需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

在早期胚胎的单细胞中可视化合子基因组激活

397 次观看

⸱

DOI：

10.3791/70592

⸱

2026年4月3日

 , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

本文内容

摘要

我们描述了在早期胚胎发育过程中，于单细胞水平上可视化合子基因组激活期间新生转录的方法。

摘要

早期胚胎发育需要经历母源-合子转换（MZT），该过程依赖于合子基因组的激活（ZGA）。在ZGA过程中，数百至数千个基因被转录，这对于早期胚胎发育的多个过程至关重要，包括维持胚胎存活、细胞命运决定以及胚层形成。研究ZGA的一个主要挑战在于如何在早期胚胎的单个细胞中直接可视化ZGA。本文介绍了一种通过代谢标记新生转录本以直接观察早期胚胎单细胞中ZGA的方法：利用5-乙炔基尿苷（5-EU）标记新生RNA，随后通过点击化学反应将新生的EU-RNA与荧光染料偶联，并利用共聚焦显微镜在整体胚胎中进行成像，以Xenopus laevis为模型生物。该方法使我们能够在整体胚胎中追踪单细胞水平的ZGA，并揭示ZGA在早期胚胎发育过程中时空上的异质性启动特征。该技术也可应用于其他胚胎系统或组织，用于在单细胞水平上研究基因转录和基因组调控。

引言

在早期发育过程中，胚胎经历从母源控制向合子基因控制转变的母源-合子转变（maternal-to-zygotic transition, MZT），这一过程逐步将发育调控权从母源因子转移至合子基因。MZT需要激活最初处于沉默状态的合子基因组，该过程称为合子基因组激活（zygotic genome activation, ZGA）；在ZGA期间表达的基因对于早期细胞命运决定、原肠胚形成以及体轴建立至关重要1,2。重要的是，ZGA在所有后生动物中均保守存在，且其发生时间受到严格调控，尽管不同物种之间存在差异3,4。ZGA的失调可导致严重后果，从发育缺陷到胚胎死亡（如流产）不等。因此，研究ZGA的机制不仅对理解基因调控的基本原理具有重要意义，也具有重要的临床价值。

研究合子基因组激活（ZGA）的一个主要挑战在于难以直接观察早期胚胎中大规模的ZGA，并在单细胞水平上探究其机制。我们通过建立一种方法克服了这一难题：利用5-乙炔基尿苷（5-EU）对ZGA期间新生转录本进行代谢标记，随后通过点击化学反应将新生的EU-RNA与荧光染料偶联，再结合共聚焦显微镜在整体胚胎中进行可视化观察，并以Xenopus laevis为模型系统。大型的Xenopus胚胎（直径约1.2 mm）具有细胞大小梯度，其大规模ZGA发生在中囊胚期左右（起始于约第7期，峰值出现在约第9期），是研究ZGA时空模式的理想模型5。通过在早期Xenopus胚胎中使用5-EU标记，我们能够直接可视化并定量整体早期胚胎中单个细胞内的大规模ZGA，进而发现了一种主要由细胞大小调控的新型ZGA时空模式5,6。

本文详细描述了该方法的具体步骤，该方法改编自先前的研究工作并进行了优化5,7，包括使用5-EU对新生转录本进行代谢标记后固定胚胎，通过点击化学反应将新生的EU-RNA与荧光染料偶联8，并对亚细胞标志物进行免疫染色，随后对胚胎进行透明化处理以用于共聚焦成像。该方法可应用于其他胚胎系统，如斑马鱼9,10，也可结合测序技术用于新生转录组的分析11，表明其在多种样本类型和分析中具有广泛的适用性。总体而言，该方法为在单细胞水平研究基因组调控机制提供了一种重要的新手段。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本研究所涉及的动物实验已获得南卡罗来纳大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 开始实验方案前的准备

