探究固本平喘颗粒治疗支气管哮喘的作用机制

摘要

本方案通过网络药理学、分子对接和体内验证，研究固本平喘颗粒在支气管哮喘中的作用机制。

摘要

本研究采用网络药理学、分子对接及实验验证方法，探讨固本平喘颗粒治疗支气管哮喘的作用机制。通过TCMSP、HERB和SymMap数据库筛选固本平喘颗粒的活性成分及其对应靶点；从GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank和PharmGKB数据库获取支气管哮喘相关靶点。识别交集靶点，并构建成分-靶点及蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。采用错误发现率（FDR）校正法进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。随后进行分子对接，以评估成分与靶点之间的结合亲和力，并开展实验验证 体内 验证。共鉴定出121种活性成分和234个药物相关靶点，得到155个交集靶点。核心靶点包括 TP53, AKT1, TNF，以及 IL6 KEGG 分析显示 PI3K–Akt 信号通路显著富集，被选为实验验证的目标。分子对接结果表明核心成分与靶点之间具有较强的结合亲和力 AKT1 在卵清蛋白诱导的哮喘大鼠中，固本平喘颗粒降低了血清 IL-4 和 IL-10 水平，升高 FoxP3 在肺组织中的表达，并上调 PI3K 和 AKT mRNA 水平。这些发现表明，固本平喘颗粒通过调控 PI3K–Akt 信号通路，调控炎症性细胞因子，增强调节性T细胞功能。

引言

支气管哮喘是一种异质性的慢性呼吸系统疾病，其特征是气道炎症、气道高反应性、黏液过度分泌以及气道重塑¹。哮喘的发病机制涉及免疫细胞活化、炎症介质以及多种信号通路之间的复杂相互作用。临床上，哮喘表现为反复发作的喘息、呼吸困难、胸闷和咳嗽。气道炎症是疾病发生和发展的核心机制，其特点包括促炎性细胞因子（如 IL-6, IL-4, IL-17 和 TNF-α）分泌增加，嗜酸性粒细胞和中性粒细胞等炎症细胞浸润，以及气道平滑肌增生、基底膜增厚和黏液腺增生等结构改变^2˒3。这些病理过程最终导致气道阻塞和通气功能受损。

哮喘的病理生理学受多种相互作用的信号通路调控，而非单一机制。其中，PI3K–Akt 信号通路通过调控 FoxP3 的表达，在调节免疫平衡特别是Treg/Th17轴中发挥关键作用。该通路还与 IL-17 和 TNF 信号通路相互作用，增强炎症反应和气道重塑，从而导致疾病的异质性和治疗抵抗^3,4。流行病学数据显示，全球哮喘患病率持续上升，全球患者超过3.58亿，中国成人患者约4570万^5,6。目前的治疗策略主要依赖吸入性β₂-受体激动剂和糖皮质激素；然而，这些疗法仅针对有限的病理机制，可能在部分患者中引起不良反应和糖皮质激素抵抗。PI3K–Akt等通路的失调与治疗反应降低相关，凸显了多靶点治疗策略的必要性^7,4。

中医将哮喘归类为“哮证”，认为其与肺、脾、肾功能失调有关，并受外邪诱发。由于中药方剂具有多成分、多靶点的特点，已被广泛应用于哮喘的治疗^8,9。与单一靶点的药物不同，中药通过协同调节多条生物通路发挥治疗作用，更契合哮喘复杂的病理生理机制¹⁰。网络药理学提供了一种系统层面的研究方法，可用于分析药物成分、作用靶点与疾病通路之间的相互作用，有助于识别关键的生物活性成分及其分子机制¹¹。分子对接技术则可进一步评估小分子与靶标蛋白之间的结合亲和力，从而补充和完善上述研究方法。

固本平喘颗粒是一种由八种草药成分组成的中药复方制剂，包括麻黄（Ephedra sinica，麻黄草）、补骨脂果实（Psoralea corylifolia）、苦杏仁（Prunus armeniaca 种子）、太子参根（Pseudostellaria heterophylla）、紫苏子果实（Perilla frutescens）、枇杷叶（Eriobotrya japonica 叶）、百合鳞茎（Lilium brownii）以及淫羊藿（Epimedium brevicornum）。该方剂传统上用于补益正气、化痰止咳、平喘。既往临床研究已证实其在支气管哮喘治疗中具有显著疗效，相较于常规治疗具有更高的应答率¹²。

