一种基于毒素的反选择系统，用于无标记基因缺失和高密度Tn5转座子诱突变，适用于 巴西果杆菌

摘要

本文介绍了一种方法，用于在巴西 果杆菌（Pectobacterium brasiliense）中生成未标记基因缺失并构建全基因组的Tn5插入突变文库，该植物病原体负责马铃薯黑腿病和软腐病。这种方法能够高效地进行逆向遗传分析，并有助于对该生物体中与毒力相关的基因进行功能性表征。

摘要

巴西果杆菌是一种高度致病的细菌，负责马铃薯块茎软腐病、黑脚病和空气茎腐病。阐明其致病机制对于疾病控制至关重要;然而，该生物的遗传工具仍然有限。开发了一种基于毒素的反选择系统，以实现无标记基因缺失和高密度Tn5转座子诱变。从pLP12质粒衍生的vmi480毒素被用作反选择标记，构建自杀载体pKV2。利用该系统，P. brasiliense SM菌株中的recA基因成功被删除。由此产生的recA突变体作为亲本株，通过与携带pKV2-LLtnp的RHO3辅助株结合，构建包含超过12,000个突变体的Tn5插入文库。在该衍生质粒中，vmi480毒素被高活性的Tn5转座酶替代，受外向的lac启动子控制，以减少极性效应。高通量块茎接种检测使得识别出致病性缺失突变体，包括II型分泌系统中的插入物，该系统是介导植物细胞壁降解酶分泌的关键毒力决定因子。该平台支持功能基因组学，并促进对这一经济重要病原体毒力机制的研究。

引言

巴西螺旋桨菌是Pectobacterium属中最具侵略性的物种之一，是马铃薯软腐病、黑腿病和气生茎腐病的致病^因子1。这些疾病导致土豆估计产量损失30%，土豆是世界第三大粮食来源，也是中国农业^{生产体系的关键}组成部分。尽管具有经济影响，控制巴西氏菌致病性的分子机制仍不充分，主要原因是该物种缺乏高效且可重复的遗传操作工具 ^3,4,5。

许多植物病原细菌的功能基因组研究依赖于强健的等位基因交换和转座子诱变系统;然而，针对 巴西氏菌 的类似遗传工具仍然有限或效率低下。特别是，与该物种兼容的有效反选择标记物较为稀少。虽然 sacB 基因被广泛用作多种细菌基因缺失的反选择标记，但 巴西葡萄园菌 在^{选择过程中可}表现出高达50%蔗糖的高耐受性5。这种耐受性很可能反映了对毒素的敏感性不足，可能是由于蔗糖通过酶转化为糖聚合物。此外，高蔗糖浓度可能诱发有害的渗透休克^6。此外，高效的大规模诱变方法，如Tn5转座子插入文库构建，尚未充分建立在该生物体上。

为解决这些技术限制，开发了基于毒素的反选择系统，并为 巴西猪皮孔建立了稳健的Tn5诱变筛查流程。与传统的蔗糖方法相比，这种基于毒素的方法具有明显优势，包括增强选择严谨性、提高双重交叉事件识别特异性，以及消除混杂渗透应激。类似的vmi480毒素-抗毒素系统已成功应用于弧 菌 物种⁷的选择障碍。该方法论高度适用于未知基因的高通量功能表征，并提供了一个多功能平台，可适应其他相关的软腐菌 科。

