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方法文章

建立小鼠肾纤维化模型 通过 单侧缺血-再灌注损伤与延迟对侧肾切除术

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DOI：

10.3791/70598

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2026年5月22日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Guangzhou Chest Hospital, Institute of Tuberculosis, Guangzhou Medical University, 2Department of Urology, The First Affiliated Hospital of Shandong First Medical University & Shandong Provincial Qianfoshan Hospital, 3Department of Transplantation, Nanfang Hospital, Southern Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种通过单侧缺血-再灌注损伤联合延迟对侧肾切除建立小鼠肾纤维化模型的实验方案。该策略可实现对急性肾损伤向慢性肾病（AKI-to-CKD）转变过程的纵向研究，并在实验终点对残留肾功能进行精确评估。

摘要

肾缺血-再灌注损伤（IRI）是急性肾损伤（AKI）的重要成因，并显著推动慢性肾病（CKD）的进展。为便于研究不良修复及纤维化机制，需建立可重复的动物模型。本文报道一种通过单侧肾缺血-再灌注损伤（uIRI）联合对侧肾切除术（CNx）建立的标准小鼠肾纤维化模型。该策略可在疾病进展过程中确保动物长期存活，同时允许在取材时精确评估受损肾脏残余肾功能。雄性C57BL/6小鼠在37 °C条件下接受28分钟的热缺血处理，并在各研究终点前24小时完成对侧肾切除术。小鼠分别于IRI术后第2天、第5天、第1周、第2周、第3周和第4周处死，进行组织学和免疫组织化学评估。术后第2天和第5天，肾脏主要表现为肾小管坏死，尤其集中在皮髓交界区，尚无间质纤维化的证据。自术后第1周起，上述病理特征逐渐被炎性细胞浸润和早期肾小管萎缩所取代；间质纤维化亦开始出现，并于第2周达到最严重程度。术后第3周和第4周，肾脏呈现广泛的小管萎缩，符合失用性萎缩的表现。值得注意的是，间质纤维化程度较第2周有所减轻，提示已进入静止期、低细胞性瘢痕阶段。该模型能有效模拟临床中AKI向CKD转化的过程，为研究纤维化机制及筛选治疗干预手段提供了可靠的平台。

引言

肾缺血-再灌注损伤（IRI）是临床环境中导致急性肾损伤（AKI）的关键因素之一1。常见病因包括肾移植（涉及供体肾脏的冷缺血和热缺血，随后恢复血流）、需要暂时性血管阻断的心血管或肾脏手术，以及由严重创伤、大出血或脓毒症引起的全身低灌注状态2。

缺血-再灌注损伤的病理生理机制涉及一个复杂的双相过程。最初，在缺血阶段，氧气和营养供应中断导致肾小管上皮细胞（TECs）发生代谢紊乱、ATP 耗竭以及细胞骨架破坏3随后，再灌注期间血流的恢复虽然对于挽救缺血组织至关重要，但却会引发更为复杂的反应 "继发性损伤"4 这一损伤阶段由一系列事件级联驱动，包括活性氧（ROS）激增引发的氧化应激、内皮功能障碍、大量炎性细胞（如中性粒细胞和巨噬细胞）浸润，以及补体系统的激活。3这些复杂的级联反应共同加剧了肾小管上皮细胞的凋亡与坏死，构成了急性肾损伤的主要病理表现。

值得注意的是，缺血再灌注损伤（IRI）并不仅限于急性、可逆性损伤。大量证据表明，肾IRI后修复不完全或适应不良是导致向长期慢性病理转变的核心机制。在生理条件下，肾脏在急性肾损伤（AKI）后会启动修复程序，有效清除受损细胞，并促进存活的肾小管上皮细胞（TECs）增殖与分化，以恢复受损肾小管的结构和功能。然而，在严重或反复发生的IRI损伤后，这一修复过程可能失调，最终导致肾小管萎缩、肾间质纤维化，并加速慢性肾脏病（CKD）的发生和发展5,6。

因此，阐明急性肾损伤（AKI）向慢性肾病（CKD）转变的机制并开发治疗干预手段已成为迫切需求。由于具有明确的遗传背景和与人类疾病进展相似的特点，啮齿类动物模型，尤其是小鼠模型，已成为研究缺血再灌注损伤（IRI）后纤维化的不可或缺的体内工具。然而，当前的IRI方法学存在显著的异质性（例如，缺血持续时间、温度控制、单侧与双侧损伤），导致可重复性差，且不同研究之间的可比性有限7。

