Xenopus 早期胚胎发生过程中新生转录组的代谢标记

摘要

我们提供了用于转录组分析中新生转录本的代谢标记与纯化的详细方法 非洲爪蟾 使用5-乙炔基尿苷（5-EU）标记早期胚胎。

摘要

早期胚胎发育需要在受精后，从最初处于沉默状态的合子基因组中启动合子基因的新转录。目前面临的主要挑战是准确检测新转录的RNA并确定其在合子基因组激活（ZGA）过程中的表达时间。本文提供了利用5-乙炔基尿苷（5-EU）对早期Xenopus laevis胚胎中新合成的转录本进行代谢标记的详细实验步骤。在受精后，将5-EU微量注射至单细胞期胚胎中，以在ZGA期间对新转录的RNA进行代谢标记。随后通过点击化学介导的生物素化反应富集新合成的EU标记RNA，并利用高通量测序技术确定新生转录组。该方法具有高灵敏度和高特异性，能够有效鉴定低水平激活的基因。因此，该技术为研究早期发育过程中基因转录的动态变化提供了强有力的工具，并可推广应用于其他胚胎系统或组织。

引言

受精后，胚胎由卵细胞中储存的母源因子控制，而合子基因组在一段时间内处于转录沉默状态；随后被激活，转录数百至数千个对后续发育至关重要的基因，包括细胞命运决定和胚层形成相关的基因^1,2,3,4,5,6。这种在母源-合子转换（MZT）过程中发生的合子基因组激活（ZGA）现象在所有后生动物物种中高度保守，尽管不同物种中ZGA的发生时间有所不同^1,2,3,4,5,6。理解ZGA的调控机制不仅有助于揭示早期发育的基本规律，也为发育障碍的诊断与治疗新策略的开发以及生殖健康的提升提供了潜在可能。

研究合子基因组激活（ZGA）的一个主要挑战在于如何准确检测新转录的RNA并确定其在合子基因组激活过程中的起始时间。由于早期胚胎中母源转录本占主导地位⁷，这些高丰度的母源转录本会掩盖ZGA期间新转录本的检测，特别是对于那些低水平激活的基因，使用传统的群体RNA测序（bulk RNA-seq）方法尤为困难。为克服这一挑战，我们开发了一种通过代谢标记新生转录本来测量新生转录组的方法：利用5-乙炔基尿苷（5-EU）对新生转录本进行标记，随后通过点击化学反应将新生的EU-RNA进行生物素化，并纯化用于测序（EU-RNA-seq）^8,9,10。与其他新生转录本分析方法（如使用4-硫代尿苷（4sU）的方法）^11,12相比，5-EU标记通过点击化学具有高度特异性，既可用于成像也可用于测序，且无需化学转化步骤。此外，新生EU-RNA-seq具有高度敏感性，能够检测到数百个基因的激活，而这些基因的激活无法通过传统的群体RNA-seq检测到⁸。该方法还使我们能够准确确定各个合子基因激活的起始时间，并描绘出早期胚胎发育过程中ZGA特有的时空动态模式⁸。

我们在此描述了用于制备EU-RNA-seq样品的详细步骤，以分析新生转录组 非洲爪蟾 早期胚胎作为模型。本方案改编自先前的方法^10,13 通过优化实验流程，包括将5-EU显微注射至1细胞期胚胎、利用点击化学反应对新生EU-RNA进行生物素标记，并纯化用于测序图1）。为了确保可重复性，应根据早期胚胎中新生转录本丰度的不同发育阶段，使用1–10 µg的总RNA作为起始材料，尽管也可使用更低的量。本方案可应用于其他胚胎系统，例如 果蝇¹⁴ 和斑马鱼¹⁵以及其他组织¹³该方法是我们理解各种生物过程中基因转录与调控机制的有力工具，包括揭示早期胚胎发育的新规律。

方案

本研究中涉及的动物实验已获得南卡罗来纳大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。实验室安全与废弃物处理应遵守机构相关规定。

1. 试剂与缓冲液的配制

1. 20倍浓度MMR（Marc改良Ringer溶液）：配制100 mM HEPES、2 mM EDTA、2 M NaCl、40 mM KCl、20 mM MgCl₂ 和40 mM CaCl₂ 的混合溶液。用NaOH调节pH至7.8。经高压灭菌后，室温保存。
2. 3% Ficoll（w/v）/0.5倍浓度MMR：在50 mL 0.5倍浓度MMR溶液中，边轻轻磁力搅拌边缓慢加入1.5 g Ficoll 400，直至Ficoll完全溶解。高压灭菌后，4 °C保存备用。
3. 5-乙炔基尿苷（5-EU）储备液：配制50 mM储备液时，向5 mg的试剂瓶中加入372.8 µL缓冲液（注意：可使用任何适用于显微注射的缓冲液，例如pH 7.6的1x TBS）。充分混匀后分装为每份2 µL。-80 °C保存。

