联合耳穴电刺激与孙氏定痛汤缓解气滞血瘀型原发性痛经大鼠症状

摘要

经皮耳穴电刺激联合孙氏定痛汤可减轻气滞血瘀型原发性痛经大鼠模型的子宫病理损伤及炎症相关改变，同时伴随PPAR-γ2和COX-2的mRNA表达水平的改变。

摘要

气滞血瘀型原发性痛经与子宫炎症和疼痛相关，而目前的药物治疗可能引起不良反应。本研究在气滞血瘀型原发性痛经大鼠模型中评估了耳穴经皮电刺激（TEAP）联合孙氏定痛方（SDD）的协同治疗效果。将36只雌性Sprague–Dawley大鼠随机分为空白组、模型组、SDD组、TEAP组、TEAP联合SDD组和布洛芬组。采用苯甲酸雌二醇致敏、盐酸肾上腺素联合应激刺激及催产素给药的方法建立动物模型。各组大鼠分别给予生理盐水、SDD、布洛芬或在特定耳穴实施TEAP，连续干预7天。采用苏木精-伊红染色观察子宫组织形态学变化。采用ELISA法检测子宫组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGF2α和PGE2的水平，采用实时PCR法测定子宫PPAR-γ2和COX-2 mRNA的表达量。模型组大鼠出现子宫上皮变性、中性粒细胞浸润，IL-1β、IL-6、TNF-α、PGF2α和COX-2 mRNA表达升高，同时PGE2和PPAR-γ2 mRNA表达降低。单独使用TEAP或SDD可在一定程度上逆转上述病理及分子改变，而TEAP联合SDD干预的效果更为显著，其疗效与布洛芬组相当。研究结果表明，TEAP联合SDD可减轻气滞血瘀型原发性痛经（QSBSPD）大鼠的子宫病理损伤及炎症相关改变，其作用机制可能与调控PPAR-γ2和COX-2 mRNA的表达有关。

引言

原发性痛经（PD），又称功能性经期疼痛，其特征是在生殖器官中无任何可识别的器质性病变情况下出现痛经¹。经历严重痛经的女性患者常无法完成日常活动，显著影响其生活质量，因而需要药物干预以缓解症状²。现有文献表明，该病与多种因素相关，包括前列腺素（PGs）、雌激素、孕激素、血管加压素、催产素（OT）、免疫系统、神经内分泌效应以及微量元素钙水平的变化³。同时，炎症因子如肿瘤坏死因子（TNF）和白细胞介素-6（IL-6）可诱导PGs的合成或分泌，这一过程导致子宫肌肉过度收缩，进而引发缺血性疼痛和原发性痛经⁴。目前，现代医学对PD的治疗主要分为一般治疗、药物治疗和手术干预。在药物治疗中，非甾体抗炎药（NSAIDs）如布洛芬被广泛使用。然而，NSAIDs的使用与明显的胃肠道副作用相关，长期或大量使用可能导致消化性溃疡和上消化道出血等并发症⁵。因此，寻找并开发更安全、更有效的PD治疗策略至关重要且十分必要。

越来越多的证据表明，原发性痛经在中医中常表现为实证，其中临床常见气滞血瘀证型⁶。在此证型中，气机运行不畅与血行障碍被认为可导致子宫瘀滞、子宫过度收缩及疼痛。因此，临床上常采用调理气机、活血化瘀、温通经络、缓解疼痛的治疗策略。耳穴疗法是中医重要的非药物干预手段之一，操作简便，可通过调节神经内分泌及内源性镇痛通路缓解疼痛⁷。由福州市中医院妇科基于临床经验研制的孙氏定痛方（SDD），常用于治疗以气滞血瘀为特征的痛经。该方以调理气血、活血化瘀、温通经络、缓解经行疼痛为治疗原则。SDD的组成包含失笑散（蒲黄 Pollen typhae 和五灵脂 Faeces Trogopterori），并配伍香附（Rhizoma Cyperi）、没药（Myrrh）、桂枝（Ramulus cinnamomi）、威灵仙（Radix et Rhizoma Clematidis Chinensis）、石见穿（Herba Salivae Chinensis）、延胡索（Rhizoma Corydalis Yanhusuo）、当归（Radix Angelicae Sinensis）、刘寄奴（Herba Artemisiae Anomalae）及小茴香（Fructus foeniculi）。然而，SDD的实验疗效，尤其是联合经皮耳穴电刺激治疗气滞血瘀型原发性痛经的效果，尚未在可控的动物模型中得到系统评估。

