富集型光交联明胶–核黄素水凝胶的制备及其在兔角膜伤口修复中的外科应用

摘要

一种可重复的方案被提出，用于制备、富集及应用 原位 用于兔角膜基质伤口修复的蓝光交联明胶-核黄素水凝胶，包括手术操作步骤、部分睑缘缝合术及术后护理。

摘要

本文介绍了一种逐步操作方案，用于制备、补充以及外科应用一种 原位 用于兔角膜基质伤口修复的蓝光交联明胶水凝胶。该水凝胶前体包含5%（w/v）明胶和0.01%（w/v）核黄素磷酸，于无菌避光条件下制备，经无菌过滤并在使用前加热以达到可注射黏度。文中详细说明了可选添加人羊膜提取物或兔自体血清的方法。在眼表通过波长λ = 420–480 nm的蓝光照射2分钟，实现按需凝胶化。 体内 该方法包括可重复的前基质角膜切除术（角膜环钻直径6.5 mm；深度约187 µm），随后进行水凝胶填充、光激活，以及部分外侧睑缘缝合，以稳定治疗效果、促进伤口愈合并标准化术后护理。代表性 体外 表现出类凝胶的粘弹性行为，具有剪切稀化和快速恢复特性，以及高光学透过率（> 90%）在500 nm以上，表明适用于角膜使用。 体内基于水凝胶的治疗可促进上皮逐步闭合，具有良好的眼部耐受性（第3天和第7天的Draize评分较低），并随时间推移出现可见水凝胶的减少，符合生物降解与组织替代的特征。本方案强调了确保可重复性的关键步骤和暂停节点，包括溶解与过滤过程中的温度控制、避光操作以及交联过程中的光源定位。该方法可实现无需缝合、精确定位、光激活的水凝胶稳定化，且兼容多种生物活性添加剂的引入。本方案为下一代眼科生物材料的临床前评估提供了实用平台，并有助于光交联水凝胶疗法在角膜伤口修复中的转化应用。

引言

角膜是一种透明的无血管结构，约占眼球屈光力的三分之二，其结构和功能的完整性对视力至关重要¹。由于直接暴露于外部环境，角膜极易受到外伤、感染、化学损伤以及术后并发症的影响^2,3。若未能及时有效地恢复上皮完整性，可能导致持续性上皮缺损（PEDs）和慢性角膜溃疡，最终引发基质溶解、穿孔、瘢痕形成以及不可逆的视力丧失^4,5。常规治疗手段——包括润滑剂、抗生素预防和自体血清滴眼液——往往只能提供部分疗效，且在中重度缺损中无法充分促进基质修复^6,7,8。

为克服这些局限性，基于生物材料的疗法因其能够保护伤口、支持上皮修复并恢复基质组织而成为颇具前景的替代方案^9,10,11,12

方案

人胎盘来自知情同意的捐赠者，符合《赫尔辛基宣言》要求，并获得克鲁塞斯大学医院伦理委员会（批准编号 CEIC E15/03）的批准。所有动物实验均经巴斯克大学（UPV/EHU）动物研究伦理委员会（批准编号 CEEA M20/2023/038）批准，并遵循ARVO关于眼科与视觉研究中动物使用的规定。所有操作均在UPV/EHU动物实验中心（SGIker）进行，全程保持无菌技术（处理生物材料时使用II级生物安全柜）。

1. 水凝胶合成

1. 明胶-核黄素前体溶液（5% 和 10% w/v）
   ​注意：在光线较暗的环境下操作，或使用琥珀色瓶或包裹铝箔的容器，以避免溶液暴露于光线下。当水凝胶用于生物学用途时，所有步骤均须在超净工作台内的无菌条件下进行。
   1. 称取所需量的明胶和核黄素磷酸盐（RFP）：配制10 mL 5%（w/v）明胶加0.01%（w/v）RFP前体溶液时，称取500 mg明胶和1 mg RFP；配制30 mL 10%（w/v）明胶加0.02%（w/v）RFP储备液时，称取3 g明胶和6 mg RFP。
   2. 将明胶和RFP加入相应体积的去离子水中（≈最终体积的90%）。轻轻搅拌，直至粉末完全分散。
   3. 使用 1 M NaOH 调节 pH 至 7.0，边监测 pH 值边逐滴加入碱液。记录所用 NaOH 的体积及最终调节后的体积。pH ....

结果

水凝胶的合成与表征
水凝胶的合成与评价 体外 以确定其光交联前后流变学和光学特性。采用剪切流变学表征其粘弹性、屈服行为及流动特性。频率扫描结果显示，在所有测试频率下，G′始终高于G″，表明材料呈类固态行为（图 5A）。在 10 rad·s⁻¹ 显示出一个较宽的线性黏弹性区域（约100%应变），其中储能模量（G′）始终高于损耗模量（G″），表明具有类凝胶结构（图5B）。蓝光交联前进行的流动扫描显示了剪切变稀现象，随着剪切速率从10⁻³ s⁻¹增加，黏度显著下降。⁴ 至 100 s⁻¹，模拟注射条件（图 5C）。阶跃剪切测试表明，该材料在高剪切破坏后5秒内黏度即可恢复至基线水平，显示出快速恢复特性，支持其具备自愈合能力（图 5D).