为应对这些挑战，本研究详细阐述了一种改良的单侧缺血-再灌注损伤（uIRI）模型的标准化操作方案。此外，该方案在研究终点前24小时进行对侧肾切除术（CNx）。这一策略克服了双侧缺血相关的高死亡率，同时能够精确评估受损肾脏的残余肾功能及纤维化进展。该模型可准确模拟急性肾损伤向慢性肾病（AKI-to-CKD）的动态转变过程，为机制研究和治疗药物筛选提供了一个可靠的体内（in vivo）研究平台。

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方案

所有动物实验均按照《实验动物管理条例》进行。实验方案经广州杰诺生物科技有限公司机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准（批准号：JENNIO-IACUC-2025-A053）。所有操作均严格遵循《实验动物护理和使用指南》及机构指南，全面遵守3R原则。研究的时间线，包括处死动物和样本采集的时间点，详见图1。

1. 动物和仪器准备

  1. 使用8周龄、体重20–25 g的雄性C57BL/6小鼠，饲养于特定病原体阴性（SPF）环境中进行研究。
  2. 将小鼠随机分为uIRI组和假手术组。在6个预定时间点（2天、5天、1周、2周、3周和4周），每组各分配 n = 4 只小鼠。
    注意：小鼠在12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养，可自由获取食物和水。实验前至少在实验室环境中适应一周。
  3. 对所有手术器械进行灭菌 通过。使用前需经高压蒸汽灭菌。
  4. 使用配备直肠探针的恒温监测系统，将核心体温严格维持在 37.0 °C ± 0.5 °C。麻醉诱导后立即插入润滑过的探针至直肠，并在整个操作过程中保持原位。
  5. 使用异氟烷小型动物气体麻醉系统对小鼠进行麻醉（诱导浓度5%，维持浓度1.5%，氧气流速1.0 L/min） 通过 经校准的蒸发器）
    注意：通过确认足底回缩反射消失来判断深度麻醉状态。所有手术操作必须在小鼠达到深度麻醉状态后方可进行。
  6. 剃除左侧背部 flank 区域的毛发。

2. 手术步骤

  1. uIRI 模型（第 0 天）
    1. 将小鼠置于右侧卧位，以暴露左侧腰部区域。
    2. 在左侧背部做一条 1 cm 至 1.5 cm 的纵向皮肤切口，随后切开肌肉层，进入腹膜后腔。
    3. 使用无菌棉签蘸取生理盐水，轻柔地将左肾推出。
      注意：仅可通过操作肾周脂肪垫或使用无菌棉签移动肾脏。镊子绝不可接触肾脏表面。
    4. 使用尖头镊子仔细分离肾蒂，将肾动脉和肾静脉从周围结缔组织中游离出来。
    5. 使用无创血管微夹夹闭左肾蒂以诱导缺血。
      注意：肾蒂的分离必须彻底且干净。操作中应明确避免将输尿管夹闭。若不慎夹闭输尿管，将导致缺血再灌注损伤（IRI）与单侧输尿管梗阻（UUO）的混合性损伤，可能引入永久性梗阻成分。
    6. 夹闭后立即启动计时器。缺血时间严格设定为 28 分钟。
    7. 通过视觉确认缺血状态：肾脏颜色应在数秒内由鲜红色变为深紫色。
    8. 用浸有温热生理盐水的无菌纱布覆盖肾脏。
    9. 28 分钟后，移除夹子以启动再灌注。
    10. 通过视觉确认再灌注：肾脏颜色应在数分钟内恢复为粉红色/红色。
    11. 轻柔地将肾脏复位于腹腔内。
    12. 使用 5-0 可吸收缝线缝合肌肉层，使用 5-0 尼龙缝线缝合皮肤切口。
  2. 假手术（第 0 天）
    1. 按照步骤 2.1 所述，进行相同的麻醉、切口及肾脏外置操作。
    2. 分离肾蒂，但不夹闭血管。
    3. 将肾脏外置于体外相同时间（28 分钟），然后将其放回腹腔并缝合切口。
  3. CNx 手术
    注意：为评估受损肾脏的残余功能，应在各实验组预定样本采集时间点前 24 小时进行 CNx 手术。
    对于 2 天组：在 IRI 后第 1 天进行 CNx。
    对于 5 天组：在 IRI 后第 4 天进行 CNx。
    对于 1 周组：在 IRI 后第 6 天进行 CNx。
    对于 2 周组：在 IRI 后第 13 天进行 CNx。
    对于 3 周组：在 IRI 后第 20 天进行 CNx。
    对于 4 周组：在 IRI 后第 27 天进行 CNx。
    1. 按照步骤 1.5 所述对小鼠进行麻醉，然后剃除并消毒右侧背部区域。
    2. 在右侧腰部做一小切口，暴露右肾。
    3. 外置右肾，并轻柔地分离肾蒂。
    4. 使用 4-0 不可吸收丝线紧密结扎肾蒂（包括动脉、静脉和输尿管）。
    5. 在结扎线远端切除右肾。
      注意：确保残端无活动性出血。
    6. 将肾蒂残端放回腹腔，并按照步骤 2.1.12 所述缝合切口。
    7. 将小鼠置于加热垫上使其恢复。