过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）属于核激素受体家族，是一类配体激活的受体，在调控多种细胞内代谢过程方面发挥关键作用。PPARs 包含三种不同的亚型，分别为 PPAR-α、PPAR-β/δ 和 PPAR-γ⁸。近期研究发现，PPAR-γ2 在多种组织中均有表达，并与炎症过程存在显著关联⁹。据报告，PPAR-γ 通过抑制核因子 κB、活化蛋白-1 以及信号转导与转录激活因子等信号通路，下调白细胞介素-6（IL-6）、环氧化酶-2（COX-2）、内皮素-1、一氧化氮合酶、基质金属蛋白酶-9、明胶酶及黏附分子的表达，从而抑制炎症反应¹⁰。此外，Huang 等人¹¹ 指出，COX-2 和 PPAR-γ2 可能在气滞血瘀（QSBS）类疾病的病理生理机制中作为关键靶点发挥作用。

因此，本研究探讨了经皮耳穴电刺激（TEAP）、少腹逐瘀汤（SDD）及其联合应用在气滞血瘀型原发性痛经大鼠模型中的治疗作用。通过整合子宫组织病理学、炎症介质谱分析、前列腺素测定以及PPAR-γ2/COX-2相关mRNA分析，本研究旨在评估基于中医内外合治的联合疗法是否能够对痛经相关的子宫炎症提供更强的保护作用。本工作的创新之处在于，在可控的气滞血瘀型原发性痛经（QSBSPD）模型中，首次实验性地评估了TEAP与基于临床经验的SDD方剂联合应用的效果，并探讨其可能与PPAR-γ2/COX-2炎症调控轴相关的机制。

方案

伦理声明

所有动物实验程序均经福建安必锐生物科技有限公司动物伦理委员会审查批准（批准编号：IACUC  FJABR2024031202）。请严格按照批准的机构动物护理和使用方案开展动物实验。

SDD 和布洛芬的制备

SDD 由失笑散（9 g）、香附（9 g）、没药（6 g）、桂枝（9 g）、威灵仙（12 g）、石见穿（20 g）、延胡索（12 g）、当归（9 g）、刘寄奴（15 g）和小茴香（5 g）组成。失笑散由蒲黄（4.5 g）和五灵脂（4.5 g）组成。所有中药成分均使用浓缩颗粒，具体列于材料表中。将 106 g 浓缩颗粒溶于 200 mL 沸水中，配制成终浓度为 0.53 g/mL 的生药当量溶液，制得 SDD。充分搅拌至颗粒完全溶解，待溶液冷却至室温后，以 2.5 mL/kg 的剂量经口灌胃给药。根据所需浓度配制布洛芬混悬液，用于经口灌胃。以 0.02 g/kg 剂量给予布洛芬作为阳性对照治疗。

动物与分组

选用36只健康成年雌性Sprague-Dawley大鼠， SPF级，年龄2–3个月，体重200 ± 20 g，无妊娠或交配史。将大鼠饲养在12 h/12 h明暗循环条件下，温度22 ± 2 °C，相对湿度50%–70%，自由摄取标准饲料和饮用水。经过1周适应性饲养后，随机将大鼠分为六组（每组n = 6）：空白组、模型组、SDD组、TEAP组、SDD + TEAP组和布洛芬组。