2. 将5-EU显微注射至1细胞胚胎

1. 为了获得 非洲爪蟾 胚胎，遵循标准方案进行 体外 体外受精（IVF）（例如，参见 Sive 等，2007）¹⁶胚胎应置于0.1x MMR中，备用。
2. 向由标准玻片（25 mm × 75 mm）制成的显微注射 chamber 中加入 1 mL 3% Ficoll/0.5x MMR。使用塑料移液管将 20 个（或根据需要更多）胚胎转移至显微注射 chamber 的中央。
3. 使用精细镊子小心剪断玻璃针极细的尖端，将针垂直（尖端朝下）插入工作台壁上黏土中固定。用P2移液器配合微加载吸头，从玻璃针顶部加入0.5 µL的50 mM 5-EU溶液。
4. 将针头安装到显微操作仪上。使用P10移液器在载物台测微尺上加入10 µL 卤代烃油，并置于体视显微镜下。
5. 为校准注射体积，首先用脚踩下与显微注射仪相连的地面脚踏板，将一滴液体注入微米尺上的卤代烃油中。根据液滴大小，调节显微注射仪的压力和注射时间，使注射体积确定为10 nL，即在微米尺上显示的液滴直径为0.27 mm。
6. 一手用镊子固定胚胎，另一手持显微操作仪，向1细胞期胚胎注射10 nL的50 mM EU溶液。胚胎中5-EU的最终浓度约为0.5 mM。
7. 显微注射后，使用塑料移液管将胚胎从注射槽转移至含有3% Ficoll/0.5x MMR的新玻璃培养皿中。将注射后的胚胎在Ficoll中保持约1小时。
8. 小心移除Ficoll溶液，并用0.1x MMR替换培养基。将胚胎保存在0.1x MMR中直至后续使用。持续观察胚胎发育情况，必要时去除任何异常胚胎。
9. 当胚胎发育至目标阶段时，使用塑料移液管将10个胚胎转移至1.5 mL离心管中。用P200移液器小心吸除管中残留培养基，并在液氮中迅速冷冻胚胎。
   注意：为确保实验的严谨性和可重复性，仅收集在形态上与对照组相比正常的胚胎。将任何异常胚胎移除并排除在后续分析之外。如有需要，还可收集相同数量未经显微注射的胚胎作为阴性对照。
10. 将胚胎保存于 -80 °C 超低温冰箱中，以备后续使用。

3. 总RNA提取与浓度测定

注意：使用基于二氧化硅膜的总RNA提取试剂盒从早期胚胎中分离总RNA，并使用基于荧光的高灵敏度RNA定量试剂盒测定RNA浓度。请遵循试剂盒提供的说明书，以下步骤略作修改自该说明书。后续步骤中使用的所有溶液和试剂均应为无RNase的。

1. 将样品从 -80 °C 冰箱中取出并置于冰上。
2. 向每根试管中加入 700 µL RNA 提取试剂盒中的 Buffer RLT。使用 P1000 移液器上下吹打至少 15 次，或直至所有胚胎完全溶解。
3. 将样品置于冰上孵育 20 分钟。再次轻轻上下吹打至少 10 次，以彻底均质化胚胎组织。
4. 向均质化的胚胎样品中加入 700 µL 70% 乙醇。上下吹打混匀，然后将 700 µL 混合液转移至离心柱中。
5. 以 10,000 ×g 离心 1 分钟。弃去穿流液。重复离心操作，直至所有混合液均通过离心完成过滤。
6. 加入 350 µL Buffer RW1，以 10,000 ×g 离心 1 分钟。弃去穿流液。
7. 小心地将 80 µL DNase I 加入离心柱膜的中央。室温孵育 15 分钟。
8. 加入 350 µL Buffer RW1，以 10,000 ×g 离心 1 分钟。弃去穿流液。
9. 加入 500 µL Buffer RPE，以 10,000 ×g 离心 1 分钟。弃去穿流液。重复洗涤一次。
10. 将离心柱再次以 10,000 ×g 离心 2 分钟，以干燥膜。
11. 将离心柱转移至新的无 RNase 的离心管中。小心地将 35 µL 无 RNase 的 H₂O 加入离心柱膜的中央。
12. 以 10,000 ×g 离心 1 分钟。收集洗脱的 RNA，并置于冰上保存。
13. 为测定 RNA 浓度，首先使用 RNA 定量试剂盒配制工作液：将 RNA 试剂（染料）用 RNA 缓冲液按 1:200 比例稀释。根据标准品和样品总数计算所需工作液总体积，每份标准品或样品准备 200 µL。
14. 准备一个 0.2 mL 8 孔联排管。稀释各标准品时，取 10 µL 加入 190 µL 工作液中；稀释各样品时，取 1 µL 加入 199 µL 工作液中。充分混匀。
15. 将 8 孔联排管放入荧光计中。选择 RNA 检测程序，用标准品校准后读取各样品的浓度。

