中，10 种化合物来源于 Spatholobus suberectus Dunn, 7 来自 穿龙薯蓣 Makino, 7 来自 黄芪，6 来自 Hedyotis diffusa Willd.，6 来自 Lonicera japonica (Thunb.).，4 来自 Plantago asiatica L.，以及4个来自 Rheum palmatumL.，如综述所述 补充 表1.
与IgAN相关的益气祛湿清解方（YQQJ）入血成分的靶点预测
共有28种已鉴定的原型成分进入血液，被输入靶点预测数据库，获得459个潜在靶点。同时，从整合的生物信息学平台中检索到2779个与IgAN相关的靶点。通过交集分析，确定了YQQJ与IgAN之间共有247个重叠靶点（图4）。
蛋白质相互作用网络的构建与分析
将247个交集靶点上传至PPI平台，利用可视化软件根据三个拓扑参数（DC、BC和CC）筛选核心靶点，最终确定42个靶点为核心节点。筛选这些核心靶点的工作流程详见补充图3。在PPI网络中，节点的大小和颜色随参数值变化而变化（图5），其中TP53、SRC、AKT1、ESR1和STAT3位列前五位核心靶点。
“方剂-入血成分-核心靶点-通路-疾病”网络
为系统揭示益气解毒方（YQQJ）对抗IgA肾病（IgAN）的多成分、多靶点作用机制，采用可视化软件构建了“方剂-入血成分-核心靶点-通路-疾病”相互作用网络。该网络由96个节点和459条边组成，每条边代表两个节点之间的某种关系或相互作用（图6）。
GO 和 KEGG 富集分析
对 42 个核心靶点的 GO 富集分析揭示了 1162 个生物过程（BP）术语、52 个细胞组分（CC）术语和 92 个分子功能（MF）术语。图 7 展示了在 BP、CC 和 MF 类别中富集最显著的前 10 个 GO 术语。KEGG 富集分析进一步识别出与这些核心靶点相关的 182 条通路。图 8 展示了与 IgAN 发病机制密切相关的前 20 条显著富集通路。在这些图表中，红色越深表示统计学显著性越强，气泡越大或条形越长表示该通路中富集的靶点数量越多。
分子对接评价
本研究基于前期对益气祛湿方（YQQJ）治疗IgA肾病（IgAN）关键靶点及相关通路的分析29,30,31,32，选取了6个核心靶点作为受体蛋白进行分子对接，分别为CASP3（PDB ID: 6X8I）、IGF1R（PDB ID: 1JQH）、JUN（PDB ID: 8RPP）、STAT3（PDB ID: 6NJS）、PRKCB（PDB ID: 8SE3）和PIK3CA（PDB ID: 5FI4）。根据IgAN“风邪、湿热毒邪犯肾”的核心中医病机，选择具有清热、祛湿、解毒功效的代表性活性成分为配体，包括白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd.）中的去乙酰基钩藤酸（Deacetylasperulosidic acid）和京尼平苷酸（Geniposidic acid），以及穿山龙（Dioscorea nipponica. Makino）中的薯蓣皂苷元（Dioscin）。对接结果见图9。在所有配体-受体组合中，薯蓣皂苷元（Dioscin）与所有选定靶点的结合能均显著更低，提示其具有更高的预测结合亲和力。除JUN与去乙酰基钩藤酸/京尼平苷酸之间的相互作用外，其余对接组合均表现出良好的结合活性。代表性3D对接构象见图10。
图1：益气解毒（YQQJ）水提物的基峰离子色谱图。（A）正离子模式基峰离子色谱图。（B）负离子模式基峰离子色谱图。色谱图显示了在建立的超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）条件下，益气解毒（YQQJ）水提物的整体化学成分特征。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：空白血清的基峰离子色谱图。（A）正离子模式基峰离子色谱图。（B）负离子模式基峰离子色谱图。这些色谱图代表内源性血清背景谱型，用作对照，以便与含药物血清进行比较，从而区分药物来源成分与内源性组分。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：含药血清的基峰离子流色谱图。（A）正离子模式基峰离子流色谱图。（B）负离子模式基峰离子流色谱图。这些色谱图代表给予YQQJ后在血清中检测到的入血成分的轮廓。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：玉屏祛风方（YQQJ）与IgA肾病（IgAN）之间重叠靶点的维恩图。该图展示了预测的YQQJ靶点数量、IgAN相关靶点数量及其交集，突出了可能参与治疗作用的共有靶点。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：核心靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。节点代表蛋白质靶点，边代表靶点之间的相互作用。节点的大小和颜色深度对应其度值，节点越大、颜色越深，表示在网络中的连接性越高。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：益气活血解毒方（YQQJ）成分、靶点、通路与疾病整合网络。该网络展示了复方、入血成分、核心靶点、信号通路与IgA肾病（IgAN）之间的相互关系。三角形代表疾病；圆形代表通路；V形节点代表YQQJ复方；菱形代表中药药材；六边形代表化学成分；八边形代表原型入血成分；矩形代表作用靶点。请点击此处查看此图的高清版本。