讨论

本方案提供了一种可重复的工作流程，用于制备、装载及应用光交联明胶–核黄素水凝胶以促进角膜伤口愈合。若干 体外 步骤对于获得稳定的凝胶质量至关重要，需要特别强调，因为这些步骤是最常见的变异来源。首先，在搅拌过程中将前体溶液维持在80 °C，可确保明胶和磷酸核黄素完全溶解，防止产生影响光学透明性和交联均匀性的颗粒聚集体。在无菌过滤前，必须将配方重新加热至40 °C以确保完全液化，因为在较低温度下过滤会导致过滤不完全并增加污染风险。制备完成后，水凝胶应保存在4 °C避光环境中，并在使用前加热至32 °C，此时其保持半固态但仍可移液，防止操作过程中发生泄漏 体外 和 体内 应用中，这些温度参数的任何失效通常表现为凝胶浑浊、滤器堵塞、光固化不均匀或在应用部位扩散。纠正措施包括将80 °C的混合步骤延长至45 若颗粒物持续存在则延长搅拌时间；在冷却前确认pH为7.0；预先润湿聚醚砜（PES）滤膜；当过滤速度仍较慢时，先使溶液通过0.45 µm预滤膜，再进行最终除菌过滤。在 原位 交联，标准化灯距（≈2 厘米）并以六个20秒脉冲的形式提供光照，脉冲间间隔5–1.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
两性霉素B	Gibco（Thermo Fisher Scientific）	15290018	终浓度： 1.25 μg/mL
自体血清，兔（AS）	自制	-	由全血制备；经滤过 0.22 μm PES
蓝光LED固化灯	伍德佩克医疗仪器公司	LED.C 模型	波长： λ=420–480 纳米（nm）；距离： 1–2 厘米；光输出：850-1000 毫瓦/平方厘米2
布托啡诺（Buprecare）	Ecuphar	578950	剂量： 0.05 mg/kg，皮下注射，每隔 12 h 用于 72 h
相机	松下	LUMIX TZ35	配备徕卡光学镜头的相机
Cimarec 数字搅拌加热板	赛默飞世尔科技	SP131320-33	220-240 V，最高温度：540 °C
新月形显微手术刀	BVI 医疗	373807	-
DMEM（Dulbecco）’s 改良伊格尔培养基)	Gibco（Thermo Fisher Scientific）	11966025	-
Eppendorf管（0.2 mL）	默克股份公司	30124707	为制备 HAMe 保持低温；分装
Eppendorf 管（5 mL）	默克股份公司	30119606	为HAMe制备保持低温；分装
荧光素溶液	诺华	Colorcusi Fluotest	2% 荧光素溶液，5 µ滴眼液
Gibco 新霉素	默克股份公司	N1142	终浓度： 50 μg/mL
明胶粉	Sigma Aldrich	G1890	溶解于 80 °C；pH 调至 7.0
透明质酸人工泪液（0.2%）	Chem.-pharm. Fabrik GmbH	Hylo-Tear	-
ImageJ 图像处理软件	美国国家心理健康研究所	-	由美国国立卫生研究院研究服务部的 Wayne Rasband 开发
氯胺酮（Ketolar）	辉瑞	631028.1
利多卡因	Vet One	NDC 13985-222-04	局部或皮下注射
青霉素–链霉素	Gibco（赛默飞世尔科技）	15140-122	终浓度： 50 μg/mL
PES 注射器滤器 0.22 μ0.22 mμm （Millex）	默克股份公司	SLGP033RS	-
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma Aldrich	P4417-100TAB	-
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma Aldrich	P8340	添加于 5 μL 每 mg 组织
聚维酮碘溶液	Meda pharma	7167204	术前消毒
核黄素磷酸盐（RFP）	Sigma Aldrich	R0630000	浓度： 0.01% w/v （最终） 0.02% w/v （储备液）
超声波破碎仪	Bandelein 电子设备	Sonoplus GM mini20	-
超声波破碎探头	班德莱因电子	MS 1.5	直径1.5 mm，长度63 mm的探针
睑缘缝合缝线（不可吸收）	Alcon	8065308001	1–根据需要使用 2 根缝线
妥布霉素眼用溶液（3 mg/mL）	诺华	Tobrex	给药方案：每日两次，直至愈合
Hessburg-Barron 角膜环钻，6.5 毫米直径	杰德迈德	21-8265	-
含聚合物凝胶分离剂的真空采血管	BD（Becton, Dickinson and Company）	367704	-
赛拉嗪溶液	Laboratorios Calier SA	Xylagesic	剂量： 5 mg/kg 肌内注射