方案

1. 在巴西葡萄园中生成无标记recA缺失突变体

1. 利用标准DNA制备程序从大肠杆菌供体株提取巴西葡萄菌SM和pKV2质粒（pLP12，经抗生素选择标记和多重克隆位点修改后获得）的基因组DNA。
2. 通过琼脂糖凝胶电泳和纳米滴光谱光度法验证提取的基因组DNA和质粒DNA的质量和浓度。
3. 通过与 EcoRI和 NheI在37°C下双重消化5小时，线性化pKV2质粒。通过琼脂糖凝胶电泳确认完全消化，并纯化线性质粒。
4. 使用基因组分析软件识别 recA 基因上下游约800个碱基对，并设计相应的引物对LBF/LBR和RBF/RBR（参见本研究所有引物材料 表 ）。
5. 在标准PCR循环条件下扩增两个同源臂，并纯化PCR产物。50微升PCR通常产出2.5微克产物。
   注意： 引物的Tm值和GC含量可以通过修改同源区边界来调整。
6. 利用DNA组装套件组装重组自杀质粒pKV2-recA，将纯化的同源臂与线性质粒主链连接。
7. 通过热休克将组装混合物转化为化学能力强的大 肠杆菌 S17-1 λpir细胞，回收LB培养基，并镀板至含有卡那霉素（LB + kan）的LB琼脂上。
   注意： 最终使用的浓度为50 mg/mL卡那霉素、0.2%葡萄糖、0.3%（w/v）阿拉伯糖和0.3 mM 2,6-二氨基甲酸（DAP）。
8. 通过限制性消化或菌落PCR验证阳性克隆。（参见 本 研究中使用的所有中等配方材料表）。
9. 提取已确认的pKV2-recA质粒，并利用热休克转化将其转化为大 肠杆菌 WM3064（预期转化率>10⁶ cfu/μg）。
10. 选择LB琼脂上含有卡那霉素和二氨基甲酸（DAP）的转化物。
11. 通过将供体株（WM3064 pKV2-recA）与受体巴西氏菌株（P . brasiliense SM）的隔夜培养液以1：1（v/v）比例混合，进行双亲结合，通常每毫升供体和受体细胞得到10⁴ 至10⁶ 个转结合体。
12. 用无菌水清洗混合培养液一次，将混合物置于LB琼脂上，补充卡那霉素和DAP，并在28°C下培养48–72小时。
    注意： 如果未观察到转结合体，供体与受体的比例可提高至2：1（v/v），以提高结合效率。如果观察到高背景生长，可以通过用无菌水清洗混合培养物两次去除残留的DAP。
13. 将结合混合物回收，并板化在含有卡那霉素和葡萄糖（无DAP）的LB琼脂上进行反选择。
14. 挑选6到8个菌落，复制板化在LB+kan和LB+kan+阿拉伯糖上。
15. 选择在LB + kan上生长但LB + kan + 阿拉伯糖上无法生长的菌落;这些都是首次跨界的候选作品。
16. 将确认的首次交叉株接种到LB培养基中，并过夜孵育。将培养物置于含有L-阿拉伯糖的LB琼脂上，诱导第二次同源重组。
17. 挑选几个菌落，复制它们到LB + 阿拉伯糖和LB + kan上。选择生长在LB + 阿拉伯糖上但不生长于LB + kan的菌落;这些是推测中的 recA 缺失突变体。
    注意： 如果第二次交叉事件后未观察到菌落，则应评估目标基因对细菌生长的潜在必要性。或者，上游和下游同源区可扩展至1200碱基对，以提高同源重组效率。
18. 通过引物对 checkF/checkR 通过集落 PCR 确认 recA 突变体，该序列设计用于扩增 recA 启动子和终端区域，以验证目标基因的帧内缺失。测序PCR产物以确认 recA的精确帧内缺失。
19. 成功缺失的表现为PCR产物体积的减少，这应对应野生型片段长度减去缺失基因片段的具体长度。

2. 构建用于P. brasiliense中Tn5诱变的pKV2-LLtnp。

1. 使用引物对Tnp-F/Tnp-R扩增pMCS2-LLtnp⁸ 的Tnp转座酶盒，使用引物对ori-F/ori-R扩增pKV2的oriγR6K Tn5骨架。使用DNA纯化套件对所有PCR产物进行纯化。
2. 使用DNA组装套件组装纯化后的Tnp盒和oriγR6K Tn5骨架。通过热休克将组装混合物转化为化学性能强的大 肠杆菌 S17-1 λpir细胞，在LB培养基中回收，并结合加卡那霉素（LB + kan）的LB琼脂板。
3. 利用引物对ori-F/ori-R和Tnp-F/Tnp-R通过菌落PCR验证阳性克隆。
4. 通过将单个菌落接种到LB培养基中并过夜培养，制备具大 肠 杆菌活性的RHO3细胞。将培养物稀释为1：100，进入新鲜的LB培养基，生长至OD₆₀₀ 为0.6。
5. 将培养物放入冰上冷却，并用预冷却的0.1 M CaCl₂清洗细胞三次。将最终沉淀重新悬浮在500微升预冷的20%甘油中，储存在−80°C。
6. 通过热休克将10 μL经过验证的重组质粒（pKV2-LLtnp）转化为100 μL的符合 RHO3 功能细胞的细胞（预期转化率>10⁶ cfu/μg）。在冰上孵化30分钟，42°C时热休克45秒，然后在冰上冷却2分钟。
7. 加入500微升培养基，在37°C下培养1小时并搅拌。将蛋白板置于含有卡那霉素和DAP（LB + kan + DAP）的LB琼脂上，并在37°C下过夜孵育。
8. 通过Tnp-F/Tnp-R进行菌落PCR验证阳性RHO3转化物。