图 7：核心靶点的 GO 富集分析。条形图展示了在 BP、CC 和 MF 三类中富集程度最高的前 10 个基因本体（GO）条目。横轴表示 GO 条目，纵轴表示 −log10(p 值)，反映富集的显著性。缩写：BP = 生物过程；CC = 细胞组分；MF = 分子功能。请点击此处查看该图的放大版本。
图8：核心靶点的KEGG通路富集分析。 气泡图展示了前20个富集最显著的KEGG通路。圆点大小表示富集基因的数量，颜色梯度表示−log10(p值)，颜色越红表示统计学显著性越高。横轴显示基因比例，纵轴列出通路名称。请点击此处查看此图的放大版本。
图9：分子对接结合能热图。该热图展示了核心靶点与关键入血化合物之间的结合能（kcal/mol）。结合能数值越低，表示预测的结合亲和力越强。请点击此处查看该图的放大版本。
图10：代表性分子对接构象。（A）去乙酰基阿司巴洛酸与CASP3的结合构象。（B）薯蓣皂苷与STAT3的结合构象。（C）京尼平苷酸与PIK3CA的结合构象。图像展示了预测的配体-蛋白质相互作用及结合取向。请点击此处查看该图的放大版本。
补充图1：通过高分辨MS/MS对代表性化合物进行结构鉴定。（A）实验光谱（上方，红色）与参考数据库光谱（下方，蓝色）中脱乙酰阿斯珀洛苷酸的头尾比对图谱。（B）脱乙酰阿斯珀洛苷酸的高分辨MS/MS碎片光谱。（C）京尼平苷酸与参考数据库的头尾光谱比对。（D）京尼平苷酸的实验MS/MS碎片光谱。（E）薯蓣皂苷与参考数据库的头尾光谱比对。（F）薯蓣皂苷的高分辨MS/MS碎片光谱。这些图谱展示了用于化合物鉴定的光谱匹配结果。请点击此处下载该文件。
补充图2：各样品中代表性化合物的提取离子色谱图（EIC）。（A）去乙酰基阿魏酸苷酸的EIC。（B）鸡屎藤苷酸的EIC。（C）薯蓣皂苷的EIC。每个图中，上方色谱峰代表YQQJ水提物（ZY），中间色谱峰代表空白对照血清（KBX），下方色谱峰代表给予YQQJ后含有吸收入血成分的血清样品（GYX）。对比结果突出显示了药物来源化合物在血清中的存在。请点击此处下载该文件。
补充图3：核心靶点筛选流程。 该流程图展示了靶点识别的逐步过程，包括化合物靶点预测、IgAN相关靶点收集、交集分析、PPI网络构建，以及基于拓扑参数的核心靶点筛选。请点击此处下载该文件。
| 时间（分钟） | 流动相 | |
| A (v%) | B (v%) | |
| 0 | 98 | 2 |
| 1.0 | 98 | 2 |
| 14.0 | 70 | 30 |
| 25.0 | 0 | 100 |
| 28.0 | 0 | 100 |
| 28.1 | 98 | 2 |
| 30.0 | 98 | 2 |
表1：UHPLC梯度洗脱程序。 该表格列出了用于色谱分离的流动相组成及梯度条件，包括时间点以及水相（A相）和有机相（B相）溶剂的相应比例。
补充表1：益气祛疾水提物中鉴定出的化学成分。 该表格列出了通过超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）鉴定的化合物，包括原型入血成分（A1–A28），及其分类与药材来源。缩写：BHSSC = Hedyotis diffusa Willd.；CSL = Dioscorea nipponica Makino；DH = Rheum palmatum L.；JXT = Spatholobus suberectus Dunn；HQ = Astragalus membranaceus.；CQC = Plantago asiatica L.；JYH = Lonicera japonica. Thunb。化合物类别包括：A = 生物碱；Ald = 醛类；F = 黄酮类；N = 核苷类；O = 其他类；OA = 有机酸；P = 酚类；PA = 酚酸类；Phe = 苯丙素类；Q = 醌类；S = 糖类；Ste = 甾体类；T = 萜类；Tan = 鞣质类。请点击此处下载该文件。
讨论
