颅内乳腺癌脑转移小鼠模型用于脑膜和嗅球中免疫细胞与基质细胞的表征

摘要

本方案通过颅内接种建立乳腺癌脑转移模型，并利用流式细胞术表征调控脑部免疫的关键淋巴细胞和免疫细胞亚群。这些分析有助于揭示塑造脑微环境的免疫细胞与基质细胞动态变化，为开发新的治疗策略提供依据。

摘要

中枢神经系统（CNS）被特殊的免疫界面所包围，包括脑膜和嗅球，这些结构既可作为转移性肿瘤定植的通路，也可作为抗肿瘤免疫应答的入口。了解在转移进展过程中这些结构内免疫细胞动态变化的机制，对于识别支持或限制脑内肿瘤生长的机制至关重要。本方案详细描述了通过将 E0771 乳腺癌细胞颅内注射至 C57BL/6 小鼠体内，建立乳腺癌脑转移（BCBM）小鼠模型的方法。在肿瘤形成后，仔细分离脑膜和嗅球组织，经酶消化处理获得单细胞悬液。随后利用多参数光谱流式细胞术对这些细胞群体进行分析，全面表征与中枢神经系统相关的免疫微环境中淋巴细胞、髓系细胞及基质细胞亚群的组成。该工作流程支持对荷瘤小鼠与非荷瘤对照小鼠进行比较分析，识别可能介导肿瘤免疫逃逸并作为潜在治疗靶点的中枢神经系统免疫界面改变。总体而言，本方案提供了一种可重复的研究 BCBM 的方法，并可用于探究中枢神经系统与外周免疫系统交界处的免疫调控机制。该方法可进一步拓展应用于其他癌细胞系、免疫治疗手段或基因工程小鼠模型，以研究脑微环境中的免疫抵抗机制及治疗反应。

引言

脑转移瘤是影响中枢神经系统（CNS）最常见的恶性肿瘤，其发生频率高于原发性脑肿瘤。肺癌、乳腺癌和黑色素瘤是最常发生脑转移的原发性癌症¹。其中，乳腺癌脑转移（BCBM）构成了重大的临床挑战，影响约10%–30%的转移性癌症患者，且由于全身治疗的改善和神经影像学技术的进步，其发病率呈上升趋势²。BCBM患者的预后仍然较差，目前可用的治疗方法——包括手术、放疗和化疗——主要是姑息性的，且神经系统症状严重影响患者的生活质量³。尽管靶向治疗和免疫治疗正在被探索作为补充治疗策略，但免疫治疗在脑转移瘤中的临床获益仍然有限^4,5,6。

近期研究深化了我们对脑免疫系统的理解，并重新激发了对与中枢神经系统相关的功能性淋巴通路的兴趣，包括脑膜⁷和鼻黏膜⁸中的淋巴管。这些结构构成了环绕大脑的连续淋巴网络，延伸至嗅球和筛骨板附近，并最终连接到颈部淋巴结。该系统在维持液体稳态、免疫监视以及中枢神经系统与外周淋巴器官之间的免疫细胞迁移中发挥关键作用⁹。随着针对脑肿瘤及转移灶的免疫治疗策略日益受到关注，这些淋巴-免疫交界面正逐渐被视为具有潜力但尚待深入研究的通路，可能介导全身免疫系统与颅内病灶之间的信息交流。此外，调控免疫细胞向脑肿瘤微环境募集的机制，以及这些细胞在此特殊环境中相互作用的方式，目前仍不清楚。上述知识空白共同凸显了建立能够全面分析肿瘤-免疫相互作用的临床前模型和实验方法的必要性，以支持开发增强抗脑转移瘤免疫应答的新策略。

本文描述了一种结合立体定位颅内接种E0771细胞以建立可重复的、具有免疫活性的乳腺癌脑转移（BCBM）小鼠模型，并通过光谱流式细胞术对脑膜和嗅球进行分离与解离，进而开展免疫表型分析的实验方案。该方法可实现对BCBM的可控性建模，用于评估治疗干预措施的安全性和有效性，同时能够深入表征脑淋巴-免疫交界处的免疫细胞和基质细胞群体，有助于揭示塑造脑肿瘤微环境并影响治疗反应的关键细胞成分。