QSBSPD 模型的制备与给药

在本实验中，采用了广泛认可的催产素诱导痛经模型。简言之，通过阴道涂片评估大鼠动情周期。若大鼠动情周期持续时间为4–5天，则被视为符合纳入研究的条件。

除空白组外，实验组大鼠每日皮下注射苯甲酸雌二醇和盐酸肾上腺素，持续10天。每日注射盐酸肾上腺素剂量为0.9 mg/kg后，大鼠接受各种复合刺激（A：声音刺激：大鼠暴露于声刺激（90 dB，1 kHz）中，每次5分钟，每日3–4次，每次间隔2小时。B：光刺激：大鼠暴露于闪光刺激中，每次5分钟，每日3–4次，每次间隔2小时。C：电刺激：大鼠接受电刺激（双相方波脉冲），电压为30–35 V，每2秒施加0.3秒交流电。该刺激每2小时进行5分钟，每日2–4次。D：束缚：将大鼠放入由铁丝制成的束缚笼中，笼长约25 cm，直径约5 cm。大鼠进入笼内后，两端夹紧以固定大鼠并限制其活动，每日1次，持续2小时）。此外，在第1天和第10天，大鼠皮下注射苯甲酸雌二醇5.0 mg/kg/天；在第2–9天，注射剂量为2.5 mg/kg/天。

从苯甲酸雌二醇注射的第5天开始，除布洛芬组每日上午10:00给药一次外，其余各组大鼠每日上午10:00和下午4:00分别经口灌胃给予不同药物，持续7天。空白组、模型组和TEAP组大鼠给予2.5 mL/kg的生理盐水。SDD组和TEAP+SDD组大鼠给予2.5 mL/kg的SDD（配制方法：将106 g生药溶于200 mL水中，浓度为0.53 g/mL）；该剂量根据体表面积等效原则，由成人临床日用量106 g换算得到大鼠等效剂量。布洛芬组大鼠给予0.02 g/kg的布洛芬混悬液。TEAP组和TEAP+SDD组大鼠从苯甲酸雌二醇注射后的第5天开始接受TEAP刺激。根据既往报道的大鼠穴位定位标准¹²，将电极连接至双侧夹肝、神门、内生殖器和内分泌耳穴。这些穴位位于双侧耳甲腔内，由迷走神经支配。电极连接电子针疗仪，以连续波刺激20分钟（频率：20 Hz；强度：1 mA），每日一次。TEAP+SDD组大鼠每日在首次SDD灌胃后接受TEAP刺激。最后一次TEAP刺激在腹腔注射OT前进行。

在最后一次苯甲酸雌二醇注射后24 h（即第11天），除空白组和TEAP组外，其余各组大鼠在最后一次灌胃给药1 h后，均通过腹腔注射给予2 U/只的催产素（OT）。TEAP组大鼠在最后一次TEAP刺激结束后接受2 U/只剂量的OT腹腔注射。空白组大鼠不给予OT注射。该方案成功建立了气虚血瘀型乳腺增生病（QSBSPD）大鼠模型。整体动物筛选、模型制备、给药方案、TEAP刺激参数及耳穴定位详见图1。

瑞氏-吉姆萨染色

通过阴道涂片的Wright-Giemsa染色确定动情周期。使用无菌棉签蘸取0.9%氯化钠溶液，轻轻插入阴道管腔内0.5–1.0 cm处，旋转1–2次以收集阴道脱落细胞。将样本单向均匀涂布于洁净的玻璃载玻片上，在室温下自然干燥。加入Wright-Giemsa染色液覆盖涂片，孵育5分钟。随后向染色液中加入等体积的磷酸盐缓冲液，继续染色5分钟。用超纯水轻轻冲洗载玻片三次，自然干燥后在光学显微镜下观察。根据占主导地位的细胞类型（包括有核上皮细胞、角化上皮细胞和白细胞）判定动情周期的阶段。

样品采集

将大鼠放入异氟烷浓度设定为3%至5%的麻醉诱导箱中。大鼠失去意识后，将其转移至手术台，并通过面罩维持麻醉状态，此时麻醉浓度降低至1.5%至2.5%。使用剪刀修剪大鼠腹部的毛发，随后用酒精进行局部消毒。沿腹部正中线做一条2–3 cm的切口。将一侧子宫连同其韧带牵出体外，去除附着在子宫表面的脂肪组织，然后仔细分离子宫组织。 若采样后大鼠仍存活，应使用CO₂窒息法实施安乐死。