本研究采用了一种整合策略，结合“超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱鉴定—血清药物化学分析—网络药理学预测—分子对接验证”，系统阐明益气清解方（YQQJ）治疗IgA肾病（IgAN）的潜在物质基础及作用机制。与以往研究主要依赖质谱技术分析中药复方的化学成分，随后仅通过网络药理学预测机制的方法不同16，血清药物化学遵循“复杂中药成分—入血成分—体内直接活性物质—药效物质基础”的研究路径。通过鉴定给药后进入体循环的成分，该方法被广泛认为是识别中药复方药效物质基础的有效策略。
本研究通过超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）分析，初步鉴定了薏芩清热合剂（YQQJ）中的185种化学成分，其中28种被确认为原型入血成分，从而为后续机制研究提供了可靠的化学基础。该鉴定结果的准确性依赖于保留时间、精确质量数及二级质谱碎裂信息的综合匹配14。依据血清药物化学策略，以上述原型入血成分为起点构建网络，可增强中药成分与实际体内药效之间的关联性33。通过整合化合物-疾病交集靶点，并结合基于蛋白质互作网络（PPI）的核心节点筛选，再进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，鉴定出与IgA肾病（IgAN）相关的关键信号通路15。分子对接结果表明，来源于白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd.）和穿山龙（Dioscorea nipponica Makino.）的主要入血成分可能基于预测的结合亲和力与核心靶点发生相互作用，但尚未通过实验验证其功能活性。这些结果支持以下假说：去乙酰基钩藤酸、京尼平苷酸和薯蓣皂苷可能是薏芩清热合剂潜在的关键药效物质，但仍需进一步实验验证。
从技术角度来看，样品前处理至关重要。由于血清成分复杂，且存在内源性蛋白质（如激素和酶），不可避免地会干扰对血液中吸收成分的检测。本研究采用甲醇沉淀法富集待测物并降低背景干扰，以确保质谱分析的灵敏度和准确性34。关于采血时间点，中药方剂中的不同成分可能表现出不同的吸收和体内转化规律，这会影响其在血清中的可检测性。因此，根据预试验结果，在末次给药后2 h和8 h采集血清样本，以最大程度地覆盖循环中的成分。
已发现若干操作步骤对于成功实施该工作流程尤为关键。准确的化合物鉴定在很大程度上依赖于保留时间、高分辨质谱准确度以及诊断性二级质谱碎片离子的综合评估。此外，选择合适的血清采样时间点对于捕获在给药后不同阶段进入血液循环的吸收入血成分至关重要。因此，必须仔细优化样品前处理和色谱分离条件，以确保在复杂的生物基质中可靠地检测原型化合物。
在样品制备和质谱分析过程中，可能会出现潜在的分析挑战。例如，蛋白质沉淀不完全可能导致基质效应，抑制离子化效率，而过高的背景噪声可能降低检测灵敏度。通过优化蛋白质沉淀过程中的溶剂比例、改进色谱分离条件以及调整质谱采集参数，可缓解这些问题。在数据处理过程中，若仅依赖数据库匹配，可能出现假阳性化合物注释；因此，建议手动验证MS/MS碎片模式和保留行为，以提高鉴定的可靠性。
本研究纳入了若干方法学考量。首先，未采用口服生物利用度和类药性等传统标准，而是仅使用经实验验证的入血成分进行靶点预测。该策略避免了因预设筛选阈值可能导致的活性化合物遗漏，同时剔除了体内无生物利用度的无关成分，从而增强了网络预测的生理相关性16。其次，分子对接中活性配体的选择聚焦于具有“祛风除湿、清热解毒”功效的药材（Hedyotis diffusa Willd. 和 Dioscorea nipponica Makino.）中的主要成分，由此在中医“风湿热毒犯肾”的病理概念与IgA肾病的现代病理特征之间建立了机制联系，为中药方证相关的理论提供了初步证据。第三，考虑到不同数据库在数据规模和质量方面可能存在差异，本研究整合了多个平台，以扩大靶点覆盖范围，并减少单一数据库可能引入的偏差35。
与直接将网络药理学应用于所有检测到的化学成分的传统策略相比，本工作流程强调基于实验检测到的入血成分进行循证的化合物优先排序。这种逐步筛选过程减少了进入计算分析的候选化合物数量，提高了化合物-靶点相互作用网络的可解释性。此外，与主要捕捉内源性代谢扰动的代谢组学导向研究不同，本策略聚焦于源自中药的外源性原型化合物，从而能够更直接地将药理活性归因于特定的中药成分。
从实用的方法学角度来看，该工作流程为研究复杂的中药制剂提供了多项优势。高分辨质谱（HRMS）与血清药物化学的结合能够可靠地鉴定出可被生物利用的成分，而后续的网络药理学与分子对接技术的联用则构建了一个分层分析框架，将化学证据与机制预测联系起来。此外，将网络构建限定于实验验证的化合物，可降低网络复杂性，有助于更清晰地识别核心化合物-靶点相互作用。
