颅内乳腺癌脑转移小鼠模型用于脑膜和嗅球中免疫细胞与基质细胞的表征

摘要

本方案通过颅内接种建立乳腺癌脑转移模型，并利用流式细胞术表征调控脑部免疫的关键淋巴细胞和免疫细胞亚群。这些分析有助于揭示塑造脑微环境的免疫细胞与基质细胞动态变化，为开发新的治疗策略提供依据。

摘要

中枢神经系统（CNS）被特殊的免疫界面所包围，包括脑膜和嗅球，这些结构既可作为转移性肿瘤定植的通路，也可作为抗肿瘤免疫应答的入口。了解在转移进展过程中这些结构内免疫细胞动态变化的机制，对于识别支持或限制脑内肿瘤生长的机制至关重要。本方案详细描述了通过将 E0771 乳腺癌细胞颅内注射至 C57BL/6 小鼠体内，建立乳腺癌脑转移（BCBM）小鼠模型的方法。在肿瘤形成后，仔细分离脑膜和嗅球组织，经酶消化处理获得单细胞悬液。随后利用多参数光谱流式细胞术对这些细胞群体进行分析，全面表征与中枢神经系统相关的免疫微环境中淋巴细胞、髓系细胞及基质细胞亚群的组成。该工作流程支持对荷瘤小鼠与非荷瘤对照小鼠进行比较分析，识别可能介导肿瘤免疫逃逸并作为潜在治疗靶点的中枢神经系统免疫界面改变。总体而言，本方案提供了一种可重复的研究 BCBM 的方法，并可用于探究中枢神经系统与外周免疫系统交界处的免疫调控机制。该方法可进一步拓展应用于其他癌细胞系、免疫治疗手段或基因工程小鼠模型，以研究脑微环境中的免疫抵抗机制及治疗反应。

引言

脑转移瘤是影响中枢神经系统（CNS）最常见的恶性肿瘤，其发生频率高于原发性脑肿瘤。肺癌、乳腺癌和黑色素瘤是最常发生脑转移的原发性癌症¹。其中，乳腺癌脑转移（BCBM）构成了重大的临床挑战，影响约10%–30%的转移性癌症患者，且由于全身治疗的改善和神经影像学技术的进步，其发病率呈上升趋势²。BCBM患者的预后仍然较差，目前可用的治疗方法——包括手术、放疗和化疗——主要是姑息性的，且神经系统症状严重影响患者的生活质量³。尽管靶向治疗和免疫治疗正在被探索作为补充治疗策略，但免疫治疗在脑转移瘤中的临床获益仍然有限^4,5,6。

近期研究深化了我们对脑免疫系统的理解，并重新激发了对与中枢神经系统相关的功能性淋巴通路的兴趣，包括脑膜⁷和鼻黏膜⁸中的淋巴管。这些结构构成了环绕大脑的连续淋巴网络，延伸至嗅球和筛骨板附近，并最终连接到颈部淋巴结。该系统在维持液体稳态、免疫监视以及中枢神经系统与外周淋巴器官之间的免疫细胞迁移中发挥关键作用^9....

方案

所有动物实验均按照里斯本大学药学院的指导方针进行。实验方案经葡萄牙动物保护主管机构——食品与兽医总局审查并批准（编号 0421/000/000/2021）。

1. E0771细胞的准备 体内 植入

1. 在无菌操作台中，使用添加了10% (v/v) 胎牛血清（FBS）和1% (v/v) 青霉素-链霉素（PEST）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），在T75培养瓶中培养E0771细胞。
   1. 确保从供应商处收到细胞后，通过短串联重复序列（STR）分析进行细胞鉴定，并通过常规检测确认无支原体污染。解冻后需将肿瘤细胞传代培养至少2–8代，方可进行脑内植入。
2. 在植入当天，确保细胞状态良好且融合度达到80–90%。吸除培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
3. 向培养瓶中加入胰蛋白酶，于37 °C孵育5分钟。随后加入三倍体积的完全培养基（含10% v/v FBS和1% v/v PEST的DMEM）以中和胰蛋白酶并使细胞解离。
4. 将细胞转移至离心管中，在室温（RT）下以300 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于PBS中用于细胞计数。
5. 再次离心（300 × g，5分钟），弃去上清液，并将细胞重悬于PBS中，调整浓度为每只动物2 μL含1 × 10....

结果

在将E0771细胞进行颅内接种后，小鼠在预定的立体定位坐标处形成了局灶性乳腺癌病灶。靶向纹状体实质的立体定位坐标（2.5 mm 侧向，0.5 mm 前向于前囟，以及从前囟向下3.0 mm）是根据标准小鼠脑图谱及既往报道的颅内植入方法选定的^15,16。该区域因易于操作、支持肿瘤移植且能最大限度减少细胞向脑室或注射路径泄漏，被广泛用于颅内肿瘤植入实验。在本方案中，注射1 × 10⁵个E0771细胞后，至第10天即可观察到明确的肿瘤负荷（图1A），而肿瘤最大生长通常出现在第13–14天左右。基于此生长动力学特征，选择第10天作为实验终点，以研究肿瘤快速扩张晚期阶段之前的肿瘤-免疫相互作用。然而，肿瘤生长速度取决于接种细胞的数量及其内在侵袭性，因此会影响实验的时间安排。

