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一种使用叔丁基过氧化氢诱导原代人黑素细胞产生应激诱导性早衰的标准化方案

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DOI：

10.3791/70595

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2026年5月29日

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Biomedical Aging Research, Universität Innsbruck, 2Center for Molecular Biosciences Innsbruck (CMBI), 3European Innovation Center, Proya Europe

本文内容

摘要

采用tBHP诱导HNM细胞早衰的标准化方案，以及分析关键衰老标志物（包括生长停滞、SA-β-半乳糖苷酶活性和SASP因子）的标准化检测方法。

摘要

环境应激因素（如紫外线辐射、空气污染或香烟烟雾）会引发皮肤外源性老化。暴露于这些外源性老化因素会促进衰老细胞的积累，从而导致皱纹和色素沉着障碍的形成。黑色素细胞作为提供主要紫外线防护的细胞，其活性随年龄增长而下降。衰老的黑色素细胞在老化皮肤中积聚，并加剧皮肤老化表型；然而，目前可用于研究黑色素细胞衰老的模型较少，本研究旨在建立一种可重复的模型以推动后续研究。本研究采用叔丁基过氧化氢（tBHP）——一种特征明确的氧化应激诱导剂，建立了人新生儿黑色素细胞（HNM）的衰老模型。tBHP 通过耗竭细胞抗氧化防御系统并促进自由基过量产生，破坏氧化还原稳态，进而导致 DNA 和蛋白质损伤。我们通过分析公认的衰老标志物（包括增殖能力受限、形态学改变以及 SA-β-半乳糖苷酶活性）来表征经 tBHP 处理后黑色素细胞的衰老表型。该模型为研究应激诱导的黑色素细胞早衰提供了有价值的工具，有助于深入理解其在皮肤外源性老化及色素沉着障碍中的作用。

引言

皮肤老化由两个不同的因素组成：内在老化和外在老化1,2。内在老化由自然的时间进程和遗传因素引起，而外在老化则是由于长期暴露于环境应激源所致，主要为紫外线辐射，也包括空气污染、香烟烟雾和化学试剂等，这些因素会加速老化过程，使其超过正常的时间性老化速率3,4。环境暴露会产生氧化应激，超出细胞抗氧化防御能力，导致DNA损伤、蛋白质氧化和脂质过氧化。这些分子改变会触发持续的DNA损伤反应和细胞功能障碍，最终促进早衰5,6。这种应激诱导的衰老可导致老化皮肤的临床特征，包括皱纹、色素分布不均、弹性降低以及屏障功能受损7。

黑色素细胞位于表皮基底层，通过合成黑色素并将其转移至周围的角质形成细胞，成为皮肤抵御紫外线损伤的主要防线。然而矛盾的是，这种保护作用使黑色素细胞在外界老化过程中特别容易受到氧化应激和过早衰老的影响8,9。黑色素生成过程本身就会产生大量活性氧，这是酪氨酸酶催化反应的副产物，由此造成固有的氧化负担，而紫外线辐射和污染等环境暴露会进一步加剧这一负担10,11。因此，长期的环境压力可导致氧化损伤、线粒体功能障碍，并最终引发细胞衰老12。尽管黑色素细胞具有重要作用，但关于调控其衰老的分子通路以及氧化应激如何启动这一过程的关键问题仍未明确。此外，衰老的黑色素细胞通过释放SASP因子影响周围皮肤微环境，进而驱动与年龄相关的皮肤变化的作用机制，目前仍缺乏充分理解13,14。

尽管黑色素细胞特别容易受到氧化应激诱导的衰老影响，但用于研究这一过程的实验模型仍然有限15,16。目前大多数衰老研究仍依赖于成纤维细胞中的复制性衰老或应激诱导性衰老模型，但这些方法无法反映黑色素细胞独特的生物学特性，也无法体现其通过与邻近细胞的相互作用及其特有的衰老相关分泌表型（SASP）对皮肤老化产生的潜在影响17。这一局限凸显了建立黑色素细胞特异性衰老模型的必要性，以更准确地模拟其对环境应激因子的生理反应18,19，并阐明其在人类皮肤老化过程中的作用。