为了阐明其潜在的作用机制，采用了一种整合网络药理学、分子对接和体内实验验证的综合方法。利用网络药理学鉴定与支气管哮喘相关的活性成分及潜在靶点；通过分子对接评估关键化合物与靶蛋白之间的相互作用；随后在动物模型中开展实验验证，以评估其对关键信号通路（特别是PI3K–Akt通路）的调控作用。该策略旨在揭示固本平喘颗粒多靶点治疗效应的作用机制，并为其在支气管哮喘治疗中的应用提供科学依据。

方案

所有动物实验均经辽宁中医药大学动物伦理委员会批准（批准号：21000042023058），并依照机构实验动物使用指南进行。本实验方案所用的研究工具列于材料表中。

1. 数据库与软件

1. 访问以下数据库和软件：TCMSP、HERB、SymMap、PubChem、STRING、GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank、PharmGKB、DAVID、UniProt 和 Cytoscape（版本 3.9.1）。

2. 组分靶点的获取

1. 从 TCMSP 数据库¹³中获取麻黄、杏仁、太子参、紫苏子、枇杷叶、百合属植物及淫羊藿的化学成分。从 HERB 和 SymMap 数据库中获取补骨脂的化合物。
2. 采用口服生物利用度（OB ≥ 30%）和类药性（DL ≥ 0.18）筛选活性化合物^14,15。
3. 利用 TCMSP 预测靶基因。通过 UniProt 数据库选择智人（Homo sapiens）对所有靶点进行标准化。剔除重复及无效靶点，包括非人类条目、未注释的蛋白质以及已废弃的标识符。

3. 支气管哮喘靶点的获取

1. 使用关键词“支气管哮喘”在 GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank 和 PharmGKB 中进行检索。将 GeneCards 相关性评分设置为 >4。合并所有检索到的靶点并去除重复项。

4. 交集靶点的鉴定

1. 将药物靶点和疾病靶点导入在线Venn分析工具。识别重叠的靶点，并记录总数以供后续分析。

5. 组分-靶点网络的构建

1. 将交集靶点导入 Cytoscape 3.9.1，构建成分-靶点网络。根据度值调整节点的大小和颜色。

6. 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建

1. 将交集靶点上传至 STRING 数据库。选择 Homo sapiens，并将置信度评分设置为 ≥0.900。导出网络并将其导入 Cytoscape。
2. 计算拓扑参数（度中心性、介数中心性和接近中心性）。使用中位数阈值并结合度 >20 来鉴定核心靶点。

7. GO 与 KEGG 富集分析

1. 将重叠的靶标上传至 DAVID 数据库，或使用 R 软件包 clusterProfiler 进行分析。
2. 对生物过程、细胞组分和分子功能类别进行基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析。
3. 进行 KEGG 通路富集分析。采用错误发现率（false discovery rate, FDR）校正，并将显著性阈值设定为 FDR < 0.05。
4. 使用柱状图或气泡图可视化最显著富集的条目。

8. 分子对接

1. 从 PubChem 下载核心化合物的二维结构。使用 ChemOffice 生成三维结构，并保存为 mol2 文件。
2. 从 RCSB PDB 数据库下载蛋白质结构。使用 PyMOL 去除水分子和配体。
3. 使用 AutoDock Vina 进行分子对接。定义网格盒参数并运行对接模拟。
4. 记录结合能（kcal/mol）和关键相互作用残基。利用分子建模、可视化和模拟平台展示对接结果。