苏木精-伊红（HE）染色

子宫组织经固定后，用石蜡包埋并切成5 µm厚的切片。切片先后在二甲苯中脱蜡两次，每次10分钟。随后依次在无水乙醇中浸洗两次，每次5分钟，再分别在95%、90%、80%和70%乙醇中各浸洗5分钟进行梯度水化。切片用超纯水冲洗。苏木精染色5分钟，然后用水冲洗至无多余染料残留。切片置于磷酸盐缓冲液中5分钟以促蓝。随后用伊红染色1分钟，并用水冲洗。接着，切片依次在95%乙醇和无水乙醇中各脱水10分钟，在二甲苯中透明10分钟，最后用中性树胶封片。使用光学显微镜或数字切片扫描仪采集代表性图像。

酶联免疫吸附测定（ELISA）

新鲜的子宫组织用预冷的磷酸盐缓冲液冲洗，以去除残留血液。每个组织样本称重后切成小块，并按1:9的组织与缓冲液体积比在预冷的磷酸盐缓冲液中进行匀浆。匀浆液在4 °C条件下以5000 × g 离心5–10分钟，收集上清液用于后续分析。采用大鼠ELISA试剂盒按照制造商说明书检测IL-1β、IL-6、TNF-α、PGF2α和PGE2的水平。所有试剂和微孔条在使用前均平衡至室温。将标准品或样本（50 µL）加入指定孔中。除空白孔外，每孔加入100 µL辣根过氧化物酶标记的检测抗体，密封后于37 °C孵育60分钟。弃去液体，每孔用稀释后的洗涤缓冲液洗涤5次。随后，每孔加入50 µL底物A和50 µL底物B，于37 °C避光孵育15分钟。每孔加入终止液（50 µL），并在15分钟内于450 nm波长处测定各孔的光密度值。根据标准曲线计算样本浓度。

定量实时 PCR（qRT-PCR）

使用总RNA提取试剂，按照制造商说明书从子宫组织中提取总RNA。简言之，将组织在液氮中研磨，加入1 mL RNA提取试剂。裂解液在室温下孵育5分钟。然后加入氯仿（200 µL），剧烈振荡15秒，室温孵育5分钟，于4 °C以12,000 × g 离心12分钟。将水相转移至新离心管中，与等体积异丙醇轻轻混匀，于−20 °C孵育15分钟。样品在4 °C以12,000 × g 离心10分钟，弃上清，用75%乙醇洗涤RNA沉淀。沉淀空气干燥后溶于无RNase的水中。使用微量分光光度计测定RNA浓度和纯度。根据逆转录试剂说明书去除基因组DNA并合成cDNA。基因组DNA去除步骤：将总RNA与基因组DNA去除试剂在42 °C孵育5分钟，然后置于冰上。逆转录反应在50 °C进行15分钟，随后在75 °C孵育5分钟以终止反应。

采用基于SYBR Green的qPCR预混液进行实时PCR。每个20 µL反应体系包含2 µL cDNA、0.4 µL正向引物、0.4 µL反向引物、10 µL 2× SYBR qPCR预混液以及7.2 µL无核酸酶水。qPCR扩增程序如下：95 °C预变性1 min；随后进行40个循环，每循环包括95 °C变性20 s、56 °C退火20 s和72 °C延伸38 s；最后进行熔解曲线分析。以GAPDH作为内参对照，采用2^−ΔΔCt法计算相对mRNA表达量。每个生物学样本均设置技术重复三次。取技术重复三次的Ct值平均值，用于计算每个生物学重复的ΔCt及相对mRNA表达量。引物序列如下：PPAR-γ2，正向引物5′-CGGAAGCCCTTTGGTGACTT-3′，反向引物5′-CTCGATGGGCTTCACGTTCA-3′；COX-2，正向引物5′-AACCAGGTGAACTTCGTCTATTAG-3′，反向引物5′-GGTCGGTTTGATGTCACTGTA-3′；GAPDH，正向引物5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，反向引物5′-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACTC-3′。

统计学分析

数据采用统计学软件进行分析。所有定量数据均以均值 ± 标准差表示。对于qRT-PCR分析，首先对每个生物学重复的技术重复三次取均值，然后基于生物学重复的数值进行统计分析。当数据满足正态性及方差齐性假设时，多组间比较采用单因素方差分析，随后进行Bonferroni事后检验。统计学显著性定义为 P < 0.05。

