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方法文章

一个 体外 使用循环细胞应力拉伸系统对骨骼干细胞施加张力的实验装置

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DOI：

10.3791/70570

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2026年6月12日

 ,  ,  , 
1Key Laboratory of Emergency and Trauma of Ministry of Education, Hainan Academy of Medical Sciences, Hainan Medical University

本文内容

摘要

小鼠骨膜来源的骨骼干细胞（SSCs）通过FACS分离并进行培养 体外建立了一个可控制的实验系统，对SSCs施加周期性拉伸力学刺激，导致细胞衰老相关基因的表达降低，特别是 p16 和 p21.

摘要

骨是一种主要的机械敏感性器官，能够持续响应机体内的物理刺激。尽管机械刺激在骨骼发育、稳态维持和损伤修复中发挥重要作用，但骨骼干细胞（SSCs）对机械应力的具体响应机制仍不完全清楚。为解决这一问题，我们建立了一种 体外 用于分离小鼠骨膜SSC并施加机械刺激的模型。首先通过酶消化法获取小鼠骨膜细胞，随后根据已确立的表面标志物，利用荧光激活细胞分选（FACS）技术分离SSC。细胞贴壁培养后，采用循环式细胞应力-张力系统对SSC施加拉伸机械刺激。该系统可重复地向培养细胞施加张应力，为分析SSC对机械刺激的响应提供平台。利用该方法，我们发现细胞衰老相关基因的表达 p16 和 p21 在机械刺激后，精原干细胞中的表达显著降低。这些发现表明，拉伸刺激可能影响精原干细胞中与衰老相关的变化 体外 条件。总体而言，该方案为研究机械刺激下精原干细胞（SSC）的行为以及机械信号如何影响SSC功能提供了一个有用且合适的平台。

引言

骨骼系统作为人体最大且最重要的支撑器官，不仅为其他器官提供附着位点和保护作用，同时也是运动功能的基础。因此，骨骼系统持续受到来自内外环境的各种机械刺激。机械刺激信号对于骨的发育和功能维持同样至关重要。早在1893年就已提出，骨密度与骨骼所承受的机械力之间存在一定的正相关关系，即沃尔夫定律1。近年来，一些研究已证实骨骼系统承受机械力对于骨骼正常发育具有重要意义2,3,4,5。骨骼系统对机械力的响应在一定程度上依赖于骨内的细胞成分6。骨细胞占骨骼系统细胞成分的85%至90%。由于其广泛的分布和独特的树突状细胞形态，骨细胞目前是机械响应研究最为深入的一类骨骼细胞7,8。除了骨细胞被广泛认知的机械力响应能力外，骨骼前体细胞也在其中发挥着不可或缺的作用。研究发现，骨膜前体细胞对机械信号的响应可调控其命运转化，从而影响组织损伤修复9。

骨骼干细胞（SSCs）是一类具有自我更新能力的组织特异性干细胞，可分化为骨骼生长、维持和修复所需的成熟骨细胞类型。2015年，小鼠SSCs的表面标记基因被鉴定出来10随后，多项研究也证实，骨骼干细胞（SSCs）在骨发育、稳态维持以及骨损伤修复等多个方面均发挥着极为重要的作用11,12由于骨骼系统具有响应机械力的特性，可将机械力信号视为调控骨骼干细胞功能不可或缺的因素。为了研究骨骼干细胞在机械刺激下的行为变化，需要建立一种适宜的实验体系以施加机械力 体外.

主要方法 体外 细胞所受的机械刺激包括流体剪切应力、压缩应力、拉伸力、静水压力、基质刚度和基质拓扑结构6,13根据小鼠精原干细胞（SSCs）的表面标志基因，我们通过流式细胞术分选获得了小鼠骨膜来源的精原干细胞，因为参与骨折修复的精原干细胞主要来源于骨膜14随后，通过循环细胞应力拉伸系统对骨膜SSCs施加适当的张应力。在张应力刺激后，可收集细胞样本并进行多组学分析，包括转录组测序、蛋白质组测序和ATAC-seq。因此，建立该实验方案为研究SSCs对机械刺激的响应提供了坚实的基础。

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方案

本方案中的小鼠实验均已获得中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所动物护理与使用委员会的批准（SIBCB-S350-2312-41）。