尽管已有多种应激诱导衰老的方法，但在原代人黑素细胞中实施这些方法仍存在技术上的挑战，且常伴随较大的实验变异性。黑素细胞对氧化应激尤为敏感，导致有效诱导衰老与过度细胞毒性之间的实验窗口较窄。此外，不同供体来源的原代细胞制备存在个体差异，进一步加剧了各研究间结果的不一致性。这些问题常被报道不足，且相关实验方案标准化程度不够，限制了实验的可重复性。本实验方案通过提供优化且可重复的处理程序、明确的给药时间表以及标准化的检测指标，弥补了这一不足，实现了对原代人黑素细胞衰老过程的可靠诱导与评估。

叔丁基过氧化氢（tBHP）是一种特征明确的氧化应激诱导剂，可通过产生活性氧并耗竭细胞抗氧化防御系统来促进细胞衰老。它已被广泛用于诱导真皮成纤维细胞的衰老，在维持细胞活力的同时可触发典型的衰老标志物20,21。由于tBHP通过明确的生化途径产生持续的氧化应激，因此为研究氧化应激诱导的衰老以及探讨氧化损伤与衰老过程之间的分子机制提供了一个可重复且易于操作的实验系统22,23。与基于紫外线的模型相比，当需要在不受照射参数影响且无需特殊设备的条件下实现可控且可重复的氧化应激诱导时，tBHP具有显著优势。

HNM 为研究外源性衰老机制提供了相关的模型24。这些细胞来源于包皮的原代细胞，保留了完整的应激反应通路，避免了基因修饰或永生化所导致的人工假象25。新生小鼠黑素细胞是一个理想的实验模型，因其基础损伤极小，能够清晰地评估环境应激因子诱导的衰老通路26,27。

本研究采用tBHP诱导的原代人新生儿黑素细胞氧化应激模型，克服了衰老研究中常用非黑素细胞系和永生化细胞模型的局限性。该方法为研究黑素细胞特异性的衰老机制以及利用已确立的标志物对衰老表型进行表征提供了标准化平台。总体而言，本方案为研究氧化应激诱导的黑素细胞衰老提供了一种可重复且具有生理相关性的模型。

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方案

本方案已针对原代人新生儿黑色素细胞（HNM）的研究进行优化，旨在探讨由tBHP诱导的应激性早衰机制（图1）。这些黑色素细胞来源于新生儿高加索人包皮组织（浅色素光型），购自商业来源。根据供应商提供的文件，所用人组织均来自充分知情并签署同意书的捐献者，采集过程符合既定的伦理与法律框架，包括《赫尔辛基宣言》及适用的数据保护法规。细胞以去标识化形式提供，本研究使用这些细胞无需额外的伦理审批。所有实验均采用同一批黑色素细胞系以确保一致性。需注意，若使用不同的原代细胞系，培养条件以及试剂浓度和操作步骤可能需要进一步调整。

1. 准备工作

注意：为启动tBHP处理，黑色素细胞必须至少提前三天解冻，以确保充分恢复和达到足够汇合度。处理阶段持续4天，以接种日为第0天。本研究中所用全部材料的详细信息见于 材料列表.

  1. 配制培养基时，将黑素细胞基础培养基与相应的生长因子混合。在将各瓶试剂加入培养基前，先灼烧瓶盖以减少污染。向配制好的培养基中加入1%（v/v）青霉素-链霉素溶液，4 °C保存备用。
  2. 接种前，通过将大豆胰蛋白酶抑制剂溶于DPBS中来配制胰蛋白酶抑制剂溶液。使用0.22 µm滤膜过滤该溶液，分装后于−20 °C保存。解冻后可使用长达10天。