动物模型对于研究脑转移仍然不可或缺，因为转移进展的许多关键方面无法被复制 体外. 多个 体内 已开发出多种用于产生脑转移的小鼠模型，每种模型均有其特定的优势与局限性¹⁰自发性转移模型，包括原位移植或基因工程小鼠模型，虽能更接近地模拟临床疾病进展，但极少产生颅内病灶，需要较长的实验周期，且常因广泛的颅外疾病而导致较高的变异性。系统性方法，包括心内注射、颈动脉注射或尾静脉注射，可将肿瘤细胞引入循环系统，更好地模拟血行播散、血脑屏障外渗及定植过程。然而，这些模型无法再现原发肿瘤侵袭的早期阶段，且常导致广泛且变异较大的颅外转移，尤其是肺部转移。在系统性模型中，颈动脉注射的变异性最低，但需要较高的外科操作技术。相比之下，颅内注射具有多项优势，包括对肿瘤位置的精确控制、快速且可重复的肿瘤生长，以及实验间变异性的降低。该方法还可与原位原发肿瘤移植联合，随后进行手术切除，以更准确地模拟转移过程。尽管颅内注射不能重现完整的转移级联过程，也不适用于研究早期侵袭与播散，但它为评估针对已建立病灶的治疗效果以及探究脑内微环境中的相互作用提供了可靠的模型。已知的局限性在于，注射操作本身可能诱发局部神经炎症，从而可能影响免疫检测结果，这一点可通过比较注射与非注射小鼠的免疫谱型进行评估。

脑膜和嗅球的免疫学特征研究仍是一个相对较新且尚未充分探索的研究领域。大多数研究依赖全脑或颈部淋巴结样本¹¹，这些样本无法捕捉到这些与淋巴系统相关组织独特的细胞组成和特化的免疫功能。同时获取这两个结构可更全面、更深入地了解脑部免疫状态。当结合多参数光谱流式细胞术时，该实验流程能够高通量地分析参与中枢神经系统与外周免疫交流的常见及稀有免疫细胞群体。该方法包括对表面和细胞内标志物的定量，以鉴定细胞亚群、评估活化状态以及检测治疗引起的改变。本方案未涵盖的其他中枢神经系统免疫分析方法包括免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF），这些方法虽能保留免疫细胞的空间分布信息，但受限于标记物多重检测能力低、定量主观性强以及对稀有细胞类型的表征不足¹²。近年来，单细胞RNA测序（scRNA-seq）通过高分辨率揭示细胞状态和转录程序，拓展了对中枢神经系统免疫群体的分析能力。尽管scRNA-seq可提供强大的转录组学洞察，但其应用仍受限于成本高、组织解离带来的技术假象、转录本丢失以及缺乏蛋白水平的分辨率^13,14。流式细胞术虽无法进行空间分析，且对解离相关效应较为敏感，但凭借先进的多参数检测面板，可在表型解析方面提供更高分辨率，并实现可靠的定量免疫分析。

综上所述，本文所述的方法为脑转移性乳腺癌建模以及研究中枢神经系统淋巴界面的免疫动态提供了灵活而强大的平台，有助于针对脑肿瘤微环境及其相关免疫调控通路的临床前治疗策略的开发。

方案

所有动物实验均按照里斯本大学药学院的指导方针进行。实验方案经葡萄牙动物保护主管机构——食品与兽医总局审查并批准（编号 0421/000/000/2021）。

1. E0771细胞的准备 体内 植入

1. 在无菌操作台中，使用添加了10% (v/v) 胎牛血清（FBS）和1% (v/v) 青霉素-链霉素（PEST）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），在T75培养瓶中培养E0771细胞。
   1. 确保从供应商处收到细胞后，通过短串联重复序列（STR）分析进行细胞鉴定，并通过常规检测确认无支原体污染。解冻后需将肿瘤细胞传代培养至少2–8代，方可进行脑内植入。
2. 在植入当天，确保细胞状态良好且融合度达到80–90%。吸除培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
3. 向培养瓶中加入胰蛋白酶，于37 °C孵育5分钟。随后加入三倍体积的完全培养基（含10% v/v FBS和1% v/v PEST的DMEM）以中和胰蛋白酶并使细胞解离。
4. 将细胞转移至离心管中，在室温（RT）下以300 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于PBS中用于细胞计数。
5. 再次离心（300 × g，5分钟），弃去上清液，并将细胞重悬于PBS中，调整浓度为每只动物2 μL含1 × 10⁵个E0771细胞。细胞悬液置于冰上保存，直至接种。应在注射前立即配制细胞悬液。