3. 术后护理与监测

  1. 将小鼠置于加热垫上，直至其完全恢复意识和活动能力。
  2. 将小鼠放回清洁的笼子，并提供易于获取的食物和水。
  3. 每天监测小鼠的健康状况。
    1. 每天检查小鼠死亡情况。
    2. 观察小鼠理毛行为、痛苦或不适迹象以及姿势变化。
    3. 检查手术切口是否有感染、炎症或裂开的迹象。

4. 术后评估

  1. 样本采集
    注意：为评估损伤和纤维化的进展，在小鼠缺血再灌注损伤（IRI）后的指定时间点（2天、5天、1周、2周、3周和4周）处死小鼠。
    1. 使用3%异氟烷对小鼠进行麻醉。
    2. 采集血液样本用于血清生化分析（如需要）。
    3. 通过颈椎脱位法处死小鼠。
    4. 迅速取出左侧（受损）肾脏。
    5. 对肾组织进行分割处理：一部分用市售的4%多聚甲醛固定，用于组织学分析；其余组织在液氮中速冻后于-80 °C保存，用于分子生物学分析。
  2. 组织处理与切片
    1. 严格按照Feldman和Wolfe8所述的组织处理方案，将固定后的组织进行脱水、透明并包埋于石蜡中。
    2. 使用旋转式切片机将石蜡包埋块切成4 µm厚度的切片。
    3. 将组织切片贴附于载玻片上，并在60 °C下烘烤2小时，以确保组织牢固粘附。
  3. 苏木精-伊红（H&E）染色
    1. 将组织切片置于二甲苯中脱蜡，并通过梯度递减的乙醇溶液逐步水化至蒸馏水。
    2. 进行H&E染色以评估形态学损伤。染色及洗涤步骤应严格遵循Feldman和Wolfe8提供的标准化操作流程。
    3. 将染色后的切片脱水、透明，并使用树脂封片剂封片，以便显微镜下观察。
  4. 马松三色（Masson’s Trichrome）染色
    1. 将石蜡切片脱蜡并水化至蒸馏水。
    2. 依次应用媒染剂、细胞核、细胞质和胶原染料，以评估胶原沉积和肾纤维化程度。严格按照Islam和Kumar9所述的试剂孵育时间和洗涤步骤操作。
    3. 冲洗、脱水、透明并封片，以供显微镜观察。
  5. 免疫组织化学（IHC）
    1. 将组织切片脱蜡并水化。
    2. 采用含0.05% Tween-20的10 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）进行热诱导抗原修复，操作依据Magaki等10所述方法。
    3. 将切片在3%过氧化氢中孵育，以阻断内源性过氧化物酶活性。
    4. 在室温下用含5%牛血清白蛋白的PBS溶液封闭非特异性结合位点，孵育30分钟。
    5. 加入抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）一抗（1:400稀释），4 °C孵育过夜。
    6. 洗涤切片后，在室温下与二抗孵育1小时。
    7. 使用DAB显色并用苏木精复染，具体操作步骤遵循Magaki等10提供的程序。
    8. 将切片脱水、透明并封片，用于最终成像。

