解码表转录组： 在《硅 基中对乳腺癌m6A调控网络的洞察》

摘要

该方案提出了一种通过整合突变图谱、拷贝数改变、基因表达和临床结局，利用癌症基因组图谱（TCGA）、基因型-组织表达（GTEx）项目和微阵列平台的公开数据集，进行m6A修饰调控因子 的计算机模拟 遗传、分子和预后分析方法。

摘要

N6-甲基腺苷（m6A）是真核转录本中最丰富的内部RNA修饰，在RNA代谢、基因表达和细胞稳态中起关键作用。m6A调控因子的失调，包括“写字者”、“橡皮擦者”和“读者”，越来越多地被认为与癌症生物学有关;然而，它们在乳腺癌中的作用仍有待充分了解。本文的主要目标是为生物信息学初学者提供一个逐步框架，帮助利用公开的癌症数据集进行突变分析、评估基因表达变化，并评估其与患者存活期的关联。作为案例研究，利用癌症基因组图谱（TCGA）、基因型-组织表达（GTEx）项目和微阵列平台的数据集分析了乳腺癌中的m6A调控因子。系统分析了转录组图谱，以展示评估m6A调控成分在乳腺癌预后相关性的工作流程。利用该分析框架，发现关键m6A调控因子之间遗传变异和表达差异的显著模式。包括METTL14、CBLL1、YTHDC1、HNRNPC、HNRNPA2B1和RBMX在内的多种调控因子与较佳患者生存率相关，而YWHAG则与较差的总体生存率相关。本研究提供了乳腺癌中m6A调控基因的全面系统基因组学概述，同时展示了一种实用且可重复的基于网络的生物信息学工作流程。这些发现推动了对乳腺癌表观转录调控的理解，并为基于m6A的新型诊断和治疗策略的发展奠定了基础。

引言

表转录组修饰是转录后基因调控的重要一层，并对多种细胞过程和疾病状态有贡献。在迄今为止识别的170多种RNA修饰中，N6-甲基腺苷（m6A）是真核mRNA中最普遍且最为充分的^1。m6A由包括METTL3/METTL14在内的“写入”复合物安装，通过FTO和ALKBH5等“橡皮擦”去除，并由包括YTH和IGF2BP家族成员的“读读”蛋白解读，协调RNA的剪接、稳定性、运输和翻译，从而影响发育、分化和应^激反应等关键生物过程^2,3。

m6A调控成分在广泛恶性肿瘤中均有报告。在许多癌症中，异常的m6A活性驱动恶性表型;例如，METTL3表达升高通过调节刺猬通路和MYC RNA甲基化促进前列腺癌的起始和进展^5,6。最初被发现与急性骨髓性白血病的致癌效应有关，FTO被证明能驱动肝癌、肺癌和结直肠癌的肿瘤进展（7,8,9,10）。然而，FTO和ALKBH5的情境依赖性作用被发现，表明m6A介导调控的双重特性，可以促进致癌性和肿瘤抑制信号传导（^11,12,13,14）。M6A读读器，包括YTHDF1/2/3、异质核核糖核蛋白（hnRNPs）和胰岛素样生长因子-2 mRNA结合蛋白（IGF2BP1-3），也被发现与致癌相关 15,16,17。

在乳腺癌中，越来越多的证据表明m6A调控因子常常失调，可能与肿瘤亚型、免疫相关特征及临床结局相关（^18,19）。多项机制研究将METTL3定位为乳腺癌中常被上调的促致癌因子。METTL3介导的m6A安装可以稳定或增强促进增殖、上皮间充质转变（EMT）、转移和^化疗耐药的转录本的翻译。METTL3还被证明通过靶向Bcl-2促进乳腺癌^进展。ALKBH5被认为通过NANOG及其他与干相关的分子调控癌症干细胞，但其影响可能因肿瘤环境而异²²。

随着近年来m6A监管因子名单的不断扩大，亟需更新新识别的监管因子在乳腺癌中可能的失调机制。表1列出了m6A调节器，包括写入器、读者和擦除器，适用于m6A修改。此外，包括LRPPRC和YWHAG在内的新型m6A调控因子已被鉴定与癌症进展有相关影响 23,24,25。因此，研究人员利用有限生物信息学背景的研究人员，对所有已知m6A调控因子进行了全面的遗传和分子表征。