2. 细胞复苏（第 -3 天）

警告：所有接触人源细胞的材料均应视为生物污染物，并须根据机构的生物安全指南进行处置。为评估细胞衰老，我们采用多种互补的检测方法，以评价生长停滞、SA-β-半乳糖苷酶活性及其他分子标志物。本文介绍了这些检测方法的操作流程，以及使用这些衰老指标时的预期结果。

  1. 在室温下，用移液器将 20 mL 杜尔贝科磷酸盐缓冲液（细胞培养级）加入 50 mL 锥形管中。细胞冻存管在解冻前需保持在冰上。
  2. 打开细胞冻存管前，先将管盖过火灭菌，拧开后再次对管口周围过火，以防止潜在污染。
  3. 将 500 µL DPBS 转移至含有细胞的冻存管中。通过轻柔吹打使细胞缓慢解冻，然后将全部内容物转移至锥形管中。
  4. 在室温下以 100 × g 离心 5 分钟。离心后沉淀呈浅褐色至棕褐色（颜色深浅可能因供体种族差异而有所不同）。
  5. 在 T75 培养瓶中加入 14 mL 黑色素细胞培养基。
  6. 用火焰灭菌玻璃巴斯德吸管（每次操作黑色素细胞时均需重新过火），小心吸除 DPBS，并将沉淀重悬于 1 mL 培养基中。
  7. 将细胞悬液转移至预先准备好的培养瓶中。
  8. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养，并每日在显微镜下观察。每 48 小时至少更换一次培养基。
    ​注意：每支冻存管中含有约 1 × 106 个原代人黑色素细胞。所有实验均使用第 9 代细胞进行。

3. 细胞接种（第0天）

  1. 确保接种当天细胞汇合度达到 80–90%。
  2. 吸除培养瓶中的培养基，并用 DPBS 洗涤两次。
  3. 加入 2 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液，于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 5 分钟，使细胞脱离。
  4. 轻轻敲击培养瓶，显微镜下观察以确认细胞完全脱落（如有必要，可延长孵育时间）。
  5. 加入 1.5 倍体积的胰蛋白酶抑制剂以终止反应。
  6. 将细胞悬液转移至 15 mL 圆底离心管中，并用 DPBS 稀释至终体积 10 mL。
  7. 在 100 × g 条件下离心 5 分钟。
  8. 吸除上清液，用培养基重悬至所需体积。
  9. 对于 tBHP 处理组培养皿，每 10 cm 培养皿接种 6 × 105 个细胞；对照组培养皿每皿接种 4 × 105 个细胞。
    注意：tBHP 处理组应接种较高密度的细胞，以确保实验期间有足够数量的细胞，因为其生长速率在处理过程中会逐渐下降。若在盖玻片上接种细胞用于显微镜实验，盖玻片必须预先用 0.1 mg/mL 多聚-D-赖氨酸包被，并在接种前完全干燥。
  10. 于 37 °C、5% CO₂ 条件下过夜培养。对照组每 48 小时更换一次培养基。

4. tBHP 处理（第 1–4 天）

  1. 从 tBHP 储存液中配制 10 mM 的工作液（用 DPBS 或培养基稀释）。
    注意：tBHP 对光敏感，操作时需遮盖容器。工作液在 4 °C 妥善保存条件下最多可使用一周。处理时间表：接种后第 1 天（即接种次日）开始 tBHP 处理。黑素细胞每天处理两次，每次处理间隔至少 4 小时。该处理方案从第 1 天持续至第 4 天，共连续处理 4 天。所选 tBHP 浓度和处理方案参考了既往在真皮成纤维细胞中的研究，其中较低浓度即可诱导细胞衰老。然而在原代黑素细胞中，需要更高浓度才能有效诱导衰老，根据滴定实验在衰老诱导效率与细胞活力之间的平衡，确定 100 µM tBHP 为最优浓度。
  2. 每轮处理向细胞中加入 100 µM tBHP，作用 1 小时（开始处理时，加入适量工作液，注意将液体加至培养基中，避免直接滴加在细胞上）。
  3. 前后左右轻轻晃动培养板，使 tBHP 在培养基中均匀分布。
    ​注意：避免画圈式晃动，以免导致 tBHP 在培养基中分布不均。
  4. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下精确孵育 1 小时。
  5. 终止 tBHP 处理时，吸除培养基。
  6. 用预热至 37 °C 的 DPBS 洗涤培养板两次。
  7. 向培养板中加入适量新鲜培养基。
  8. 将细胞放回培养箱中恢复至少 4 小时，再进行下一次处理。
  9. 同一天内重复上述操作进行第二次处理，并在后续各天继续执行该流程。完成处理后继续培养细胞至第 9 天，以检测衰老标志物。
  10. 监测对照组培养板，若细胞长满则进行传代。