注意：在开始实验方案之前，使用无RNase的水配制以下溶液。

  1. 配制 1× Tris 缓冲盐水（TBS），pH 7.6：含 50 mM Tris-HCl 和 150 mM NaCl。调节 pH 至 7.6。室温保存。缓冲液需在两个月内使用。
  2. 配制含 0.1% Tween 20 的 1× Tris 缓冲盐水（TBST），pH 7.6：将 Triton X-100 以终浓度 0.1%（体积比）加入用无 RNase 水配制的 1× TBS（pH 7.6）中。室温保存。缓冲液需在一个月内使用。
  3. 配制 4% 多聚甲醛（PFA）/1× MEM：取 1 瓶（10 mL）16% PFA 储存液与 4 mL 10× MEM（含 1000 mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸 [MOPS]，pH 7.4，20 mM EGTA 和 10 mM MgSO4）混合，再用无 RNase 水定容至 40 mL。分装后于 -20 °C 保存。溶液需在六个月内使用。
  4. 配制 70%、50% 和 25% 甲醇的 0.5× SSC 溶液：分别按 3:1、1:1 和 1:3 的体积比混合甲醇与 0.5× SSC。溶液需在六个月内使用。
  5. 配制漂白液：用无 RNase 水配制终浓度为 2%（体积比）H2O2、5%（体积比）甲酰胺和 0.5× SSC 的混合溶液。使用前新鲜配制。
  6. 配制封闭液：在 1× TBST 中加入终浓度为 10%（体积比）的山羊血清和 0.2%（重量/体积）的 BSA。于 -20 °C 保存。溶液需在六个月内使用。
  7. 配制 BABB 透明试剂：按 1 份苯甲醇（BA）与 2 份苯甲酸苄酯（BB）的比例混合。室温保存。溶液需在六个月内使用。

2. 固定5-EU显微注射的胚胎

  1. 将5-乙炔基尿苷（5-EU）显微注射至1细胞期胚胎中，操作步骤参照先前所述方法11。让胚胎发育至合子基因组激活（ZGA）所需的阶段，例如第9阶段，此时胚胎大多数细胞正处于活跃的ZGA过程。
  2. 固定经5-EU显微注射的胚胎时，首先在2 mL闪烁玻璃小瓶中加入约1.8 mL的4%多聚甲醛/1× MEM溶液。然后使用塑料移液管将约20个胚胎转移至该玻璃小瓶中。尽量减少带入小瓶中的培养基体积。
  3. 用额外的4%多聚甲醛/1× MEM溶液将玻璃小瓶完全注满。盖紧瓶盖，确保无气泡残留。
  4. 将玻璃小瓶置于旋转仪上，于室温下以低速（例如10 rpm）旋转至少2小时，使胚胎充分固定。
  5. 使用移液器小心吸除固定液，向玻璃小瓶中加入100%甲醇。将小瓶放回旋转仪，以低速旋转5分钟。
  6. 小心吸除甲醇，并加入新鲜甲醇。重复旋转与脱水步骤至少两次，确保胚胎完全脱水。
  7. 将胚胎保存于-20 °C的甲醇中。
    注意：本实验方案可在此处暂停。建议胚胎在甲醇中保存至少2天后再进行后续操作。胚胎可在2个月内使用。