本文旨在提出基于平台的逐步生物信息学方案，利用公开的癌症基因组学资源分析乳腺癌中的m6A调控因子。利用癌症基因组图谱（TCGA）（www.cancer.gov/tcga）、基因型组织表达（GTEx）项目²⁶以及基于网络的分析平台如cBioPortal和UCSC Xena的数据集，该方案展示了评估突变谱、基因表达变化及患者存活相关性的可重复工作流程。这种可视化且易于理解的方法旨在促进癌症生物信息学新手采用表观转录组数据分析。

方案

注意：编码m6A甲基化调控基因的列表，分为写入基因、读取基因和橡皮擦基因，见 表1。所有列出的基因均纳入后续突变、表达模式和总体生存分析。本研究中使用的所有软件和工具均列于 材料表中。

1. m6A调控因子遗传变异的鉴定

1. 访问cBioPortal获取癌症基因组学。访问cBioportal网站（www.cbioportal.org）^27,28。在主页中，选择“查询”标签开始新的分析。
2. 选择合适的癌症研究和队列。
3. 在“选择可视化与分析研究”搜索栏中，输入“乳腺浸润性癌”，并选择“乳腺浸润性癌（TCGA，泛癌图谱）”。
4. 在底部选择“按基因查询”。
   关键：确保所选队列（996个样本）包含突变和拷贝数改变（CNA）数据。
5. 定义遗传查询。在“输入基因”栏中， 输入HUGO基因符号，代表所有正在研究的m6A调控因子完整列表。
   注意：基因可以以空格分隔的列表形式输入。在“选择基因组档案”中，确保勾选了以下两种数据类型：突变和拷贝数改变。
6. 在“选择患者/病例集”中，选择对应所有病例档案的队列的默认样本集。
7. 点击蓝色的“提交查询”按钮。
8. 检索并解释基因改造数据。提交后，结果会加载到“摘要”标签页。中央的“OncoPrint”可视化提供了队列中所有被查询基因的基因变异的即时概览，可下载。
9. 在OncoPrint旁，找到“癌症类型摘要”图。这对乳腺癌亚型的变异进行了定量分析。
10. 进行泛癌分析。返回cBioPortal主页，在“查询”标签下选择“TCGA PanCancer Atlas Studies”。
11. 在基因输入框中输入相同的m6A调控基因列表。
12. 点击“提交查询” ，在结果页面导航到“癌症类型摘要”标签。这提供了泛癌症视角。

2. 使用UCSC Xena对m6A调控因子进行比较转录组分析。

1. 访问UCSC Xena平台。访问UCSC Xena官网（https://xena.ucsc.edu）²⁹。
2. 在主页中，点击“启动Xena”按钮进入主分析浏览器。
3. 在Xena浏览器中，点击“数据集”。
4. 在数据集中，选择“TCGA TARGET GTEx”。该报告包含来自TCGA和GTEx项目正常组织的均等处理RNA-Seq数据。
5. 在下一页，点击“可视化”。
6. 定义表型（样本组）变量。在“选择你的第一个变量”中，选择表型数据类型中的“主类别”。
7. 点击“TO SECOND VARIABLE”。然后，在基因组数据类型中勾选数据集中的“基因表达”。在“添加基因或位置”框中添加基因列表。点击“完成”。
8. 用热力图可视化表情模式。
9. 要将乳腺（TCGA+GTEx）样本与TCGA TARGET GTEx分离，输入“Breast”并使用滤镜选项保留样本。
10. 热力图现已可见，并可下载为PDF格式。
11. 为单个基因生成比较箱形图。要量化和可视化特定基因的表达差异，可以使用“视图为图表”。使用此选项，数据可视为箱形图、点阵图和小提琴图，比较两组样本组的表达式分布。
12. 使用“作为PDF下载”选项来下载图表。
13. 统计显著性（p值）可通过点击“统计数据”获得。