5. 生长曲线分析

  1. 按照接种方案，对经 tBHP 处理的细胞及对照组细胞进行计数。
  2. 若 tBHP 处理组培养皿中的细胞数量少于 6 × 105 个，则重新接种相同初始密度，或接种全部细胞。
  3. 在培养的第 4、9 和 15 天进行细胞计数。
  4. 使用以下公式计算生长曲线：
    lg (count) - log (seed) / 0.301 + cPDL
    count：传代结束时获得的细胞数量。
    seed：传代开始时最初接种的细胞数量。
    ​cPDL：从前次传代延续而来的累积群体倍增水平。

6. SA-β-半乳糖苷酶活性

  1. 第9天，用PBS洗涤细胞两次，然后用2%甲醛和0.4%戊二醛固定。
  2. 用PBS洗涤细胞两次。
  3. 将固定后的细胞与pH为6.0的染色液（150 mM NaCl、2 mM MgCl、5 mM 铁氰化钾、5 mM 亚铁氰化钾、40 mM 柠檬酸、12 mM 磷酸钠和1 mg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷（X-gal））孵育。
  4. 在37 °C、无CO₂条件下孵育18小时后，用PBS洗涤细胞两次。
  5. 使用光学显微镜观察成像。
  6. 在显微镜下通过计数蓝色染色细胞数量，并除以视野中的细胞总数，来定量蓝色染色细胞的数量。结果以阳性细胞百分比表示。

7. 免疫荧光染色

警告：含有甲醛、戊二醛和多聚甲醛的废液必须作为危险化学废物处理，并依照机构安全规定进行处置。

  1. 使用预先在0.1 mg/mL多聚-D-赖氨酸包被的盖玻片上培养的细胞。
  2. 第9天，用PBS洗涤细胞两次，然后用4%多聚甲醛固定15分钟。
  3. 用PBS洗涤细胞两次。
  4. 使用含0.3% Triton-X和0.1%柠檬酸钠的PBS溶液进行透化处理。
  5. 用含1% BSA的PBS-T溶液在室温下封闭30分钟。
  6. 在湿盒中，加入γH2AX一抗以检测持续性DNA损伤反应，4 °C孵育过夜。
  7. 次日，用PBS洗涤两次。
  8. 室温下加入二抗孵育1小时。
  9. 如需要，用DAPI染色细胞核。
  10. 用PBS-T洗涤两次，接着用PBS洗涤两次，再用ddH2O洗涤两次。
  11. 将盖玻片封片，并在成像前完全干燥。
  12. 使用ImageJ软件分析平均荧光强度和/或γH2AX焦点数量。