4. 新生EU-RNA的生物素标记与纯化

注意：使用基于点击化学的新生RNA捕获试剂盒对新生的EU-RNA进行生物素标记并进行下拉富集。请遵循试剂盒提供的说明书，以下步骤略有修改。未注射的胚胎RNA以及未进行生物素标记的EU-RNA可作为下拉特异性的背景对照。

1. RNA 生物素标记与纯化
   1. 每个样品，在一个 1.5 mL 微量离心管中混合以下组分，配制 50 µL 的点击反应体系：总 RNA（1–10 µg）、1× EU 缓冲液、2 mM CuSO₄、0.25 mM 生物素叠氮化物、10 mM 添加剂 1 和 12 mM 添加剂 2。
   2. 将反应混合物置于室温下，在振荡器上孵育 30 分钟。
   3. 在上述每个反应体系中加入 1 µL 糖原、50 µL 7.5 M 醋酸铵和 700 µL 预冷的 100% 乙醇。用移液器上下吹打 5 次以充分混匀。
   4. 将离心管放入 -80 °C 冰箱中，过夜保存。
   5. 在 4 °C 下以 13,000 xg 离心 20 分钟。小心弃去上清液，避免扰动沉淀。
   6. 加入 700 µL 75% 乙醇，轻轻混匀以重悬沉淀。在 4 °C 下以 13,000 xg 离心 5 分钟。小心弃去上清液，避免扰动沉淀。再重复洗涤一次。
   7. 将沉淀在室温下空气干燥 5–10 分钟。用 10 µL 无 RNase 的 H₂O 重悬沉淀。
2. EU-RNA 纯化
   1. 为富集新生 EU-RNA，每个样品在新的 1.5 mL 微量离心管中加入 5 µL 链霉亲和素包被的磁珠。
   2. 加入 9 µL 洗涤缓冲液 2，充分混匀后将离心管置于磁力架上，静置 2 分钟。弃去上清液。重复洗涤两次。最后用 5 µL 洗涤缓冲液 2 重悬磁珠。
   3. 在新的 1.5 mL 微量离心管中配制以下主混合液（每个样品 15 µL）：12.5 µL RNA 结合缓冲液（组分 G）、0.2 µL 1:10 稀释的 RNase OUT 和 2.3 µL 无 RNase 的 H₂O。向每个含有 RNA 样品的离心管中加入 15 µL 该混合液。
   4. 在 69 °C 的金属浴中孵育 5 分钟。将离心管置于冰上冷却。
   5. 向每个含有 RNA 样品的离心管中加入 5 µL 上述预洗涤的磁珠。在室温下置于振荡器上孵育 30 分钟。
   6. 加入 50 µL 洗涤缓冲液 1。充分混匀后将离心管置于磁力架上，静置 2 分钟。弃去上清液。再重复洗涤 4 次。
      注意：第一次洗涤后的上清液（可能仅含有母源转录本）可用于检测母源转录组。
   7. 加入 50 µL 洗涤缓冲液 2。充分混匀后将离心管置于磁力架上，静置 2 分钟。弃去上清液。再重复洗涤 4 次。
   8. 用 5 µL 洗涤缓冲液 2 重悬磁珠。含有新生 EU-RNA 的磁珠可直接用于 cDNA 合成与文库构建。
      注意：在进行文库构建前，可通过逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测已知特定基因的表达水平，以评估新生转录本的富集效果。

5. RNA文库构建与测序

1. 使用市售试剂盒制备cDNA文库，并遵循试剂盒提供的说明。使用NEBNext Library Quant Kit for Illumina对文库进行定量并合并文库。
2. 根据常用的新一代测序试剂盒说明书合并文库。在将文库上机至台式测序仪前，将其稀释至约1.8 pM，以在测序过程中获得约200k/mm²的最佳簇密度。使用常用的新一代测序技术进行测序，对每个样本采用双端75 bp测序，获得约2000万条读段。
3. 使用salmon¹⁷将测序序列比对至Xenopus laevis基因组版本9.2，以量化转录组读段，并使用DESeq2¹⁸进行差异基因表达分析。为在基因组浏览器中可视化峰图，使用STAR¹⁹将序列比对至基因组，并在Integrative Genomics Viewer (IGV)¹⁹中展示。