5. 统计分析

  1. 所有定量数据均以均值 ± 标准差（SD）表示。
    注：统计分析和图表生成使用 GraphPad Prism 软件（版本 10.0）完成。多个实验组与单一对照组（Sham）之间的差异采用单因素方差分析（Ordinary One-Way Analysis of Variance, ANOVA），随后进行 Dunnett 多重比较检验。当 P 值 < 0.05 时认为具有统计学显著性（*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P. < 0.0001）。ns 表示无显著差异。

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结果

在整个实验期间，假手术组和单侧肾缺血再灌注损伤（uIRI）组的总体生存率均为100%（每时间点 n = 4）。在初始的uIRI手术或后续延迟进行的对侧肾切除（CNx）手术过程中均未观察到动物死亡。该结果证实，与通常因尿毒症导致显著死亡率的双侧缺血模型相比，这种两阶段实验方案具有较高的安全性和可靠性。

在六个时间点进行H&E染色、Masson三色染色以及α-SMA的免疫组化染色（图2），以观察肾脏病理的动态变化。除定性组织病理学分析外，还对Masson三色染色切片进行纤维化区域的定量形态学分析（胶原阳性区域百分比），并对间质α-SMA信号进行定量，随后进行各时间点之间的统计学比较（图3C、D）。

假手术组的肾脏显示出正常的皮质和髓质结构。未发现异常的胶原沉积或间质α-SMA表达，α-SMA染色仅局限于血管平滑肌层。

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讨论

本研究描述了一种利用尿道缺血再灌注损伤（uIRI）建立小鼠肾间质纤维化模型的标准化方案，并在研究终点前24小时进行肾去神经支配（CNx）。动态组织病理学筛查揭示了不同的病理阶段：急性肾小管坏死在第2至5天达到高峰；随后是活跃的纤维生成和肌成纤维细胞活化，于1至2周达到峰值；值得注意的是，在第3至4周时，组织进入慢性阶段，表现为稳定的胶原沉积，但间质α-SMA表达显著下降。本研究使用的小鼠模型有效地模拟了急性肾损伤（AKI）向慢性肾病（CKD）的转变过程，可用于将组织学进展与残余肾功能进行关联分析。

uIRI 模型的可重复性已被证明对环境因素极为敏感7。首先，体温维持是影响损伤严重程度最关键的因子之一，实验过程中体温被严格控制在 37 °C7,11。其次，缺血时间针对 C57BL/6 品系特别优化为 28 分钟。已有研究表明，与 129/Sv 等耐受性品系相比，C57BL/6 小鼠对缺血性损伤更为敏感

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披露

作者声明不存在任何竞争利益。

致谢

本研究由国家自然科学基金（82373042）和临床联合创新团队项目资助 & 基础研究（202409），以及山东省自然科学基金（ZR2022QH291，ZR2025MS1199）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗α-SMA 抗体Proteintech14395-1-AP免疫组化中用作一抗，用于检测α-SMA 表达并评估肌成纤维细胞活化状态
血尿素氮（BUN）检测试剂盒南京建成生物工程研究所有限公司C013-2-1用于定量血清BUN水平，评估残余肾功能
肌酐（CRE）检测试剂盒南京建成生物工程研究所有限公司C011-2-1用于定量血清肌酐水平，评估残余肾功能
气体麻醉系统南京卡文斯生物科技有限公司KW-MZJ-4配备异氟烷，用于全身麻醉
GraphPad Prism 软件GraphPad Software, Inc.N/A用于数据的统计分析与图形化呈现（https://www.graphpad.com）
恒温监测系统Conduct ScienceCS-HS-0001配备直肠探头，用于闭环式连续核心体温监测与调控
ImageJ 软件美国国立卫生研究院N/A开源软件，用于纤维化区域和免疫组化信号的形态计量学定量分析
异氟烷RWD 生命科学有限公司 R510-22手术过程中使用的吸入性麻醉剂
Masson’s 三色染色试剂盒碧云天C0189M用于胶原沉积的定量分析
无创血管显微夹ROBOZ 外科器械公司RS-5481T用于夹闭肾蒂28分钟
多聚甲醛（4%）碧云天生物技术公司P0099-100ml用于快速固定采集的肾组织样本
柠檬酸钠缓冲液（10 mM，pH 6.0）赛默飞世尔科技公司 005000免疫组化染色前用于热诱导抗原修复
立体定位手术显微镜北京中天广正科技有限公司TS-39NK用于实施缺血-再灌注损伤（IRI）手术

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