我们描述了一种物理限制方法，可从Xenopus laevis单细胞胚胎制备微型胚胎。
本文内容
摘要
摘要
早期胚胎发育的一个显著特征是单个细胞尺寸呈快速指数级减小，而整体胚胎体积保持不变。细胞核与细胞质的比例（N:C 比值）在调控早期胚胎发育所必需的细胞与分子活动中起着关键作用。因此，对胚胎大小进行物理操控，成为研究这些发育机制的重要手段。Xenopus laevis 早期胚胎具有较大的尺寸（直径约 1.2 mm）和高度的发育可塑性，是进行物理解剖与操作以探究发育调控机制的理想模型。本文介绍一种通过毛发结扎法约束单细胞期 Xenopus laevis 胚胎，从而获得细胞质体积和 N:C 比值发生改变的微型胚胎的方法。研究表明，这些微型胚胎能够直接因细胞尺寸缩小和 N:C 比值升高而启动早期合子基因组激活（ZGA）。此类微型胚胎可推广至其他胚胎系统，因而为解析细胞大小介导的早期胚胎发育机制提供了一种独特而强大的工具。
引言
早期胚胎发育最显著的特征之一，是在胚胎总体积保持不变的情况下，单个细胞尺寸呈指数级减小。快速的DNA合成与细胞尺寸的缩小导致核质比（N:C比）升高，这一变化在多种模式生物胚胎系统中对调控囊胚中期转换（MBT）的关键活动具有重要作用，包括合子基因转录、细胞周期延长以及细胞运动能力1,2,3,4。通过改变DNA倍性来调控N:C比的实验操作，在多个模式系统中均证实了该比值在早期胚胎发育中的功能重要性3,4,5,6。
对胚胎大小进行物理操控是研究早期胚胎发育调控机制的重要技术7。通过吸出法去除细胞质可改变小鼠早期胚胎的核质比（N:C ratio），从而诱导过早发生致密化8。此外，通过切割减小斑马鱼胚胎的尺寸，揭示了一种基于浓度梯度的体节比例调节新机制9。进一步研究表明，在Xenopus胚胎中减少细胞质体积可揭示核质比依赖性的细胞周期动态变化10。更重要的是，通过减小Xenopus胚胎细胞尺寸并利用5-乙炔基尿苷（5-EU）对单个细胞中新合成的转录本进行标记，我们证明了细胞尺寸的减小以剂量依赖的方式诱导合子基因组激活（ZGA）11。这些结果支持了细胞大小在早期胚胎发生过程中发挥关键作用的观点。
本文介绍了一种通过使用毛发结对Xenopus laevis胚胎进行物理操作来生成微型胚胎的详细实验步骤（图1）10,11。该方法基于Newport和Kirschner（1982年）提出的利用毛发环收缩早期Xenopus胚胎的开创性工作1，提供了一种清晰且可靠的微型胚胎制备方案，可作为研究早期胚胎发育的实验工具。此外，该方法也可应用于其他胚胎系统7，有助于揭示早期胚胎发生的新机制。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本研究所涉及的动物实验已获得南卡罗来纳大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 准备材料
- 配制溶液
- 通过混合 100 mM HEPES、2 mM EDTA、2 M NaCl、40 mM KCl、20 mM MgCl2 和 40 mM CaCl2 配制 20× MMR。用 NaOH 调节 pH 至 7.8。经高压灭菌后，室温保存。
- 将 1.5 g 密度梯度介质加入 50 mL 0.5× MMR 中，配制成 3% 密度梯度介质溶液（质量/体积）。用磁力搅拌器轻轻搅拌，直至聚合物完全溶解。4 °C 保存，待用。
- 将 0.5 g 琼脂糖加入 50 mL 0.1× MMR 中，在 60 mm 培养皿中配制 1% 琼脂糖凝胶。用微波炉加热溶解琼脂糖，然后取 5 mL 琼脂糖溶液均匀涂布于 60 mm 培养皿底部，形成薄层。
- 制备用于束缚胚胎的发丝结
- 取若干细发丝，剪成约 5 cm 的小段。
- 用镊子将发丝一端插入 P10 吸头约 1 cm 深。
- 将石蜡置于勺中加热熔化。迅速将带发丝的 P10 吸头浸入熔化的石蜡中，静置 1 分钟使其干燥。确保发丝固定在 P10 吸头末端。
- 用镊子小心地将发丝打一个单结，调节环的大小至约 1.5 mm。如有需要，剪去多余部分。将制好的结放置一旁备用。
- 重复上述步骤，根据需要制备更多发丝结。
2. 制备 非洲爪蟾 微型胚胎
- 获得 非洲爪蟾 胚胎，遵循标准方案进行 体外 体外受精（IVF）（例如，参见 Sive 等，2007）12胚胎应置于0.1× MMR中，备用。
- 为了在早期胚胎的单细胞中可视化合子基因组激活（ZGA）并研究其调控机制，将5-乙炔基尿苷（5-EU）显微注射至1细胞期胚胎中，以对新生转录本进行代谢标记11,13 在进行以下操作之前。
- 当胚胎发育至受精后约1小时（hpf）时，使用塑料移液管将约20个胚胎转移至一个60 mm培养皿中（培养皿内含约15 mL 3%密度梯度培养基/0.5× MMR，并覆盖有1%琼脂糖凝胶）。
- 用一只手使用镊子在体视显微镜下将胚胎旋转约45–60度，以暴露植物极（颜色较浅的半球）。用镊子固定倾斜的胚胎，另一只手使用30号针头小心刺破植物极。轻轻按压胚胎，释放少量细胞质。
- 将固定在P10枪头上的发丝结小心地覆盖于胚胎上，使动物极（深色半球）位于发丝结内部。根据所需微型胚胎的大小调整发丝结的位置。
- 一手持P10移液枪，另一手用镊子将结的两个绳头向相反方向拉紧。毛发结会收紧于胚胎上，位置位于动物极（完整）与植物极（细胞质已释放）之间。在毛发结与P10枪头连接处将其剪断。
- 重复上述步骤 2.4–2.6，以制备所需数量的微型胚胎。
- 让胚胎在3%密度梯度培养基/0.5× MMR中静置约1–2小时。随后用P1000移液器小心吸除培养基，避免扰动胚胎，并加入15 mL的0.1× MMR。
- 让胚胎发育至所需阶段，然后用镊子小心地从微型胚胎中移除结节。
- 收集用于所需分析的胚胎，例如在单细胞水平上观察合子基因组激活（ZGA）11,13.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在单细胞期使用毛发结扎法对Xenopus laevis胚胎进行收缩处理，操作如上所述。在约第9期（23 °C下8.5小时）时，利用体视显微镜观察对照组胚胎和微型胚胎。如图2所示，部分微型胚胎的体积约为对照组胚胎的1/3。该结果表明，早期Xenopus胚胎可通过操作生成微型胚胎，从而为研究细胞大小对早期胚胎发生过程中细胞周期动态10和基因组激活11的影响提供了一个独特的模型。该模型也可作为研究早期胚胎发育调控机制的有力工具。
...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文介绍了一种通过使用毛发结对Xenopus单细胞期胚胎进行物理限制来生成微型胚胎的方法。该方法为减小细胞体积可在模式胚胎中诱导合子基因组激活（ZGA）提供了直接证据11。