结果

Xenopus laevis 胚胎（四个生物学重复）在受精后 5 至 9 小时（22 °C）的不同发育阶段，涵盖了从第 5 阶段（合子基因激活程度较低）到第 9 阶段（合子基因高度激活）的时期，按照上述方案进行处理⁸。提取的总 RNA、纯化的新生 EU-RNA 以及流穿 RNA 用于文库构建并进行测序。如图 2所示，通过比较 6–9 hpf 与 5 hpf 时期的新生转录组，发现在 6 至 9 hpf 期间，差异激活的基因数量逐渐增加（图 2A），表明利用新生 EU-RNA-seq 成功捕获了合子基因激活（ZGA）过程。此外，与总 RNA-seq 相比，新生 EU-RNA 能更早且在更高水平上检测到合子基因的表达（图 2B），说明新生 EU-RNA 在检测合子基因方面具有更高的灵敏度。进一步地，在流穿 RNA-seq 中几乎未检测到这些合子基因的转录本，表明新生 RNA-seq 在描绘 ZGA ...

讨论

本文提供了在早期胚胎发生过程中对新生转录组进行代谢标记的详细方案，包括将5-EU显微注射至单细胞胚胎中、提取总RNA并测定其浓度，以及对新生的EU-RNA进行生物素标记和纯化，用于文库构建和测序（EU-RNA-Seq）（图1）。由于该方法相较于总RNA测序具有更高的灵敏度和特异性，本方案不仅使我们能够准确测定合子基因组激活（ZGA）过程中新生转录组的表达水平及其起始时间，还可揭示单个基因在早期胚胎发育过程中的新时空激活模式^8,9。

在执行本方案之前，必须考虑并确定实验设计中的各项参数，例如纳入分析的重复次数和胚胎数量。为确保科学严谨性和可重复性，应使用多个胚胎（至少5个胚胎），且每个实验至少包含两窝胚胎（生物学重复）。此外，为保证胚胎的高质量，建议仅使用体外受精（IVF）效率>90%的胚胎。

根据具体的胚胎系统，应优化微注射到胚胎中的5-EU浓...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
µPUPM 显微注射仪	World Precision Instruments	UPUMP	用于显微注射（通过压力进行显微注射）
5-乙炔基尿苷	赛默飞世尔科技	E10345	用于显微注射（标记新生转录本）
ACCU-SCOPE 3075 变倍体视显微镜	VWR	470351-130	用于显微注射（观察胚胎）
乙酸铵	Sigma-Aldrich	A2706	用于RNA沉淀
抗坏血酸	Sigma-Aldrich	A7506	用于点击反应
硼硅酸盐玻璃毛细管	世界精密仪器公司	TW100-4	用于显微注射（制备玻璃针）
离心	Eppendorf	5425R	用于离心机
Click-iT 新生RNA捕获试剂盒	赛默飞世尔科技	C10365	用于生物素标记和纯化新生RNA
CuSO₄	Sigma-Aldrich	61230	用于点击反应
DNase I	罗氏诊断	4716728001	用于RNA提取
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	GE17-0300-10	用于显微注射（孵育胚胎）
玻璃培养皿（60 毫米）	VWR	75845-542	用于受精
糖原	赛默飞世尔科技	AM9510	用于RNA沉淀
卤代烃油 27	Sigma-Aldrich	H8773	用于显微注射（校准注射体积）
L-半胱氨酸	Sigma-Aldrich	168149	用于去除胚胎胶膜
微载样头	Calibre Scientific	EPE-5242956003	用于显微注射（将5-EU加载至玻璃针中）
NEBNext文库定量试剂盒（适用于Illumina）	NEB	E7630	用于文库定量
NSQ 500/550 高输出 KT v2.5（75 CYS）	Illumina	20024906	用于测序
Qubi Flex 荧光计	赛默飞世尔科技	Q33327	用于测定 RNA 浓度
Qubit RNA HS 结合试剂盒	赛默飞世尔科技	Q32852	用于测定 RNA 浓度
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	用于RNA提取
阶段测微尺	沃德科学	470175-914	用于显微注射（校准注射体积）
使用 NuQuant 进行通用 RNA 测序	NuGEN	0364	用于文库构建