3. 通过点击反应将新生RNA与荧光染料偶联

  1. 为了使胚胎复水，首先从玻璃小瓶中移除甲醇，然后加入 2 mL 含 75% 甲醇的 0.5× SSC 溶液，并盖紧瓶盖。将玻璃小瓶置于旋转仪上，以低速旋转胚胎 5 分钟。
  2. 旋转结束后，移除玻璃小瓶中的液体。依次使用含 50% 甲醇的 0.5× SSC 溶液、含 25% 甲醇的 0.5× SSC 溶液以及 0.5× SSC 溶液重复上述步骤。为彻底完成胚胎复水，需用 0.5× SSC 溶液至少再清洗两次。
  3. 向玻璃小瓶中加入 2 mL 新鲜配制的漂白液（含 2% H2O2 和 5% 甲酰胺的 0.5× SSC 溶液）。将玻璃小瓶置于铝箔上，然后放置在 LED 光源下，保持适当距离以避免样品过热。
  4. 在光照下进行漂白，直至所有色素变为白色，通常需要 5–6 小时。注意，由于 H2O2 分解为 O2，会产生微小气泡，可能导致胚胎上浮。需定期检查胚胎（例如每 30 分钟一次），并轻轻旋转玻璃小瓶，使胚胎重新沉入漂白液中。
  5. 小心移除漂白液。加入 2 mL 0.5× SSC 溶液快速冲洗胚胎。如有必要，重复快速冲洗一次。
  6. 向玻璃小瓶中加入 2 mL 1× TBST 溶液。将玻璃小瓶置于旋转仪上，以低速旋转胚胎 1 小时。旋转结束后，移除玻璃小瓶中的液体。
  7. 至少重复上述步骤 5 次。注意，胚胎的充分洗涤对后续步骤至关重要。
  8. 向玻璃小瓶中加入 2 mL 1× TBS 溶液。将玻璃小瓶置于旋转仪上，以低速旋转胚胎 5 分钟。旋转结束后，移除玻璃小瓶中的液体。
  9. 再重复上述步骤一次。
  10. 在 1.5 mL 微离心管中配制点击反应混合液，加入以下试剂，使其终浓度分别为 100 mM Tris-HCl（pH 8.5）、1 mM CuSO4、25 µM 四甲基罗丹明（TAMRA）-叠氮化物和 100 mM 抗坏血酸。抗坏血酸应最后加入反应体系。用移液器反复吹打以充分混匀。
  11. 向玻璃小瓶中的胚胎加入 200 µL 反应混合液。确保反应液体积足以完全浸没小瓶中的所有胚胎。在避光条件下室温孵育 12 小时。
  12. 小心移除点击反应混合液。注意，此时可能观察到胚胎上有非特异性荧光。用 1× TBST 快速冲洗胚胎两次，然后按照上述方法，每 1 小时更换一次溶液，至少用 1× TBST 清洗 5 次。
  13. 继续更换 1× TBST 溶液，每 2 小时一次，在 4 °C 下置于旋转仪上过夜。当几乎观察不到非特异性荧光时停止洗涤。注意，由于点击反应残留物可能对后续免疫染色造成干扰，因此在进入下一步前，必须确保胚胎已彻底洗涤 1–2 天。

4. 胚胎的亚细胞标记物免疫染色（可选）

  1. 为封闭胚胎，移除上述最后洗涤步骤中的 1× TBST，加入 200 µL 封闭液（10% 山羊血清/0.2% BSA/1× TBST）。用铝箔纸包裹玻璃小瓶，以保护胚胎免受光照。将玻璃小瓶置于摇床上，在室温下轻轻摇动至少 1 小时（或在 4 °C 下过夜）。
  2. 用 200 µL 的 10% 山羊血清/1× TBST 将一抗（例如抗 H3 抗体）按 1:1,000 比例稀释。将稀释后的一抗加入玻璃小瓶中，并用铝箔纸包裹小瓶。在 4 °C 下于摇床上以低速孵育胚胎过夜。
  3. 小心移除玻璃小瓶中的抗体。通过向玻璃小瓶中加入 2 mL 1× TBST 并弃去液体，快速冲洗胚胎两次。
  4. 向玻璃小瓶中加入 2 mL 1× TBST，然后用铝箔纸包裹小瓶。将玻璃小瓶置于旋转器上，以低速旋转胚胎 1 小时。旋转结束后弃去小瓶中的液体。
  5. 重复上述步骤至少 5 次。
  6. 用 200 µL 的 10% 山羊血清/1× TBST 将二抗（例如兔源 Alex Fluor 488 抗体）按 1:1,000 比例稀释。如需进行 DNA 染色，可将 DNA 染料（例如 TO-PRO-3）与二抗一同稀释。
  7. 将稀释后的抗体加入玻璃小瓶中，并用铝箔纸包裹小瓶。在 4 °C 下于摇床上以低速孵育胚胎过夜。
  8. 小心移除玻璃小瓶中的抗体。通过向玻璃小瓶中加入 2 mL 1× TBST 并弃去液体，快速冲洗胚胎两次。
  9. 向玻璃小瓶中加入 2 mL 1× TBST，然后用铝箔纸包裹小瓶。将玻璃小瓶置于旋转器上，以低速旋转胚胎 1 小时。
  10. 重复上述步骤至少 5 次。