3. 使用Kaplan-Meier绘图仪评估m6A调控因子的预后意义。

1. 访问Kaplan-Meier绘图工具。请访问Kaplan-Meier绘图官网站（https://kmplot.com/analysis）³⁰。
2. 在主页中，选择“乳腺癌”标签，启动针对乳腺癌数据集的分析。
3. 配置单个基因的基因查询。
4. 在主输入部分，找到“基因符号”框。
5. 输入被分析的m6A调控基因的官方符号（例如，METTL3）。
   关键：在基因输入框正下方，找到并启用“仅JetSet最佳探针组”的复选框。这确保自动选择最可靠、最特异的微阵列探针，优化数据质量和重复性。
6. 定义生存分析参数。在“生存”部分，选择“总体生存（OS）” 作为本分析的主要终点。当选择此设置时，该工具将自动使用1880名乳腺癌患者的数据。
7. 确保“按患者分开”选项设置为“中位数”。这将将患者分成两个相等的组别;高表达和低表达，基于所查询基因在所有样本中的中位表达值。
8. “随访阈值” 可用于选择随访周期。本研究选定了180个月。
9. 生成并解释Kaplan-Meier图。
10. 点击“绘制卡普兰-迈尔图”按钮。
11. 会加载一个新窗口，显示生存曲线。
12. 解读关键情节;X轴表示以月份为单位的时间，Y轴表示总体生存概率，两条彩色线代表高表达（红色）和低表达（黑色）患者组的生存曲线。显示对数秩P值，显示两条生存曲线差异的统计显著性。

结果

乳腺癌中m6a甲基化调控因子的突变景观

在早期对TCGA数据集进行基因组分析的研究中，报告了编码DNA甲基化调控因子的多个基因的反复突变，³¹。本研究利用cBioPortal分析“乳腺浸润性癌（TCGA，PanCancer Atlas）”数据集，以分析编码m6A RNA甲基化写入者、读者和擦除者基因的突变谱。该分析揭示了乳腺癌患者中存在多样的基因变异，基因间变异频率差异显著——CNBP和RBM15B的0.4%到VIRMA的12%不等（见图1A）。基因扩增是最常见的变异，其他事件还包括深度缺失、碱基替换和多次同时发生的变异。值得注意的是，调控m6A相关功能的基因在476例患者中（占队列的48%）中被检测到变化（见图1B），强调了m6A修饰动态在乳腺癌中的显著性。尽管不同类型的变异频率有所不同，但所有乳腺癌分子亚型均观察到此类突变（见图1C

讨论

该方法的文章提供了一个全面、易用且集成的工作流程，用于系统性多组学分析和癌症研究中任何基因签名的临床翻译，本文通过分析乳腺癌中的m6A RNA甲基化调控因子进行了展示。通过结合这些主要的公共生物信息学平台，这种方法使研究人员能够高效地从基因组发现到临床相关假设，而无需高级计算专业知识。

该方法的主要优势在于其模块化的假设生成流程。该协议引导用户按逻辑顺序进行;首先识别哪些基因被基因改造（使用cBioPortal），然后在批次校正环境中评估表达失调（使用UCSC Xena），最后评估该失调对患者生存的临床影响（使用Kaplan-Meier绘图仪）。这种从DNA到RNA再到临床结果的逐步分析，有效地优先选择候选基因进行进一步研究。例如，将此工作流程应用于m6A调控因子，能够高效地将像YWHAG（频繁变异、预测性较差的存活率）这样的基因定位为功能验证的高优先级目标。

该方案设计的泛癌分析进一步提升了其实用性，使研究人员能够快速判断分子特征是特定于某一癌症，还是肿瘤发...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
cBioPortal	纪念斯隆-凯特琳癌症中心	https://www.cbioportal.org
基因型-组织表达（GTEx）	GTEx联盟	https://gtexportal.org
Kaplan-Meier绘图器	Gyorffy实验室/A5遗传学有限公司	https://kmplot.com
癌症基因组图谱（TCGA）	国家癌症研究所（NCI）	https://www.cancer.gov/tcga
UCSC Xena浏览器	加州大学圣克鲁兹分校	https://xenabrowser.net