9. 实验验证

1. 动物
   1. 获取48只雄性Sprague–Dawley大鼠（9周龄，220–240 g）。在标准条件下，将动物饲养于20–25 °C、相对湿度55%–60%的环境中。
2. 药物与试剂
   1. 制备由麻黄、补骨脂、杏仁、太子参、紫苏子、枇杷叶、百合和淫羊藿组成的固本平喘颗粒。
   2. 按照材料表中的列表准备地塞米松、卵清蛋白（OVA）、氢氧化铝、ELISA试剂盒、RNA提取试剂盒和抗体。
3. 仪器
   1. 准备标准实验室设备，包括酶标仪、电泳系统、石蜡切片机和成像系统。
4. 动物分组与处理
   1. 将大鼠随机分为六组（n = 8）：空白对照组、模型组、地塞米松组（0.3 mg/kg）、低剂量中药组、中剂量中药组和高剂量中药组。
   2. 在第1、7、14天，对模型组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组及地塞米松组大鼠分别腹腔注射1 mL 10% OVA + 10% Al(OH)₃，进行致敏处理。
   3. 向空白对照组大鼠于第1、7、14天分别腹腔注射0.9%生理盐水1 mL。
   4. 从第15天到第21天，每天进行一次20分钟的雾化吸入刺激。对模型组、低剂量中药组、中剂量中药组、高剂量中药组及地塞米松组大鼠给予5%卵清蛋白（OVA）雾化吸入。
   5. 从第15天至第21天，对空白对照组大鼠进行0.9%生理盐水雾化吸入给药。
   6. 根据分配的治疗组，从第22天至第36天每日通过口服灌胃给予治疗。
   7. 每天监测动物体重和一般状况。实验时间线总结如下： 表1.
5. 组织病理学
   1. 收集肺组织。固定、包埋并切片样本。进行苏木精-伊红染色。
   2. 采用马松染色法评估胶原沉积。
6. RT-PCR分析
   1. 从肺组织中提取总RNA。
   2. 在超低温条件下匀浆冷冻肺组织。称重样品后，迅速转移至含有液氮的预冷研钵中，研磨成粉末。
   3. 将粉末样品转移至离心管中。每50–100 mg组织加入1 mL TransZol UP和0.2 mL RNA提取试剂。室温下振荡试管5分钟。
   4. 将样品在1000 × g下离心 × g 2–8 °C 下孵育 15 分钟。将无色水相转移至新的离心管中。
   5. 加入1 mL TransZol UP至0.5 mL异丙醇中，室温孵育10分钟。
   6. 以 1000 × g 离心样品 g 10分钟。加入1 mL 75%乙醇，再离心5分钟。
   7. 弃去上清液，将沉淀物在室温下晾干5分钟。用50–100 µL RNA溶液溶解沉淀物，然后孵育10分钟。
   8. 将样品于 −70 °C 保存以实现长期储存。
   9. 合成cDNA并进行定量PCR以检测PI3K和AKT的表达水平。
7. 酶联免疫吸附测定
   1. 在 4 °C 下解冻血清样本。测量 IL-4 和 IL-10 使用ELISA试剂盒，按照制造商说明书检测水平。
8. 免疫组织化学
   1. 用4%多聚甲醛固定肺组织，经石蜡包埋、切片、脱蜡和水化处理。
   2. 进行抗原修复、封闭和抗体孵育。按照FoxP3免疫组化试剂盒说明书使用DAB染色液进行染色，阳性表达呈棕黄色或棕褐色。
   3. 在显微镜下观察并拍照，使用Image J软件对FoxP3表达进行定量统计分析。
9. 统计分析
   1. 使用Shapiro–Wilk检验测试数据正态性，使用Levene检验测试方差齐性。
   2. 使用单向方差分析（one-way ANOVA）或适当的非参数检验进行数据分析。数据以均值 ± 标准差表示。
   3. 定义 p < 0.05 作为具有统计学意义的阈值。★★p < 0.01 和 ★p < 0.05 与 对照组；◆◆p < 0.01 和 ◆p < 0.05 与模型组相比；##p < 0.01 和 #p < 0.05 对地塞米松组。

表1：实验时间表。 致敏、激发和处理程序的时间安排。请点击此处下载该表格。

结果

活性成分筛选
共从TCMSP数据库中筛选出121个具有靶标活性的活性成分，其中包括来自 麻黄属 Herb，7 来自 补骨脂，19 来自杏仁，8 来自 假繁缕 迷迭香根，16 来自紫苏籽，18 来自枇杷叶，7 来自 百合属，以及23个来自 淫羊藿 (表2）。共鉴定出16种常见成分，包括木犀草素、槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇和(+)-儿茶素。经标准化后共获得234个药物相关靶点。此外，共鉴定出1,059个哮喘相关靶点，其中药物与疾病共有155个交集靶点图1).