3. P. brasiliense 中 Tn5 转座子突变体库的构建

1. 在28°C的LB培养基中培养 P. brasiliense ΔrecA ，并在37°C下用LB培养基中添加卡那霉素和DAP（LB + kan + DAP）培养RHO3/pKV2-LLtnp。 让两个菌株都达到OD₆₀₀ /1。
2. 将100微升巴西氏菌ΔrecA与100微升RHO3/pKV2-LLtnp混合，离心后丢弃上清液，并将洗净沉淀重新悬浮于10微升磅培养基中。
3. 将再悬浮混合物放置于LB琼脂平板上，补充DAP，并在28°C下孵育8小时以促进接联。
4. 用1毫升无菌LB培养基冲洗板面，恢复共轭混合物。短暂离心，丢弃上清液，并用LB培养基洗涤沉淀液两次以去除DAP。
5. 将洗净沉淀重新悬浮于300微升LB培养基中，将10倍序列稀释液置于LB琼脂上，补充卡纳霉素和葡萄糖（LB + kan + glucose，不含DAP），以选择转接结合物。
6. 在28°C下孵育板48小时。选取五个菌落，并使用引物对ori-F/ori-R和Tnp-F/Tnp-R通过菌落PCR验证每个菌落，以确认Tn5转座子的成功引入。对所有五个菌落进行测序，以验证Tn5插入基因组的存在。
   注意： 在变异体库正式建成之前，从共轭板中随机选出六个单一菌落。进行了质粒救援检测以确定插入位点，分别使用两种不同的限制性内切酶作为两个平行对照组。共获得36次测序读段。只有当每个菌落的六个插入位点完全相同时，才验证了单次Tn5插入事件。
7. 通过重复共轭步骤并计数殖民地数量来估算突变体库容量。确保总文库规模超过12,000个菌落，以实现下游筛查所需的基因组覆盖。
   注意： 如果观察到诱变频率较低，应考虑使用高活性的Tn5转座酶变体，如E54K/M56A/L372P突变体，以提高转位效率。
8. 将第6步获得的单个突变菌落转移到每孔含有200 μL LB + kan的96孔板中。将板子在28°C下孵育一夜，振动200转/分钟。
9. 每孔加入133微升无菌50%甘油，最终浓度约为20%。将96孔板密封并储存在−80°C下，以便长期保存。

4. 通过马铃薯块茎和大麻接种进行高通量致病性检测

1. 准备土豆块茎（简称Favorita）时，用无菌水冲洗，短暂浸泡在75%乙醇中，然后在干净的工作台上自然风干。将块茎切成~8毫米厚的块，放入无菌的90毫米培养皿中。准备至少三片用于生物复制。
2. 使用多通道移液器，按照96孔突变体文库的板式布局，将每种突变株1微升接种到马铃薯片上。将 P. brasiliense ΔrecA 作为阳性对照，LB + kan作为阴性对照。
3. 将接种后的土豆片在28°C下孵育7–8小时。与 ΔrecA 对照组相比，突变体表现出明显减少的浸渍或病变面积较小。通过测量病变的长度和宽度来量化病灶面积。将这些人指定为初级筛选候选人。
   注意：确保接种前突变体培养和对照的OD₆₀₀值被归一化为0.8。
4. 进行二次筛选时，将每种候选菌株5微升接种于新鲜土豆片上（每片6株，间距相等）。为每个菌株准备三个生物复制体。在28°C下潜伏7–8小时，记录病灶大小以确认减弱。
5. 通过在LB + kan板上划线显示出持续降低毒力的分离株。将平板在28°C下孵育一夜，并保存经过验证的低毒力突变体在4°C下进行后续分析。
6. 为实现整株验证，应对马铃薯茎进行150微升细菌悬浮液，标准化剂量为1 x 10⁸ CFU/mL。使用无菌注射器将悬浮液注入基部茎区域。观察48小时后疾病的发展。对三株单独的植物进行生物复制。
7. 使用黑腿病分级量表（“6点序数：0、1、3、5、7、9”）对疾病严重程度进行评分，并计算疾病指数为：
   1. 0级：整株植物无病害症状。
   2. 一级：茎病斑覆盖茎周长不超过三分之一，且/或单片叶片枯萎。
   3. 三级：茎病斑覆盖茎周不超过一半，且叶片少于一半出现轻微萎蔫，和/或少数下部叶片有病斑。
   4. 5级：茎病斑覆盖茎周长的一半以上，和/或超过一半的叶片表现出轻微萎蔫。
   5. 7级：茎病斑环绕整个茎周，且/或超过三分之二的叶片枯萎。
   6. 9级：植物所有叶子均已枯萎或枯死。
      