该方案中有多个关键方面对于成功生成微型胚胎至关重要。制作发结时，应使用细而坚韧的毛发，最好采用婴儿的头发。毛发越粗或越易碎，制作和使用发结就越困难。此外，应避免使用经过染发剂或人工柔顺剂处理过的毛发，因为这些化学物质可能对胚胎具有毒性。作为替代方案，某些类型的外科缝合线也可用于胚胎的约束（尽管成本高于发结）；但需注意，应根据具体材料，在用于生成微型胚胎前预先测试其强度和柔韧性。
在进行收缩之前，必须将发结放置在胚胎的适当位置，以确保细胞核被包含在最终形成的微型胚胎中。由于雌性原核位于动物极附近，而精子进入位点通常位于动物半球14，因此包含动物极区域的细胞质是成功生成微型胚胎的关键。完成收缩后，应尽量避免扰动胚胎，直至其发育至所需阶段。
...访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无竞争利益。
致谢
感谢宾夕法尼亚大学 Matthew Good 实验室提供培训。本工作部分由尤妮斯·肯尼迪·施莱佛国家儿童健康与人类发育研究所（R03HD105802）资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 30 号针头 | BD Medical | 305128 | 用于刺穿胚胎 |
| 60 mm 一次性培养皿 | VWR | 25384-092 | 用于胚胎孵育 |
| ACCU-SCOPE 3075 变焦体视显微镜 | VWR | 470351-130 | 用于观察胚胎 |
| 琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A-9414 | 用于包被培养皿 |
| Dumont 镊子，5 型 | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | 用于调整和夹持胚胎 |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | GE17-0300-10 | 用于胚胎孵育 |
| TipOne 移液器吸头，10 µL | USA Scientific | 1111-3700 | 用于固定毛发结 |
| 黑色蜡块 | Carolina Biological Supply Co. | 974228 | 用于固定毛发结 |
参考文献
- Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. Characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30 (3), 675-686 (1982).
- Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription. Cell. 30 (3), 687-696 (1982).
- Kane, D. A., Kimmel, C. B. The zebrafish midblastula transition. Development. 119 (2), 447-456 (1993).
- Lu, X., Li, J. M., Elemento, O., Tavazoie, S., Wieschaus, E. F. Coupling of zygotic transcription to mitotic control at the Drosophila mid-blastula transition. Development. 136 (12), 2101-2110 (2009).
- Jevtic, P., Levy, D. L. Both nuclear size and DNA amount contribute to midblastula transition timing in Xenopus laevis. Sci Rep. 7 (1), 7908(2017).
- Edgar, B. A., Kiehle, C. P., Schubiger, G. Cell cycle control by the nucleo-cytoplasmic ratio in early Drosophila development. Cell. 44 (2), 365-372 (1986).
- Chen, H., Qian, W., Good, M. C. Integrating cellular dimensions with cell differentiation during early development. Curr Opin Cell Biol. 67, 109-117 (2020).
- Lee, D. R., Lee, J. E., Yoon, H. S., Roh, S. I., Kim, M. K. Compaction in preimplantation mouse embryos is regulated by a cytoplasmic regulatory factor that alters between 1- and 2-cell stages in a concentration-dependent manner. J Exp Zool. 290 (1), 61-71 (2001).
- Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145 (11), dev161257(2018).
- Clute, P., Masui, Y. Regulation of the appearance of division asynchrony and microtubule-dependent chromosome cycles in Xenopus laevis embryos. Dev Biol. 171 (2), 273-285 (1995).
- Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Xenopus laevis in vitro fertilization and natural mating methods. CSH Protoc. 2007, pdb prot4737(2007).
- Chen, H., Good, M. C. Imaging nascent transcription in wholemount vertebrate embryos to characterize zygotic genome activation. Methods Enzymol. 638, 139-165 (2020).
- Meaders, J. L., Burgess, D. R. Microtubule-based mechanisms of pronuclear positioning. Cells. 9 (2), 505(2020).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表
申请许可