1. 小鼠骨膜细胞的分离

  1. 将4至6周龄的小鼠放入CO₂安乐死箱中，持续暴露于CO₂环境中3分钟，直至呼吸停止。
  2. 用75%酒精对小鼠体表进行消毒。使用眼科剪分离后肢，然后用尖头镊子和眼科剪去除后肢的骨骼肌，确保股骨和胫骨的关节区域保持完整。
  3. 将分离出的骨骼置于预冷的PBS中保存，随后用低熔点琼脂糖（TAE缓冲液中配制，浓度5–10%）包裹骨骼两端。
  4. 在37°C条件下，用含1 mg/mL胶原酶、2 mg/mL中性蛋白酶II和0.1 mg/mL DNase I的最低必需培养基α（α-MEM）对股骨和胫骨进行两次消化，每次30分钟，离心力为0.3 × g。将消化后的细胞收集至培养基（α-MEM + 10%胎牛血清（FBS））中。
  5. 将细胞悬液通过40 µm细胞筛过滤，随后在500 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。
  6. 用红细胞裂解缓冲液重悬细胞沉淀，作用2分钟后，加入流式细胞术缓冲液（PBS + 2% FBS）终止反应。
  7. 在500 × g条件下离心5分钟，弃去上清液，用流式细胞术缓冲液将细胞重悬至浓度为1 × 107 个细胞/mL，用于细胞分选。

2. 荧光激活细胞分选

  1. 按下述方法用以下抗体对细胞悬液进行染色：PerCP/Cy5.5 标记的抗小鼠 CD45 抗体、PerCP/Cy5.5 标记的抗小鼠 CD31 抗体、PerCP/Cy5.5 标记的抗小鼠 Ter119 抗体、FITC 标记的抗小鼠 6C3/Ly-51 抗体、Brilliant Violet 605 标记的抗小鼠 CD90.2 抗体、PE/Cy7 标记的抗小鼠 CD105 抗体、APC 标记的抗小鼠 CD200 抗体。
  2. 将上述抗体按 1:500 比例稀释，冰上避光孵育 30 分钟。
  3. 用流式细胞术缓冲液洗涤细胞，使用荧光激活细胞分选仪进行细胞分选，以获得 CD45- CD31- Ter119- CD90.2- 6C3- CD105- CD200+ 的 SSCs。用培养基收集分选后的 SSCs。使用 FlowJo v10.8.1 软件分析获取的数据。
  4. 将分选后的 SSCs 置于培养皿中，使用扩增培养基在 5% CO2 细胞培养箱中进行扩增培养。在进行机械刺激前可传代一次。
    注：每对 6 周龄小鼠可获得约 1 × 105 个骨膜 SSCs。

3. 精原干细胞的机械刺激

  1. 将鼠尾I型胶原蛋白用无菌的0.02 M乙酸稀释至终浓度为0.15 mg/mL。该溶液可重复使用3次，应保存在4 °C。
  2. 向6孔柔性底培养板的每孔中加入1.5 mL稀释后的鼠尾I型胶原蛋白溶液。室温孵育1小时完成包被后，吸除多余的胶原蛋白溶液，并用PBS洗涤一次，以备后续使用。
  3. 注意：若需立即使用，应以PBS冲洗培养板以去除残留酸液；若需在4 °C保存，则应在移除盖子的情况下将培养板完全干燥。
  4. 消化培养的小鼠骨膜SSCs，500 × g 离心5分钟，将细胞沉淀重悬于培养基中，调整细胞密度至 1 × 105 个细胞/mL，每孔加入2 mL细胞悬液至6孔柔性底培养板中，随后放入细胞培养箱中。
  5. 接种细胞24小时后，将柔性底培养板置于拉伸底板上，同时保留另一块细胞培养板作为未施加机械力刺激的对照组。
  6. 在FX-6000 Version 1.0软件中设置参数如下：拉伸强度8%，频率0.1 Hz，波形为方波，波形占空比80%，拉伸持续时间为12小时。
    ​注意：拉伸底板上有四个可放置6孔柔性底培养板的位置。若实验所需细胞少于4组，空置位置应使用新的6孔柔性底培养板填充。施加适当的机械刺激后，SSCs可进行功能检测，如细胞分化或增殖实验，或提取样本用于多组学测序。

4. 实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）

  1. 细胞机械刺激结束后，弃去培养基，用 PBS 洗涤细胞一次，使用 TRIzol 试剂提取总 RNA，并进行 RNA 逆转录。
    注意： RNA 提取完成后，可于 -80 °C 保存。逆转录获得的 cDNA 亦可于 -20 °C 保存，用于后续检测。
  2. 使用实时荧光定量PCR系统进行RT-qPCR。所用引物序列如下：
    Hprt：正向 5’-GTTAAGCAGTACAGCCCCAAA-3’
    Hprt：反向 5’-AGGGCATATCCAACAACAAACTT-3’，
    p16：正向 5’-GGTCACACGACTGGGCGATT-3’
    p16：反向 5’-GCACCGTAGTTGAGCAGAAGAG-3’，
    p21：正向 5’-GCCTGGTTCCTTGCCACTTCTT-3’
    ​p21：反向 5’-ATTACGGTTGAGTCCTAACTGCCATC-3’。