8. 通过将等量无菌50%甘油混合至最终浓度25%，并在-80°C下储存，准备已确认减毒突变体的长期储存库。

5. 通过质粒救援识别Tn5插入位点

1. 培养感兴趣的Tn5突变体，并使用细菌基因组DNA提取套件提取基因组DNA。定量DNA浓度，确保下游消化所需的足够输入。
2. 在100微升反应中消化1–2微克基因组DNA ，内含10×反应缓冲液和5微升酶，并在37°C下培养至少3小时。使用琼脂糖凝胶验证消化完成度。
3. 通过加入1/10体积的3M醋酸钠和3体积的绝对乙醇来沉淀消化后的DNA。充分混合后在-20°C下孵育1小时。
4. 在13,500 x g离心机下离心5分钟，然后依次用75%乙醇和绝对乙醇清洗颗粒。将颗粒晾干后，再悬浮于17微升无菌水中。
5. 通过加入2微升10×T4 DNA连接酶缓冲液和1微升T4 DNA连接酶，自连接消化后的DNA片段。包含阴性对照（无连接酶）以检查背景转化情况。在4°C下孵育连接反应一夜，以促进限制性片段的圆形化。
6. 利用前述热休克转化，将10微升连接混合物转化为化学条件良好的 大肠杆菌 S17-1 λpir。在LB中回收细胞1小时，然后将细胞板化到含有卡那霉素（LB+kan）的LB琼脂上，以选择携带Tn5盒的质粒。
7. 随机选取五个对卡纳霉素耐药的聚落，使用标准质粒迷你制备套件提取质粒DNA。通过用 HindIII消化每个质粒500 ng，并在37°C下培养5小时，验证质粒结构。通过琼脂糖凝胶电泳分析消化模式。
8. 如果质粒带大小符合预期的片段模式，则使用位于Tn5末端的5' ME引物进行桑格测序。
9. 通过使用BLAST或基因组分析软件将Tn5 5'-ME下游50-100碱基对侧翼序列与 P. brasiliense SM基因组比对，确定精确的Tn5插入位点。
10. 确认每个突变体的五个独立测序反应都映射到相同的基因组坐标（>98%序列同质）。
11. 如果五个测序反应中的任何一个对应到不同的基因组坐标，这表明该突变体中存在多个Tn5插入位点。在这种情况下，分析更多菌落以确定所有插入位置。或者，可以进行南方印迹法或全基因组测序，以获得更明确的插入位点定位。
12. 将所有测序反应中具有单一且一致插入位点的突变体指定为正宗的Tn5单插入突变体，适用于下游表型或遗传分析。

结果

为克服巴西葡萄（P. brasiliense）sucB突变引起的不稳定性，利用pLP12质粒中的vmi480毒素作为反选择标记，并通过更换抗生素耐药盒和调整克隆位点配置构建了改良自杀载体pKV2（见图1A）。为了生成无标记的recA缺失突变体，将recA基因的左、右同源臂~800碱基克隆到pKV2中，随后通过两步选择程序获得双交叉重组。使用引物对LBF/RBR和桑格测序进行PCR验证显示突变体与野生型约有600碱基对的差异，证实recA的成功缺失（见图1B）。

以recA突变株为受体背景，构建了一个Tn5转座子突变体库，产生了超过12,000个个体突变体。高通量致病性筛查，结合马铃薯块茎（图2A，B）和整株接种检测（图2C），发现三种突变体毒力明显低于亲本株。