5. 共聚焦成像前胚胎的透明化处理

  1. 脱水胚胎时，最后一次洗涤后小心移除玻璃小瓶中的缓冲液，加入 2 mL 100% 甲醇。用铝箔包裹玻璃小瓶，置于旋转仪上，以低速旋转 5 分钟。旋转结束后，移除玻璃小瓶中的液体。
  2. 重复上述步骤至少 5 次。
  3. 为彻底脱水胚胎，使用 2 mL 100% 无水甲醇重复上述步骤至少 5 次。
  4. 小心尽可能多地移除玻璃小瓶中的甲醇。
  5. 使用玻璃移液管缓慢向玻璃小瓶中加入 500 µL 透明试剂 BABB。胚胎将在 BABB 中漂浮，静置 10 分钟，直至所有胚胎沉降至玻璃小瓶底部。注意胚胎将几乎不可见，需小心移除 BABB，避免损伤胚胎。
  6. 重复上述步骤至少再进行 2 次，或直至无折射率不均的条纹（schlieren lines）可见。为完全透明化胚胎，成像前需将其在 BABB 中保存 1–2 天。
  7. 制作成像腔室：取一段厚度约为 1.1–1.2 mm 的 VHB 胶带，剪下一个约 5 mm × 5 mm 的小方块（大小与胚胎相近），再剪一个约 10 mm × 10 mm 的方块，将其粘附于 24 mm × 40 mm 的盖玻片上。
  8. 小心将透明后的胚胎转移至腔室内，再用另一片盖玻片覆盖。胚胎将位于盖玻片夹层之间，以便从两侧进行成像。
  9. 在共聚焦显微镜下进行成像。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

在单细胞阶段的Xenopus laevis胚胎中显微注射5-EU，在胚胎发育至第9期、全胚胎范围内大规模合子基因激活（ZGA）发生时固定胚胎。随后按照上述方案处理胚胎。通过点击化学反应，利用TAMRA-叠氮化物标记胚胎中的新生RNA，使用抗组蛋白H3抗体标记组蛋白H3，并用TO-PRO-3标记DNA。采用共聚焦显微镜配合10×物镜对胚胎进行成像。如图1所示，新生EU-RNA（红色）信号出现在胚胎细胞的细胞核内，而H3（绿色）和DNA（品红色）被用作细胞核标记物，表明这些胚胎细胞中正发生高度活跃的ZGA。因此，通过代谢标记的EU-RNA为早期胚胎发育过程中单细胞水平ZGA的分析提供了一种灵敏且便捷的方法。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

ZGA 代表了胚胎发育最早阶段中最关键的转变之一2,3。本文详细描述了制备样品以在整体染色的早期Xenopus胚胎中直接观察ZGA的实验步骤，包括固定显微注射了5-EU的胚胎、通过点击反应将新生RNA与荧光染料偶联、在点击反应后对亚细胞标志物进行免疫染色，以及对胚胎进行透明化处理以用于共聚焦成像7。由于掺入的5-EU量与正在进行的转录水平成正比，每个细胞核中荧光信号的强度可作为单细胞水平上ZGA活性的定量读数。因此，该方法使我们能够定量并监测单个细胞中ZGA的活性，并比较胚胎内不同细胞之间的差异，从而揭示了早期胚胎发生过程中ZGA的新空间模式及其调控机制5,7。

该实验方案的成功依赖于多个关键步骤。胚胎的适当固定极为重要，因为细胞内的 RNA 极易降解。为了在早期胚胎中保留新生 RNA...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在竞争利益。