本研究也存在一些局限性。首先，网络药理学和分子对接是预测性的计算方法。强结合亲和力并不一定等同于体内生物学调控作用，因为分子对接未考虑蛋白质动力学、细胞环境或下游信号传导等因素。此外，目前的对接流程未使用共结晶配体进行重新对接验证，也未与已知抑制剂进行基准比较，这可能限制对接准确性的评估。未来的研究若能结合基于RMSD的验证、分子动力学模拟以及实验检测，将进一步提高这些预测结果的可靠性。目前，本课题组已完成机制验证，证明薯蓣皂苷通过JAK2/STAT3通路发挥作用，这在一定程度上增强了预测结果的可信度，并为本研究鉴定出的关键靶点提供了部分实验支持，但其他成分-靶点相互作用仍需进一步验证36。其次，当前分析未纳入中药之间比例配伍和剂量关系的影响。未来的研究可引入剂量-效应加权网络模型，以更真实地反映临床处方实践37。
综上所述，本研究建立的工作流程——基于高分辨质谱的血液吸收成分鉴定、基于网络药理学的靶点与通路聚焦分析以及分子对接验证——能够高效地从复杂中药复方中筛选出活性物质基础及其作用靶点，为后续生物学验证提供明确的实验方向，并加速中药复方作用机制的研究。未来，整合空间代谢组学、类器官模型及多组学技术，有望在更接近生理与病理状态的系统中，对当前研究结果进行动态化、三维化的验证与拓展，从而为阐释中药复方的科学内涵提供更为坚实的证据。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（项目编号：81973675）、高水平中医医院提升项目（项目编号：HLCMHPP2023039）和北京市自然科学基金（项目编号：7252259）的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AutoDock 4.2.6 | 斯克里普斯研究所 | - | |
| 色谱柱 | Waters 公司 | ACQUITY UPLC HSS T3 | |
| 高速冷冻离心机 | Hettich 实验室技术 | Mikro 220R | |
| 整合生物信息学平台 | 魏茨曼 研究所 的 科学 | - | GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/） |
| 整合生物信息学平台 | 的 约翰斯 霍普金斯 大学 学校 的 医学 | - | OMIM数据库（https://omim.org/） |
| LC-MS/4 L 乙腈 | 赛默飞世尔科技 | A955-4 | |
| LC-MS/4 L 甲醇 | 赛默飞世尔科技 | A456-4 | |
| LC-MS/4 L 水 | 赛默飞世尔科技 | W6-4 | |
| LC-MS/50 mL 甲酸 | 赛默飞世尔科技 | A117-50 | |
| 质谱数据处理软件 | Waters Corp. | - | Progenesis QI 3.0 软件 |
| 分子对接软件 | 奥尔森实验室 | AutoDock 4.2.6 | |
| PPI 平台 | STRING 数据库公司 | - | STRING 在线平台 (https://string-db.org) |
| 蛋白质数据库 | 欧洲生物信息研究所；瑞士生物信息学研究所；蛋白质信息资源 | - | UniProt 平台 (https://www.uniprot.org/) |
| 四极杆轨道阱质谱仪 | 赛默飞世尔科技 | IQLAAEGAAPFALGMAZR | |
| 参考化合物数据库 | TCM Pro 2.0，北京恒信科技有限公司 | - | |
| 旋转蒸发仪 | 上海 titan 科学有限公司 | TR-3L | |
| 结构生物学数据库 | 布鲁克海文国家实验室 | - | RCSB PDB 数据库 (https://www.rcsb.org/) |
| 结构生物学数据库 | 国家生物技术信息中心 | - | PubChem 数据库 (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) |
| 靶标预测数据库 | SIB 瑞士生物信息学研究所 | - | SwissTargetPrediction 数据库 (https://www.swisstargetprediction.ch) |
| 靶标预测数据库 | 上海 研究所 的 材料 美迪卡 | - | TCMSP数据库（https://www.tcmsp-e.com/tcmsp.php） |
| 拓扑分析插件 | - | - | Centiscape 2.2 插件；网络分析器 |
| 超高效液相色谱系统 | Vanquish Flex | - | |
| 超高效液相色谱仪 | 赛默飞世尔科技 | Vanquish Flex UHPLC | |
| 超声波提取器 | 昆山超声仪器有限公司 | KQ3200D | |
| 真空离心浓缩仪 | 宁波舜宇生物技术有限公司 | SCIENTZ-1LS | |
| 可视化软件 | - | - | Cytoscape 3.10.4 |
| 基于网络的功能注释平台 | 宽泛 研究所 | - | Metascape 在线平台 (https://metascape.org) |
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