2. 使用立体定位仪进行颅内肿瘤接种

1. 获取6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠，在手术前至少于动物饲养设施中适应7天。将小鼠饲养在控制条件下，保持12小时光照/12小时黑暗循环，并提供食物和水 随意摄取.
   注意：建议每个实验组至少使用五只动物，以确保在荷瘤组与对照组之间进行有意义的免疫谱比较时具有足够的统计学效力。
2. 在开始操作前，准备好手术区域及所有所需材料：
   1. 手术器械：手术刀片、剪刀、镊子、持针器、缝合线。
   2. 设备及其他：立体定位仪、玻璃注射器、钻头、剃毛器、棉签、加热垫。
   3. 麻醉：在15 mL离心管中，用PBS配制氯胺酮-赛拉嗪（K-X）溶液（浓度分别为25 mg/mL和2 mg/mL）。
   4. 镇痛：在15 mL离心管中，用PBS配制浓度为15 μg/mL的丁丙诺啡溶液。
   5. 其他溶液：聚维酮碘、3% v/v 过氧化氢（H₂O₂）₂O₂），眼膏。
      警告：H₂O₂ 吞食有害，可引起皮肤刺激。
3. 通过腹腔（i.p.）注射K-X（每10克体重100 μL）对小鼠进行麻醉。通过脚趾夹捏无反应确认麻醉充分。
4. 在两只眼睛上涂抹眼药膏以防止脱水，并在整个手术过程中将小鼠置于加热垫上。
5. 剃除头皮毛发，使用聚维酮碘对术区进行消毒。沿中线做一1 cm的纵向切口，暴露颅骨。
6. 用 H 清洁暴露的颅骨₂O₂ 用棉签以画圈方式擦拭以显露前囟。若产生过多泡沫，则用干燥棉签将其清除。
7. 将小鼠置于立体定位仪框架中。以前囟为参考点（0.0），测量前囟外侧2.5 mm、前方0.5 mm处。标记注射位点。
8. 移除小鼠，并在标记的坐标处钻一个小孔。注意不要钻得过深，以免造成脑组织损伤。
9. 将注射器安装到注射仪上。重悬细胞，并用玻璃注射器吸取足够进行两次注射的体积（4–5 μL）。每次制备不超过两次注射的量，以避免细胞沉降。
10. 将小鼠重新置于立体定位仪中，使针头对准钻孔位置，并缓慢插入脑实质至3.0 mm深度。以1 μL/min的速度注射细胞（或无菌PBS作为假手术对照）。
11. 注射后，将针头留置在原位至少1分钟，然后回撤1.5 mm，再保持1分钟，最后完全抽出。此操作可最大限度减少反流，确保细胞准确沉积。
12. 用缝线闭合切口，并涂抹聚维酮碘。皮下注射布托啡诺（100 μL）。
13. 将小鼠置于加热垫上直至从麻醉中完全恢复。将小鼠放回清洁的笼具中，并每日监测其是否有痛苦、神经学异常或感染迹象。

3. 小鼠心脏内灌注

1. 通过腹腔注射 K-X（每 10 g 体重注射 100 μL）使小鼠麻醉。通过夹捏脚趾无反应来确认麻醉充分。
2. 使用剪刀在腹壁上做 5–6 cm 的切口，并在肋骨上做两个切口直至锁骨。注意避免切断任何主要血管。
3. 暴露心脏后，剪开右心房以允许血液流出。使用配备 25G × 1 英寸针头的 20 mL 注射器向左心室注入冰冻 PBS。
4. 当流出液体无血时停止灌注。对于成年小鼠，大约需要 20 mL PBS。

4. 小鼠脑膜和嗅球的分离

1. 心脏灌流后，使用手术剪将小鼠断头，完全去除头皮以暴露颅骨。
2. 用剪刀从颅骨后部向眼部方向沿横断面剪开颅骨，注意避免损伤下方的脑组织。使用精细镊子轻柔取出脑组织，避免接触或刮擦颅骨内表面。
3. 取出脑组织后，硬脑膜仍附着于颅骨内表面。将颅骨浸入冰上预冷的 PBS 中至少 5 分钟，以利于完整分离脑膜。
4. 从脑组织前部解剖分离嗅球，并将其转移至冰上预冷的 PBS 中暂存，待后续处理。
5. 使用尖头镊子，通过轻柔提起并剥离薄层组织，将脑膜从颅骨内表面小心分离。将分离的脑膜转移至冰上预冷的 PBS 中，待进一步处理。操作过程中应避免撕裂组织，以确保最佳的下游细胞回收率。