致谢

感谢宾夕法尼亚大学 Matthew Good 实验室提供的培训。本工作部分由尤妮斯·肯尼迪·施莱佛国家儿童健康与人类发育研究所（R03HD105802）资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
16% 多聚甲醛（PFA）EMS15710-S用于配制固定液
20× SSCMediatechMT46-020-CM用于配制漂白液
3D 摇床混合器VWR76595-802用于孵育胚胎
9 mm 螺口小瓶（2 mL）VWR46610-722用于处理胚胎
抗组蛋白 H3 抗体Abcamab1791用于免疫染色
抗坏血酸Sigma-AldrichA7506用于配制点击反应液
苯甲醇Sigma-Aldrich305197用于胚胎透明化
苯甲酸苄酯ACROS Organics105860010用于胚胎透明化
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-AldrichA3059用于配制封闭液
9 mm 螺口小瓶盖（2 mL）VWR46610-712用于处理胚胎
盖玻片（24 mm × 40 mm）VWR48393-060用于制作成像腔室
CuSO4Sigma-Aldrich61230用于配制点击反应液
乙二醇双（氧乙烯基）四乙酸（EGTA）Thermo Fisher ScientificAC409915000用于配制固定液
Fiji ImageJNIH用于图像处理
甲酰胺Thermo Fisher ScientificAC181090010用于配制漂白液
玻璃巴斯德吸管VWR14673-010用于转移 BABB 溶液
山羊抗兔 Alex Fluor 488 二抗Thermo Fisher ScientificA27034用于免疫染色
山羊血清Abcamab7481用于配制封闭液
过氧化氢Sigma-AldrichH1009用于配制漂白液
硫酸镁（MgSO4）Thermo Fisher ScientificM65-500用于配制固定液
甲醇Thermo Fisher ScientificA4524用于胚胎脱水
无水甲醇Sigma-Aldrich322415用于胚胎脱水
MOPSThermo Fisher ScientificAC172631000用于配制固定液
多功能摇床混合器VWR76595-812用于孵育胚胎
塑料移液管Thermo Fisher Scientific13-711-9AM用于转移胚胎
刀片Thermo Fisher Scientific18-100-970用于切割胶带
无 RNase 水Thermo Fisher ScientificBP561-1用于配制无 RNase 溶液
Roto-Mini PLUS（旋转仪）VWR470313-912用于旋转孵育胚胎
四甲基罗丹明（TAMRA）-叠氮化物Abcamab146486用于配制点击反应液
TO-PRO-3Thermo Fisher ScientificT3605用于 DNA 染色
吐温 X-100Sigma-Aldrich10789704001用于配制洗涤缓冲液
Trizma Base（Tris Base）Sigma-AldrichT1503用于配制 Tris 缓冲液
VHB 3M GPH-110GF 胶带（45 mil）VWR76524-608用于制作成像腔室
Zeiss LSM 700 共聚焦显微镜Zeiss用于共聚焦成像

参考文献

  1. Kojima, M. L., Hoppe, C., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition: Reprogramming of the cytoplasm and nucleus. Nat Rev Genet. 26 (4), 245-267 (2025).
  2. Vastenhouw, N. L., Cao, W. X., Lipshitz, H. D. The maternal-to-zygotic transition revisited. Development. 146 (11), dev161471(2019).
  3. Jukam, D., Shariati, S. A. M., Skotheim, J. M. Zygotic genome activation in vertebrates. Dev Cell. 42 (4), 316-332 (2017).
  4. Palfy, M., Joseph, S. R., Vastenhouw, N. L. The timing of zygotic genome activation. Curr Opin Genet Dev. 43, 53-60 (2017).
  5. Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
  6. Chen, H., Good, M. C. Nascent transcriptome reveals orchestration of zygotic genome activation in early embryogenesis. Curr Biol. 32 (19), 4314-4324.e7 (2022).
  7. Chen, H., Good, M. C. Imaging nascent transcription in whole-mount vertebrate embryos to characterize zygotic genome activation. Methods Enzymol. 638, 139-165 (2020).
  8. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (41), 15779-15784 (2008).
  9. Chan, S. H., et al. Brd4 and P300 confer transcriptional competency during zygotic genome activation. Dev Cell. 49 (6), 867-881.e8 (2019).
  10. Adar-Levor, S., et al. Cytokinetic abscission is part of the midblastula transition in early zebrafish embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (15), e2021210118(2021).
  11. Chen, H. Quantifying nascent transcription in early embryogenesis. Methods Mol Biol. 2923, 143-162 (2025).
  12. Harland, R. M. In situ hybridization: An improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

单细胞分析早期胚胎发生母源-合子转换新生转录本标记5-乙炔基尿苷点击化学共聚焦显微镜非洲爪蟾胚胎基因组调控
在早期胚胎的单细胞中可视化合子基因组激活
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。