表2：固本平喘颗粒的活性成分。 筛选化合物及其相关的药代动力学参数列表。请点击此处下载该表格。

讨论

支气管哮喘是呼吸科常见疾病¹⁶。它是一种由过敏原和气道高反应性引起的阻塞性气道疾病¹⁷。该病临床发病率高，易复发，难以治愈，显著影响患者的健康和生活质量。2025年全球哮喘防治倡议（GINA）报告指出，吸入性糖皮质激素治疗哮喘有效¹⁸；然而，长期使用可能导致依从性差。部分患者在减量或停药后出现复发，还可能发生下丘脑-垂体-肾上腺轴抑制，导致部分糖皮质激素反应性降低¹⁹。

近年来，中医在哮喘治疗方面受到广泛关注。在中医理论中，哮喘属于“哮证”范畴，其发病机制涉及风邪亢盛、体质虚弱、气机逆乱及痰浊阻滞等方面。其中，风邪亢盛对应诱发哮喘急性发作的过敏原或呼吸道感染等外在因素；而痰浊阻滞则被视为内在病因²⁰。哮喘之痰多为伏痰，发作时咳痰较少²¹。痰浊久伏于肺络，可引发气道痉挛，导致咳嗽和喘息。支气管哮喘的发...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
qPCR试剂盒	Novogene	NQ-001, 2×1mL	检测目的基因mRNA的相对表达水平
氢氧化铝 Al(OH)3	上海佑博生物科技有限公司	YB-AL001, 500g	免疫佐剂，用于增强抗原的免疫应答
BCA蛋白浓度检测试剂盒	孚德生物科技有限公司	FD2001, 每盒100片	总蛋白定量，用于标准化上样量
化学发光成像系统	Tanon	5200Multi	WB条带成像、凝胶及印迹图像的采集与分析
彩色预染蛋白Marker	百奥莱博科技有限公司	BL005, 10-180kDa, 500μL	电泳实验中蛋白质分子量参照标准
增强型RNA提取试剂盒	全式金生物	ET111-01v2, 每盒50个	从组织和细胞中提取并纯化总RNA
酶联免疫吸附测定仪	美国Biotek公司	Epoch/BioTek	样本中细胞因子及蛋白质含量的定量检测
FOXP3一抗	碧云天生物科技有限公司	AG5002, 50ul/支	特异性结合FOXP3蛋白，用于免疫检测
凝胶快速制备试剂盒	上海雅美	PG212, 30套	快速制备电泳用分离胶和浓缩胶
Masson染色试剂盒	索莱宝生物科技有限公司	G1340, 100片	组织胶原纤维特异性染色及纤维化观察
OVA	北京博奥拓达科技有限公司	OVA-10g, ≥98%	建立过敏动物模型的经典过敏原
一抗稀释液	碧云天生物科技有限公司	P0256-100ml	稀释一抗，维持抗体活性并减少非特异性结合
大鼠IL-10 ELISA试剂盒	Andy Bio	E-30649, 96T	大鼠抗炎因子IL-10的定量检测
大鼠IL-4 ELISA试剂盒	Andy Bio	E-30623, 96T	大鼠Th2型炎症因子IL-4的定量检测
逆转录试剂盒	宝日医生物技术有限公司	E047-01A	将RNA逆转录为cDNA，用于后续基因分析
饱和油红O染色试剂盒	索莱宝生物科技有限公司	G1261, 50mL×2瓶	组织脂滴的特异性染色与检测
上样抗兔二抗	Proteintech生物有限公司	SA00001-2, 1mL	结合兔源一抗，用于WB显色反应
TBST缓冲液	武汉赛维尔生物科技有限公司	G2150, 1L/瓶	Western blot中膜的洗涤及抗体稀释用缓冲液
转印电泳系统	上海金灿石精密机械有限公司	PowerPac Basic	用于蛋白质电泳及Western blot转膜
超低温冰箱	中科美菱	MDF-382	试剂、蛋白样品及组织的低温冷冻保存
垂直电泳槽	BIO-RAD	JY-ZY5	蛋白质和核酸样品的垂直电泳分离