5. 组织解离为单细胞

1. 脑膜
   1. 将脑膜转移至含有0.05%胶原酶II和DNase I的3 mL RPMI 1640培养基中。在37 °C孵育20分钟，每10分钟轻轻振荡一次。过度消化会降低细胞活力，应避免。
   2. 将消化后的组织通过40 μm细胞筛网过滤至50 mL离心管中。通过轻轻按压注射器活塞对残留组织进行机械解离，并用5 mL PBS洗涤。
   3. 在4 °C下以300 x g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于3 mL PBS中。
   4. 重复离心操作。弃去上清液，将最终沉淀重悬于剩余液体中，并转移至U型底96孔板中。
2. 嗅球
   1. 移除PBS，使用注射器活塞对组织进行机械解离。加入3 mL含有0.02%胶原酶II的Hanks平衡盐溶液（HBSS）。在37 °C孵育20分钟，每10分钟轻轻振荡一次。
   2. 将细胞悬液通过70 μm筛网过滤至50 mL离心管中，并用10 mL PBS洗涤。
   3. 在4 °C下以300 x g离心5分钟。弃去上清液，将最终沉淀重悬于剩余液体中，转移至U型底96孔板中。
3. 将板置于4 °C保存，直至染色。
   注意：为确保最佳细胞活力，应在同一天内完成染色。

6. 细胞染色与流式细胞术检测

1. 面板设计
   1. 请参见表1。
      ​注意：本方案中的面板是为配备4个激光器（紫色、蓝色、黄绿色和红色）以及总共51个检测器（48个荧光通道 + 3个散射通道）的光谱流式细胞仪设计的。面板的设计需根据流式细胞仪的具体配置以及目标蛋白/标记物进行调整。
2. 细胞染色
   1. 将U型底96孔板在4 °C条件下以300 × g离心5分钟，小心弃去上清液。从该步骤开始，所有操作均需避光。
   2. 向相应的孔中加入50 μL活力染料（FVD，用PBS按1:5000稀释），室温孵育20分钟。加入150 μL PBS洗涤，4 °C条件下以300 × g离心5分钟，弃去上清液。仅在活力对照和样品中加入活力染料。
   3. 将细胞与30 μL抗CD16/CD32抗体（用FACS缓冲液即含2 mM EDTA和0.5% BSA的PBS配制，浓度为0.01 μg/mL）在冰上孵育10分钟以阻断Fc受体。用170 μL FACS缓冲液洗涤，4 °C条件下以300 × g离心5分钟，弃去上清液。
   4. 加入30 μL抗体混合液或单色对照（根据材料表中所列抗体稀释比例，用FACS缓冲液配制），冰上孵育20分钟。用170 μL FACS缓冲液洗涤，4 °C条件下以300 × g离心5分钟，弃去上清液。
   5. 用100 μL含2%多聚甲醛（PFA）的PBS在室温固定细胞20分钟。加入100 μL PBS洗涤，4 °C条件下以300 × g离心5分钟，弃去上清液。
      注意：对于细胞内标记物，应使用商业化的固定和破膜缓冲液替代此步骤，并在最终重悬前完成细胞内染色。
   6. 将最终的细胞沉淀重悬于200 μL FACS缓冲液中。将96孔板置于4 °C保存，直至在流式细胞仪上进行检测。
3. 单色染色和荧光减一对照（FMO）
   1. 单色染色样本用于优化解混算法。应选择表达阳性与阴性峰的标记物对应的细胞作为单色染色样本。若无法获得合适细胞，则推荐使用补偿微珠以获得最佳解混效果。请根据制造商说明书制备荧光标记抗体对应的补偿微珠。
      注意：制备FMO对照是实现正确设门的重要步骤，尤其适用于那些未呈现清晰阳性和阴性峰的标记物。根据需要为不同荧光染料制备多个FMO样本。
   2. 按照第6.2节步骤制备细胞表面抗原的FMO样本，但在第6.2.4步中从抗体混合液中排除目标抗体。
4. 流式细胞术检测与数据分析
   1. 开启细胞仪，启动流式细胞仪采集软件。在仪器预热期间（至少30分钟），准备质控（QC）微珠：将1滴微珠加入300 µL PBS中，置于12 × 75 mm样品管中。
   2. 清洗仪器：以高流速运行10%（v/v）次氯酸钠溶液3分钟，随后运行H₂O 30分钟。之后将流速调回低速，进行后续步骤。
   3. 选择QC模块，加载样品管并点击“开始”运行微珠。当质控完成后，系统将弹出“通过”提示。
   4. 进入采集模块，选择或创建实验项目，通过FSC和SSC设门开始采集。依次采集未染色样本和单色对照，运行解混向导并保存设置，然后继续采集染色样本。