5. 短期机械应力处理的影响

  1. 在FX-6000 Version 1.0软件中设置参数如下：拉伸强度8%，频率0.1 Hz，波形为方波，波形占空比80%。在机械张力刺激后10分钟和60分钟，使用RIPA裂解缓冲液I（含磷酸酶抑制剂混合物和蛋白酶抑制剂混合物）裂解细胞。
  2. 使用Erk和p-Erk抗体进行蛋白质印迹实验。

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结果

在实施本方案后，成功对小鼠骨膜来源的骨骼干细胞（SSCs）施加了张力。首先，通过流式细胞术从小鼠骨膜中分离获得SSCs。流式细胞术结果显示，骨膜中SSCs的比例约占Lin- (CD45-, CD31-, Ter119-) CD90.2- 6C3-细胞群的近30%（图1），远高于骨髓中的比例。鉴于骨膜SSCs在骨骼发育和骨折修复中具有重要作用14,15，有必要全面分析其在响应机械刺激后的变化。

为了检测机械力刺激后骨膜SSC中发生的变化，检测了细胞衰老标志物基因的表达，因为原代细胞在传代培养过程中容易发生细胞衰老16。结果显示，经过机械刺激后，骨膜细胞中细胞衰老标志物基因p16和p21...

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讨论

近年来，来自骨骼不同部位的骨骼干细胞标志基因被不断发现11,12,17然而，关于精原干细胞（SSCs）功能的直接调控研究仍需进一步深入，尤其是在机械力刺激调控方面。迄今为止，针对骨骼干细胞/前体细胞的机械调控效应研究主要基于构建 Piezo1 基因敲除小鼠模型9,18，目前仍缺乏直接证据来揭示精原干细胞（SSCs）在机械刺激下发生的改变。循环拉伸系统可为培养的细胞提供精确、可控、可重复的静态或周期性应力变化 体外，使其成为对细胞施加力学刺激的理想实验平台。许多研究已利用周期性拉伸系统来探究成骨细胞、骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、韧带细胞和成肌细胞在力学刺激下的细胞反应19在此，通过流式细胞术分选获取小鼠骨膜干细胞（SSCs），随后利用周期性拉伸系统施加机械...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

感谢中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所流式细胞术核心设施和动物中心设施。本工作得到国家自然科学基金（32471190，82502903）和海南省外国专家项目（506068033010）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
α-MEMCorning10-022-CV骨膜细胞分离
APC 抗小鼠 CD200BioLegend123809SSCs 分选
BioFlex 6孔培养板 FlexcellBF-3001A细胞培养
Brilliant Violet 605 抗小鼠 CD90.2BioLegend140317SSCs 分选
胶原酶SigmaC0130骨膜细胞分离
Dispase IISigmaD4693骨膜细胞分离
DNase ISigmaDN25骨膜细胞分离
胎牛血清GibcoA5356701SSCs 分选
FITC 抗小鼠 6C3/Ly-51BioLegend108305SSCs 分选
 Flexcell 张力系统 FlexcellFlexercell FX-6000 细胞张力
流式 细胞 分选仪BDBD FACSAria FusionSSCs 分选
MesenCult 扩增试剂盒（小鼠）Stem cell05513细胞培养
PE/Cy7 抗小鼠 CD105BioLegend120409SSCs 分选
PerCP/Cy5.5 抗 CD31BioLegend102522SSCs 分选
PerCP/Cy5.5 抗 CD45BioLegend103132SSCs 分选
PerCP/Cy5.5 抗小鼠 TER-119BioLegend116228SSCs 分选
 PrimeScript RT 试剂盒TaKaRaRR037ART-qPCR
大鼠尾部 I 型胶原蛋白Corning354236细胞培养
实时 PCR 系统Thermo Fisher ScientificQuantStudio 1 PlusRT-qPCR
 红细胞裂解缓冲液 Beyotime C3702骨膜细胞分离
TRIzolSigmaT9424RT-qPCR
磷酸酶抑制剂混合物 IIMCEHY-K0022WesternBlot
 RIPA 裂解缓冲液 ISangon BiotechNO. C500005WesternBlot
蛋白酶抑制剂混合物 MCEHY-K0010WesternBlot
p44/42 MAPK (Erk1/2) 抗体 Cell Signaling Technology9102WesternBlot
磷酸化 p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) 兔单克隆抗体Cell Signaling Technology4370WesternBlot

参考文献

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