结果

大鼠动情周期的检测

Wright-Giemsa 染色结果显示，动情前期的阴道涂片主要表现为有核上皮细胞，伴有少量角质形成细胞。这些上皮细胞的细胞核染色较浅、体积增大，并出现溶解迹象。动情期的涂片特征为大量脱落的角化上皮细胞占主导。动情后期的涂片中含有大量角化上皮细胞，同时存在少量白细胞。乏情期的涂片则以大量白细胞和黏稠度较低的液体增多为特征（图2）。结果表明，大鼠的动情周期为4–5天，符合本研究的纳入标准。

TEAP 与 SDD 联合应用对 QSBSPD 大鼠子宫病理形态的影响

如图3所示，在空白组中，子宫上皮细胞排列规则，未见明显病变，固有层中可见少量中性粒细胞（蓝色箭头指示）。在模型组中，大量子宫内膜上皮细胞出现空泡变性和坏死（红色箭头指示），而固有层中仅见少量中性粒细胞浸润（蓝色箭...

讨论

原发性痛经（PD）是指在月经来潮前及经期出现的下腹部疼痛，且生殖系统或盆腔区域无任何可识别的器质性损伤¹。根据调查，全球约有45%–90%的女性经历过痛经，其中10%至25%患有重度痛经¹³。因此，迫切需要寻找更安全、更有效的原发性痛经干预措施，并进一步阐明其潜在的作用机制。

目前，建立大鼠PD模型的既定方案是通过给予雌激素和催产素（OT）来模拟痛经症状。该方法包括初始致敏阶段，随后诱导疼痛¹⁴。在整个动情周期中，子宫的功能状态和激素水平呈现显著波动。值得注意的是，在动情间期，激素影响最小化，从而导致大鼠的行为模式更加一致¹⁵。本研究中，模型组大鼠的子宫病理损伤较空白组大鼠更为明显，支持了QSBSPD模型的成功建立。