结果

在将E0771细胞进行颅内接种后，小鼠在预定的立体定位坐标处形成了局灶性乳腺癌病灶。靶向纹状体实质的立体定位坐标（2.5 mm 侧向，0.5 mm 前向于前囟，以及从前囟向下3.0 mm）是根据标准小鼠脑图谱及既往报道的颅内植入方法选定的^15,16。该区域因易于操作、支持肿瘤移植且能最大限度减少细胞向脑室或注射路径泄漏，被广泛用于颅内肿瘤植入实验。在本方案中，注射1 × 10⁵个E0771细胞后，至第10天即可观察到明确的肿瘤负荷（图1A），而肿瘤最大生长通常出现在第13–14天左右。基于此生长动力学特征，选择第10天作为实验终点，以研究肿瘤快速扩张晚期阶段之前的肿瘤-免疫相互作用。然而，肿瘤生长速度取决于接种细胞的数量及其内在侵袭性，因此会影响实验的时间安排。

在整个研究过程中，定期对小鼠进行监测。每2–3天记录一次体重，因为体重下降是健康状况恶化的早期指标（

讨论

通过结合颅内肿瘤植入与脑膜和嗅球的分离、解离及免疫表征，本方案可对脑肿瘤微环境与中枢神经系统相关免疫界面之间的动态相互作用进行深入研究。该方法能够实现可重复的颅内肿瘤形成、获得高质量的单细胞悬液，并对免疫细胞亚群进行有效解析。然而，颅内植入跳过了转移级联反应的早期阶段，无法完全模拟自发性脑转移过程。因此，关注早期播散过程的研究人员可能更倾向于采用全身接种策略。尽管如此，本方案中的免疫分析部分在不同的脑转移模型中均具有广泛的适用性。

组织处理会带来额外的挑战。脑膜和嗅球是细胞数量有限的小型组织，过度的机械破坏、酶消化过度或孵育时间过长均会显著降低活细胞的回收率。在反复的离心和洗涤步骤中也可能发生细胞丢失。因此，精确的解剖操作、适度的酶消化、轻柔的操作以及仔细的上清液去除，对于获得适用于流式细胞术的纯净且具有活性的单细胞悬液至关重要。同时，光谱流式细胞术需要优化的抗体组合、正确的信号解混以及严格的对照设置，包括单色染色对照和荧光减一对照（FMO），以确保免疫细胞和基质细胞亚群的准确分辨。