8. RNA 提取与 RT-qPCR

警告：β-巯基乙醇具有高毒性，必须在通风橱中操作。含β-巯基乙醇的废液应作为危险化学废物处理。

  1. 第9天，使用2 mL胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞。
  2. 加入1.5倍体积的胰蛋白酶抑制剂终止反应。
  3. 将细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中，在100 × g 条件下离心5分钟。
  4. 小心吸除上清液。
  5. 通过重悬于含1% β-巯基乙醇的350 µL RLT缓冲液中裂解细胞沉淀。
  6. 使用基于柱法的RNA纯化试剂盒提取RNA。
  7. 使用分光光度计（260 nm）测定RNA浓度。
  8. 进行cDNA合成时，取1 µg RNA，在总反应体积为10 µL的体系中，使用标准逆转录反应混合液（包括逆转录缓冲液、dNTPs、随机引物、逆转录酶和RNase抑制剂）进行逆转录，并按照试剂盒说明书设置热循环条件。
  9. 对SASP因子进行RT-qPCR检测
    注：所选SASP因子（IL-8、IL-6和MMP-1）是衰老相关分泌表型中公认的组分，因其在皮肤生物学中的相关性而被选用，涉及炎症信号传导和细胞外基质重塑过程
    IL-6（正向引物：5’ AAGCCAGAGCTGTGCAGATGAGTA 3’ 反向引物：5’ TGTCCTGCAGCCACTGGTTC 3’）
    IL-8（正向引物：5’ ACCGGAAGGAACCATCTCAC 3’ 反向引物：5’ AAACTGCACCTTCACACAGAG 3’）
    MMP-1（正向引物：5’ CATCGTGTTGCAGCTCATGA 3’ 反向引物：5’ ATGGGCTGGACAGGATTTTG 3’）
    GAPDH（正向引物：5’ GAGTCAACGGATTTGGTCGT 3’ 反向引物：5’ GATCTCGCTCCTGGAAGATG 3’）
  10. 采用ΔΔCt法分析mRNA的相对表达水平，并以看家基因GAPDH进行归一化处理。

9. 蛋白质分离与蛋白质印迹

  1. 第9天，收集蛋白裂解液。
  2. 吸除培养基，并用预冷的DPBS洗涤细胞两次。
  3. 加入150 µL RIPA裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，1% NP-40，0.5% 脱氧胆酸钠，0.1% SDS，2 mM EDTA），并加入蛋白酶抑制剂，用细胞刮刀机械裂解细胞，随后转移至1.5 mL离心管中。
  4. 进行三次冻融循环，然后在冰上孵育30分钟。
  5. 在4 °C下以9600 ×g离心10分钟。
  6. 使用BCA法测定上清液中的蛋白浓度。
  7. 将等量蛋白（20 µg）在聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，并转至活化的PVDF膜上。
  8. 用含5%脱脂奶粉的TBS-T缓冲液封闭膜。
  9. 在4 °C下与一抗pRB和LaminB1孵育过夜。
  10. 次日，用TBS-T缓冲液洗涤膜3次。
  11. 室温下与相应的HRP标记二抗孵育1小时。
  12. 通过化学发光法检测蛋白，并进行密度分析。

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结果

tBHP 处理可诱导人新生儿黑素细胞发生生长停滞。
与未处理的对照组相比，tBHP 处理抑制了黑素细胞的增殖（n = 3）（图 2A）。至第 9 天时，处理组细胞仅达到 1.4 cPDL，而对照组达到 3.1 cPDL。随着时间推移，这种差异进一步增大：至第 15 天时，处理组黑素细胞的增殖水平趋于平稳，约为 1.9 cPDL，而对照组持续扩增至近 5.1 cPDL。增殖能力的持续下降符合应激诱导的早衰表型特征。

细胞体积增大及形态改变是细胞衰老的典型特征。
与对照组相比，在所有检测时间点（n = 3），经 tBHP 处理的黑素细胞均表现出更大的细胞表面积（图 2B–C）。比较 tBHP 处理组与对照组，细胞增大现象从第 4 天开始显现，并持续进展至第 15 天（2,000 µm2 对比 400 µm...

