高分辨率昆虫摄影的焦点堆叠协议

Summary

其目标是提供一种易于获取、标准化的对焦叠加方法，利用经济实惠的设备，为分类学、生物多样性研究、生态学研究和公众推广制作清晰、高分辨率的图像。

Abstract

本文介绍了一种通过模块化数字成像系统通过摄影对焦堆叠获取昆虫标本高分辨率、扩展景深图像的方案。该方法提供了标准化的工作流，将设备组装、校准、图像采集和后期处理连接起来。该协议使用全画幅无反相机（61 MP）与显微镜物镜和同步频闪照明相结合，实现0.76米至0.19米的像素尺度，并通过亚微米级对焦增量（0.2米）实现无伪影合成图像。该程序在常规实验室条件下每周可捕捉并处理约20张最终图像。与现有堆叠解决方案相比，这种低成本混合方案（<商业系统30%的成本）最大化了可及性，同时保持了受衍射限制的图像质量。代表性应用包括用于分类学、生物多样性数字化和推广的彩色校准识别板的生产。该方案的标准化结构促进了实验室和野外站间的重复性，支持资源有限和机构环境中的大规模昆虫成像活动。

Introduction

昆虫是地球上最多样化的生物群，在生态系统功能中扮演关键角色。然而，全球评估显示其数量和多样性在全球范围内出现令人担忧的下降 ^2,3。准确的昆虫形态成像对于分类学、生态监测和保护至关重要，尤其是在生物多样性丰富的热带地区，许多分类单元尚未被描述⁴。然而，传统宏观摄影仍受限于景深有限，这使得单张图像无法涵盖完全清晰的三维结构，如天线或翅膀⁵。

为科学目的拍摄昆虫的努力可以追溯到一个多世纪前，早期的方法描述强调捕捉精细形^态细节的固有困难。传统微距摄影虽然广泛使用，但仍受限于高倍率^7.8时可实现的浅景深。这一限制使得三维结构如触角、腿或翅膀难以记录，导致图像分辨率不足以进行准确识别或形态分析。

数码摄影和图像处理技术的进步推动了显著进展。对焦叠加，即将多张在不同焦平面拍摄的图像合并，生成完全清晰的合成图像，已成为一种特别

Protocol

1. 设备安装

1. 设计一个模块化成像系统，将高端光学元件与经济且广泛可得的设备集成（补充文件1）
2. 结合精密机械、受控照明和先进光学技术，实现高分辨率对焦堆叠，同时保持对不同昆虫大小和形态的灵活性。
3. 请使用以下核心组件。
   1. 相机
      1. 使用高分辨率全画幅数码相机，动态范围强，详细捕捉细致的形态结构。
      2. 将相机安装在高度专用的对焦轨道上（补充文件1）
   2. 光学
      1. 使用无限远校正显微镜物镜，放大倍数如5倍、7.5倍、10倍和20倍（补充文件1），安装在管状系统上。
      2. 对于较大的样品，可以搭配超微距镜头来补充物镜配置。
      3. 根据需要，添加不同放大倍数的镜头管（补充文件1）
   3. 照明
      1. 在后方直立位置安装两台演播室闪光灯，以提供稳定且强劲的照明。
      2. 在前方斜置两台高速闪光灯，以实现短闪光持续时间和快速回收。
      3. 将灯具安装在可调节的支架上....

Results

图像质量和分辨率的验证

对焦叠加系统在5×至20×倍放大时，能产生完全锐利、高对比度的合成影像。计算出的像素尺度在物体空间中范围为0.76微米（5×）至0.19微米（20×），确认了昆虫表皮和附肢亚微米结构细节的充分采样。代表性的800至2000帧叠叠显示出持续的面内清晰度，无晕晕伪影。协议保持帧间0.2微米以内的对齐精度±。

有效分辨率——从最小可观测的周期结构估算——约为4微米，符合所用物镜的衍射极限。这一对应关系表明系统在可见光成像的物理分辨率边界下运行。定量值汇总于 表1， 表2 详细说明预期景深范围。

Discussion

对焦堆叠程序的最佳性能依赖于：（i）完全隔离装置免受振动影响，（ii）在亚微米级的精确对焦轨道校准，以及（iii）色彩校准的一致性。任何偏离这些参数都会显著增加晕的形成和色移^9。机械稳定性与标准化照明的结合是决定图像质量的最关键因素。

故障排除和可能的修改作为系统优化的一部分。通过验证漫射器对齐并减少闪光强度的不对称性，纠正了照明不均。通过更新对焦控制器固件并确认线性步进系统的校准正确，堆栈错位问题得以解决。通过每曝光1500次后引入10分钟冷却间隔，缓解了光源过热。为了适应现场，当没有防震台时，便携式支撑材料采用密集的石材或金属结合橡胶隔音材料;该配置在7.5倍倍率[17.1]下仍保持满意×。其他修改还包括实现自动采集脚本和使用开源堆栈软件，从而降低了处理时间和许可成本¹⁰。

系统的分辨率最终受衍射（物体空间内4米）限制，不论传感器密度

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
支持表	优先考虑3个舱体	整个设定的稳定基础	150
防振动表	习俗	最大限度减少图像捕捉时的振动	3,200
圆柱形黑色隧道	习俗	控制光线方向	350
减少小题的反射
Novoflex CASTEL-MICRO 对焦架（宏轨）	步进电机及冲刺;控制单元、网络线、欧式交流适配器	亚微米精度对焦（0.2 & micro;m步）;	3,000
自动化摄像机移动
XYZ旋转式	可调节安装座	细致的对象对齐和定位	500
相机	索尼Alpha 7R IV（6100万像素全画幅）	高分辨率图像捕捉	3,000
照明	2×戈多克斯SK300II	统一且无阴影的灯光;	400
照明	2×戈多克斯QT600II	高速且闪光持续时间短	1400
闪光灯支架	3个可调节支架	灯光的灵活定位	100
光照修改器	扩散器	柔化光线，减少刺眼阴影	50
背景	“黑洞”天鹅绒	消除反射，提供均匀背景	200
显微镜物镜	三户代计划Apo无限修正：5×	微观结构的高精度放大	1,000
三户代计划Apo无限修正：7.5及次;	2,000
三丰计划 Apo 无限 修正：10×	1,400
三户代计划Apo无限修正：20×	5,000
透镜管系统	三丰丰M-Plan镜头的直接相机使用（2倍、5倍、7.5倍、10倍、20倍）	显微镜物镜与相机的联动	400
适配器	索尼E卡口到NOVOFLEX通用卡口A型	相机与光学系统的机械连接	300
微距镜头	Venus Optics Laowa 100毫米 f/2.8 2倍;超微距APO（索尼E卡口）	高倍率成像较大标本	550
触发器	闪光触发器	同步闪光灯与相机快门	50
计算机	华硕或Alienware笔记本，以及;128 GB 内存，高性能处理器	图像处理与存储	3,000
存储介质	2×SD 256 GB，快速 SD 卡读卡器	安全的高容量图像存储与传输	200
配件	游戏鼠标	编辑和导航时的精确度	50
配件	Wacom One（绘图板）	图像清理和编辑时的精细控制	500
<强力>总成本<强力>			<强>26,800<强>