尽管存在这些技术上的考虑，该方案相比更广泛...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 594 抗小鼠 CD45R/B220 抗体（克隆 RA3-6B2）	BioLegend	103254	使用稀释比例为 1:300
Alexa Fluor 700 抗小鼠 CD8 抗体（克隆 53-6.7）	BioLegend	100730	使用稀释比例为 1:50
APC 抗小鼠 P2RY12 抗体（克隆 S16007D）	BioLegend	848006	使用稀释比例为 1:80
Betadine	Selleck Biotechnology GmbH	S4678-100mg	聚维酮碘
牛血清白蛋白（BSA），冻干粉末，≥96%（琼脂糖凝胶电泳）	Sigma-Aldrich	A2153	用于配制 FACS 缓冲液
Brilliant Violet 421 抗小鼠 Podoplanin 抗体（克隆 8.1.1）	BioLegend	127423	使用稀释比例为 1:80
Brilliant Violet 510 抗小鼠 CD11b 抗体（克隆 M1/70）	BioLegend	101263	使用稀释比例为 1:30
Brilliant Violet 570 抗小鼠 NK1.1 抗体（克隆 PK136）	BioLegend	108733	使用稀释比例为 1:40
Brilliant Violet 650 抗小鼠 CD19 抗体（克隆 6D5）	BioLegend	115541	使用稀释比例为 1:50
Brilliant Violet 711 抗小鼠 CD44 抗体（克隆 IM7）	BioLegend	103057	使用稀释比例为 1:80
Brilliant Violet 785 抗小鼠 F4/80 抗体（克隆 BM8）	BioLegend	123141	使用稀释比例为 1:40
Bupaq 3 mg/mL	Bio5	1002241	丁丙诺啡
40-μm 细胞筛	Avantor	732-2757
70-μm 细胞筛	Avantor	732-2758
Centrifuge 5910 Ri	Eppendorf	5943000011
II 型胶原酶	Worthington Biochemical Corporation	LS004176
Corning Matrigel 生长因子减少型基底膜基质	Corning	356231
Cytek Aurora 光谱流式细胞仪	Cytek Biosciences
DNase I	Worthington Biochemical Corporation	LS002006
钻机	Stoelting Europe	51630
DMEM 高糖培养基，含丙酮酸钠	Gibco	41966029
E0771 细胞系	ATCC	CRL-3436
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）	Merck	E4884	用于配制 FACS 缓冲液
FCS Express 流式细胞术分析软件	De Novo Software
胎牛血清（FBS）	Gibco	A5256801
FITC 抗小鼠 CD3 抗体（克隆 17A2）	BioLegend	100204	使用稀释比例为 1:50
Ghost Dye Red 780	Cytek Biosciences	13-0865-T500	活率染料（使用稀释比例为 1:5000）
HBSS，含钙、镁，不含酚红	Gibco	14025092
加热垫	MOBICLINIC
过氧化氢 34.5 至 37%（H2O2）	ACROS	10002780
Ketamax 100 mg/mL	Bio3	1009495	氯胺酮
Lubrithal 眼用凝胶	Bio4	1731329
N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）1M	Gibco	15630080
多聚甲醛（PFA）16%	Avantor	43368	用于配制固定缓冲液
Pacific Blue 抗小鼠 Ly-6G 抗体（克隆 1A8）	BioLegend	127612	使用稀释比例为 1:50
PE 抗小鼠 Ly-6C 抗体（克隆 HK1.4）	BioLegend	128008	使用稀释比例为 1:300
PE 抗小鼠 P2RY12 抗体（克隆 S16007D）	BioLegend	848004	使用稀释比例为 1:80
PE/Cyanine5 抗小鼠 CD11c 抗体（克隆 N418）	BioLegend	117316	使用稀释比例为 1:80
PE/Cyanine7 抗小鼠 CD80 抗体（克隆 16-10A1）	BioLegend	104734	使用稀释比例为 1:100
PE-eFluor 610 抗小鼠 CD31 抗体（克隆 390）	eBioscience	61-0311-82	使用稀释比例为 1:160
PE/Fire 810 抗小鼠 I-A/I-E 抗体（克隆 M5/114.15.2）	BioLegend	107667	使用稀释比例为 1:300
青霉素-链霉素（PEST），10,000 U/mL	Gibco	15140-122
PerCP/Cyanine5.5 抗小鼠 CD45 抗体（克隆 30-F11）	BioLegend	103132	使用稀释比例为 1:80
磷酸盐缓冲液（PBS）10X，pH 7.4	Gibco	70011044
Prism（版本 10）	GraphPad
RN 针头（27/51/3）S	Hamilton Company	7762-01
RPMI 1640 培养基，含 GlutaMAX 补充物	Gibco	61870044
手术刀片，碳钢	B Braun	BB510
Sedaxylan 20 mg/mL	Bio2	1112384	赛拉嗪
Spark Blue 574 抗小鼠 CD4 抗体（克隆 GK1.5）	BioLegend	100490	使用稀释比例为 1:50
立体定位仪	Stoelting Europe	51730D
缝合线 Silkam 黑色 5/0 10x45 cm	B Braun	C0266639	不可吸收
手术器械套装（剪刀、钳子和镊子、持针器）	Stoelting Europe	52189
0.5 mL 注射器，带 0.3x12 mm 针头	B Braun	9151125
TruStain FcX PLUS 抗小鼠 CD16/32 抗体（克隆 S17011E）	BioLegend	156604	FcR 封闭剂（使用稀释比例为 1:50）
台盼蓝溶液 0.4%	Sigma-Aldrich	T8154
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红	Gibco	25200-072
U 型底 96 孔板	Avantor	734-2328
50 mL 离心管	Avantor	525-0610
701 RN 微量™ 注射器	Hamilton Company	548-2273