根据中医理论，血瘀型痛经（QSBSPD）是痛经（PD）的主要证型¹⁶，其特...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% 氯化钠溶液	黑龙江齐齐动物保健品有限公司	240314A03	组织清洗与样品制备
1× 磷酸盐缓冲液（PBS）	Biosharp	BL601A	组织清洗、ELISA 匀浆及染色步骤
声学与光刺激系统	动物实验设施内定制构建	定制构建	在QSBSPD模型构建过程中联合应激刺激
粘附性显微镜载玻片	江苏赛滔实验耗材制造有限公司	80312-3161	石蜡切片与阴道涂片的制备
全自动数字切片扫描仪	广州光盈细胞科技有限公司	GCell-60	HE染色切片的数字成像
自动组织脱水机	湖北孝感阔海医疗科技有限公司	KH-TS	石蜡包埋前的组织脱水
生物显微镜	尼康	E200MV	阴道涂片与染色组织切片的观察
CO2 气体钢瓶和安乐死舱	中国福州中医医院动物中心	机构 CO2 系统	动物安乐死
包埋站用冷台	湖北孝感阔海医疗科技有限公司	KH-BL	石蜡包埋
冷冻研磨机	上海精兴工业发展有限公司	TISS-24	组织匀浆化
当归（Angelica sinensis 根）	广东一方制药有限公司	A1070343	SDD 成分；浓缩颗粒
DEPC处理水	Meilunbio	MA0018	qRT-PCR 试剂
电子针灸治疗仪	苏州医疗器械厂有限公司	SDZ-II	TEAP 刺激与电刺激
电子分析天平	赛多利斯（北京）科技有限公司	BS 224S	样品与试剂称量
伊红	Epredia	7111	HE染色
盐酸肾上腺素	TargetMol	119091	QSBSPD 模型构建
苯甲酸雌二醇	Sigma-Aldrich	E8515	QSBSPD 模型构建
乙醇	Xilong Scientific Co., Ltd.	240403A1	组织处理与脱水
桂枝	广东一方制药有限公司	A2060533	SDD 成分；浓缩颗粒
苏木精	Epredia	7211	HE染色
布洛芬混悬液	上海强生 &安普与强生制药有限公司	H20000359	阳性对照药物；20 mg/mL
刘金奴（异常蒿草）	广东一方制药有限公司	A210A413	SDD 成分；浓缩颗粒
低速迷你离心机	湖南湘仪实验室仪器开发有限公司	WTL-4K	样品制备
微型制冷离心机	贝克曼库尔特	Microfuge 22R	RNA提取与组织匀浆制备
酶标仪	广东丹力科技有限公司	K3	ELISA 在 450 nm 处的吸光度测量
显微镜盖玻片	江苏赛滔实验器材制造有限公司	80340-1630	显微镜载玻片制备
霉菌培养箱	上海立辰邦西仪器科技有限公司	W0704	染色或检测过程中的孵育
没药（Moyao）	广东一方制药有限公司	1107853	SDD 成分；浓缩颗粒
中性树胶	Meilunbio	MB9899	染色组织切片的封片
NovoScript Plus 一体化第一链cDNA合成超混合液	Novoprotein	E047-01A	逆转录
NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus	Novoprotein	E096-01B	qRT-PCR 扩增
催产素注射	安徽丰原药业股份有限公司	220906-4	QSBSPD 模型诱导
石蜡	华玲	20220918	石蜡包埋
PCR系统	伯乐（Bio-Rad）	PTC-100	PCR相关实验步骤
蒲黄（香蒲花粉）	广东一方制药有限公司	A2092143	血府逐瘀汤成分；浓缩颗粒；失笑散的组分
PPAR 的 qRT-PCR 引物γ2, COX-2, 和 GAPDH	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	定制合成	qRT-PCR 引物
大鼠IL-1β ELISA试剂盒	美免生物科技	MM-0047R2	ELISA试剂盒
大鼠IL-6 ELISA试剂盒	美免生物技术	MM-0190R2	ELISA试剂盒
大鼠PGE2 ELISA试剂盒	美免生物技术	MM-0068R2	ELISA试剂盒
大鼠PGF2α ELISA试剂盒	美免生物技术	MM-0230R2	ELISA试剂盒
大鼠固定笼	动物实验设施内定制构建	定制构建	构建QSBSPD模型期间的束缚应激
大鼠 TNF-α ELISA试剂盒	美免生物科技	MM-0180R2	ELISA试剂盒
实时荧光定量PCR系统	应用生物系统公司	7300	qRT-PCR 分析
RNAiso Plus	TaKaRa	9109	总RNA提取
旋转式切片机	赛默飞世尔科技	HM325	石蜡切片
石见穿（丹参草）	广东一方制药有限公司	A3052113	SDD 成分；浓缩颗粒
斯普拉格–Dawley大鼠	北京维通利华实验动物技术有限公司	SCXK（京）2019-0010	动物模型构建
组织包埋盒	江苏赛滔实验耗材制造有限公司	23033	石蜡切片耗材
组织包埋机	湖北孝感阔海医疗科技有限公司	KH-BL	石蜡包埋
组织漂浮浴与载玻片加热台	湖北孝感阔海医疗科技有限公司	KH-P2	石蜡切片贴附
超低温冰箱	中科美菱低温科技有限责任公司	DW-HL340	样品储存
超微量紫外-可见分光光度计	北京百泰克生物技术有限公司	ND5000	RNA浓度与纯度测定
超纯水系统	四川德立科技有限公司	SP-D2-V-10LS	超纯水的制备
威灵仙（棉团铁线莲根及根茎）	广东一方制药有限公司	A2030543	SDD 成分；浓缩颗粒
瑞氏-吉姆萨染色	Solarbio	G3005	动情周期筛查
五灵脂（鼯鼠粪）	广东一方制药有限公司	A2082223	血府逐瘀汤成分；浓缩颗粒；失笑散的组分
香附（莎草根茎）	广东一方制药有限公司	A2069413	SDD 成分；浓缩颗粒
小茴香（茴香果实）	广东一方制药有限公司	A1125153	SDD 成分；浓缩颗粒
二甲苯	Xilong Scientific Co., Ltd.	240124A2	脱蜡与组织透明化
延胡索（Corydalis yanhusuo 块茎）	广东一方制药有限公司	A2032983	SDD 成分；浓缩颗粒