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讨论

本方案建立了一种使用tBHP诱导人新生儿黑素细胞发生应激诱导的早衰（SIPS）的标准化方法，为研究该特定细胞类型的衰老过程提供了一个可靠的模型。细胞增殖、形态学、SA-β-半乳糖苷酶活性、DNA损伤标志物以及SASP组分的一致性变化均支持所诱导的衰老表型。通过聚焦于黑素细胞——这类细胞在衰老研究中尚未得到充分关注，尽管其在皮肤生理及色素障碍性疾病中具有关键作用27,28，该模型有助于填补领域内的一个关键空白。在原代黑素细胞中可控地诱导氧化应激，为研究这些细胞对压力的响应机制，以及衰老如何影响更广泛的皮肤老化过程，提供了一个生理相关性较强的实验体系。

该方法有助于更清晰地理解黑素细胞衰老的机制。它为研究在非黑素细胞或永生化细胞模型中无法有效观察的信号通路提供了有价值的工具19,29。通过在原代黑素细胞中诱导氧化应激，该实验方案建立了一个可控系统，用于探...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。Lieve Declercq 与 Proya Europe 存在附属关系；但该公司对研究设计、数据收集、分析、解释或发表决定均无任何影响。作者进一步声明，人工智能（AI）工具仅用于协助语言编辑和文本润色。所有科学内容、实验设计及数据解释均由作者独立完成并验证。

致谢

本工作获得了蒂罗尔科学基金会（Tiroler Wissenschaftsfonds）的资助（项目编号：ZAP746010、F.33287/10-2021、F.50279/7-2024）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 µm 膜过滤器Merck SLGVR33RS
1 M 柠檬酸 Merck K91567844用去离子水配制
1 M MgCl2MerckA649033用去离子水配制
1 M Na2HPO4MerckK56036736用去离子水配制
10 M NaOHLab Honeywell30620用去离子水配制
37% 甲醛Sigma252549
4% 多聚甲醛CarlRoth0335.3
5 M 氯化钠 SigmaS3014用去离子水配制
50% 戊二醛SigmaG6403
5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷（X-Gal）SigmaB9146
Alexa Fluor 标记的二抗（2 mg/mL）InvitrogenA11008
BSA（牛血清白蛋白）SigmaA7030
化学发光底物SigmaWBKLS0500
Costar CellLifter Corning3008
细胞培养/显微镜用盖玻片EprediaCB00200RA120MNZ0
DermaLife 基础培养基CellSystemsLM-0004
DermaLife M 黑色素细胞培养基套装 CellSystemsLS-1041
Dulbecco 磷酸盐缓冲液 SigmaD8537
人新生儿黑色素细胞CellSystemsFC-0023
LaminB1 抗体（兔源）AbcamAB16048用 5% BSA 按 1:1000 稀释
含 DAPI 的封片剂AbcamAB104139
青霉素-链霉素溶液 SigmaP4333
聚丙烯酰胺梯度凝胶Bio-Rad456-8095
聚-D-赖氨酸（0.1 mg/mL） GibcoA38904-01
铁氰化钾SigmaP8131
亚铁氰化钾SigmaP-9387
pRB 抗体（兔源）CellSignalling93085用 5% BSA 按 1:1000 稀释
蛋白酶抑制剂混合物自行配制N/A500 mM NaF；2 µg/mL 抑肽酶；1 mM PMSF；1 mM 活化正钒酸钠
RIPA 裂解缓冲液 自行配制N/A成分：50 mM Tris-HCl；1% NP-40；0.5% 脱氧胆酸钠；0.1% SDS；150 mM NaCl；2 mM EDTA
RLT 缓冲液Qiagen1015762包含于 RNeasy Mini Kit 中
RNeasy Mini KitQiagen74106
脱脂奶粉（用于配制含 5% 奶粉的 TBS-T）Sigma70166
柠檬酸钠（用于配制 0.1% 溶液）SigmaS4641
大豆胰蛋白酶抑制剂（0.5 mg/mL） Thermofisher17075-029
叔丁基过氧化氢（tBHP）Sigma458139
Triton X-100（用于配制 0.3% 溶液）SigmaT9284
胰蛋白酶-EDTA 溶液SigmaT3924
β-巯基乙醇CarlRoth4227.3
γH2AX 抗体（兔源）CellSignalling2577S按 1:200 稀释 

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