讨论

本研究开发的遗传操作策略为巴西土豆的主要软腐病原体P. brasiliense的功能基因组学提供了选择 ^9,10。通过将基于毒素的反选择系统整合进自杀质粒骨架，产生了无标记的ΔrecA突变体。这种方法相较于传统的基于 sacB 的系统具有显著优势;由于巴西葡萄园菌固有的蔗糖耐受性和渗透敏感性，SacB常常产生高背景生长，而基于毒素的系统则在双交叉事件中提供了更高的选择严谨性和更高的特异性。由此产生的ΔrecA菌株作为稳定背景，消除非特异性同源重组，从而确保后续转座子插入的遗传稳定性。此外，recA基因的缺失对毒力或适应度成本没有观察到影响，而这正是有意义致病性测定的关键前提。

该协议的成功取决于几个关键步骤，最显著的是优化共轭效率。鉴于不同供体背景和质粒尺寸的效率差异，实现高...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细菌基因组DNA提取试剂盒	提取细菌基因组DNA	天晶	DP302-02
二氨基庚酸	在1升培养基中0.3 mM	麦克林	D836611-5g
DNA组装试剂盒	DNA组装	Vazyme	C116-02
DNA纯化试剂盒	DNA纯化	天晶	DP214-02
卡那霉素	50 mg/mL	阿拉丁	K103025-25g
葡萄糖	0.2%（w/v）	阿拉丁	G116305-250mg
胰蛋白胨	在1升培养基中10%	OXOID	LP0042B
酵母提取物	在1升培养基中5%	OXOID	LP0021B
NaCl	在1升培养基中10%	Biofroxx	1249KG001
琼脂	在1升培养基中15%	Biofroxx	8211GR500
L-阿拉伯糖	0.3%（w/v）	阿拉丁	A106196-25g
质粒Miniprep试剂盒	提取质粒	天晶	DP103-02
EcoRI	限制性内切酶	宇功生物	EG15536
NheI	限制性内切酶	宇功生物	EG15552
HindIII	限制性内切酶	宇功生物	EG15539
T4 DNA连接酶	线性DNA自环化	宇功生物	EG15205
离心机	RWD	M1324R
PCR热循环仪	BIO-GENER	GET3XG
数码相机	索尼	ILCE-7M4
电泳系统	LY	DYY-6C
水浴	JOANLAB	WB100-1F
凝胶文档系统	Thermo Fisher Scientific	iBright CL750
高压灭菌器	Yamato	SQ510C
振荡孵化器	ZHICHU	ZQZY-AR8
恒温孵化器	ZQ	DHP-9272
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	Lite Plus
UV-Vis分光光度计	日立	U-3900
电穿孔仪	BIO-RAD	MicroPulser
菌株和质粒
P. brasiliense SM	马铃薯致病菌	实验室菌株收集
E. coli S17-1 λpir	E. coli受体细胞	WEIDI	DL2010S
E. coli WM3064	E. coli受体细胞	BIO SCI BIO	C1039
E. coli RHO3	E. coli受体细胞	实验室菌株收集
pKV2	改良的自杀质粒	本研究中构建
pLP12	自杀质粒	实验室菌株收集
pMCS2-LLtnp	提供携带Tn5的片段	实验室菌株收集
pKV2-LLtnp	携带Tn5片段的改良质粒。	本研究中构建
引物
LBF (ctgaaagcttctgcaggagctcgctgacccaacaatccttgattaagatgaggc)		定制
LBR (gttcagccaccattctgctcctgtcatgcggcgt)		定制
RBF (caggagcagaatggtggctgaacgggttgtgac)		定制
RBR (gatcctgcagcggagcggccgcgcagatcgcgggcaaggttagtc)		定制
checkF (ctatgcgcttcgcataccgtgc)		定制
checkR (gctcttgctcataattgtcctgg)		定制
TnpF (ggaatctagaccttgagtcgatatcactctcgtttaatgctg)		定制
TnpR (acaaacaaaaccaaattctgtacggcgaag)		定制
ori-F (taatcgccttgcagcacatc)		定制
ori-R (ggtatgagtcagcaacacct)		定制
5’ME (attcattaatgcagctggcacg)		定制