在整个研究过程中，定期对小鼠进行监测。每2–3天记录一次体重，因为体重下降是健康状况恶化的早期指标（

讨论

通过结合颅内肿瘤植入与脑膜和嗅球的分离、解离及免疫表征，本方案可对脑肿瘤微环境与中枢神经系统相关免疫界面之间的动态相互作用进行深入研究。该方法能够实现可重复的颅内肿瘤形成、获得高质量的单细胞悬液，并对免疫细胞亚群进行有效解析。然而，颅内植入跳过了转移级联反应的早期阶段，无法完全模拟自发性脑转移过程。因此，关注早期播散过程的研究人员可能更倾向于采用全身接种策略。尽管如此，本方案中的免疫分析部分在不同的脑转移模型中均具有广泛的适用性。

组织处理会带来额外的挑战。脑膜和嗅球是细胞数量有限的小型组织，过度的机械破坏、酶消化过度或孵育时间过长均会显著降低活细胞的回收率。在反复的离心和洗涤步骤中也可能发生细胞丢失。因此，精确的解剖操作、适度的酶消化、轻柔的操作以及仔细的上清液去除，对于获得适用于流式细胞术的纯净且具有活性的单细胞悬液至关重要。同时，光谱流式细胞术需要优化的抗体组合、正确的信号解混以及严格的对照设置，包括单色染色对照和荧光减一对照（FMO），以确保免疫细胞和基质细胞亚群的准确分辨。

尽管存在这些技术上的考虑，该方案相比更广泛.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 594 抗小鼠 CD45R/B220 抗体（克隆 RA3-6B2）	BioLegend	103254	使用稀释比例为 1:300
Alexa Fluor 700 抗小鼠 CD8 抗体（克隆 53-6.7）	BioLegend	100730	使用稀释比例为 1:50
APC 抗小鼠 P2RY12 抗体（克隆 S16007D）	BioLegend	848006	使用稀释比例为 1:80
Betadine	Selleck Biotechnology GmbH	S4678-100mg	聚维酮碘
牛血清白蛋白（BSA），冻干粉末，≥96%（琼脂糖凝胶电泳）	Sigma-Aldrich	A2153	用于配制 FACS 缓冲液
Brilliant Violet 421 抗小鼠 Podoplanin 抗体（克隆 8.1.1）	BioLegend	127423	使用稀释比例为 1:80
Brilliant Violet 510 抗小鼠 CD11b 抗体（克隆 M1/70）	BioLegend	101263	使用稀释比例为 1:30
Brilliant Violet 570 抗小鼠 NK1.1 抗体（克隆 PK136）	BioLegend	108733	使用稀释比例为 1:40
Brilliant Violet 650 抗小鼠 CD19 抗体（克隆 6D5）	BioLegend	115541	使用稀释比例为 1:50
Brilliant Violet 711 抗小鼠 CD44 抗体（克隆 IM7）	BioLegend	103057	使用稀释比例为 1:80
Brilliant Violet 785 抗小鼠 F4/80 抗体（克隆 BM8）	BioLegend	123141	使用稀释比例为 1:40
Bupaq 3 mg/mL	Bio5	1002241	丁丙诺啡
40-μm 细胞筛	Avantor	732-2757
70-μm 细胞筛	Avantor	732-2758
Centrifuge 5910 Ri	Eppendorf	5943000011
II 型胶原酶	Worthington Biochemical Corporation	LS004176
Corning Matrigel 生长因子减少型基底膜基质	Corning	356231
Cytek Aurora 光谱流式细胞仪	Cytek Biosciences
DNase I	Worthington Biochemical Corporation	LS002006
钻机	Stoelting Europe	51630
DMEM 高糖培养基，含丙酮酸钠	Gibco	41966029
E0771 细胞系	ATCC	CRL-3436
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）	Merck	E4884	用于配制 FACS 缓冲液
FCS Express 流式细胞术分析软件	De Novo Software
胎牛血清（FBS）	Gibco	A5256801
FITC 抗小鼠 CD3 抗体（克隆 17A2）	BioLegend	100204	使用稀释比例为 1:50
Ghost Dye Red 780	Cytek Biosciences	13-0865-T500	活率染料（使用稀释比例为 1:5000）
HBSS，含钙、镁，不含酚红	Gibco	14025092
加热垫	MOBICLINIC
过氧化氢 34.5 至 37%（H2O2）	ACROS	10002780
Ketamax 100 mg/mL	Bio3	1009495	氯胺酮
Lubrithal 眼用凝胶	Bio4	1731329
N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）1M	Gibco	15630080
多聚甲醛（PFA）16%	Avantor	43368	用于配制固定缓冲液
Pacific Blue 抗小鼠 Ly-6G 抗体（克隆 1A8）	BioLegend	127612	使用稀释比例为 1:50
PE 抗小鼠 Ly-6C 抗体（克隆 HK1.4）	BioLegend	128008	使用稀释比例为 1:300
PE 抗小鼠 P2RY12 抗体（克隆 S16007D）	BioLegend	848004	使用稀释比例为 1:80
PE/Cyanine5 抗小鼠 CD11c 抗体（克隆 N418）	BioLegend	117316	使用稀释比例为 1:80
PE/Cyanine7 抗小鼠 CD80 抗体（克隆 16-10A1）	BioLegend	104734	使用稀释比例为 1:100
PE-eFluor 610 抗小鼠 CD31 抗体（克隆 390）	eBioscience	61-0311-82	使用稀释比例为 1:160
PE/Fire 810 抗小鼠 I-A/I-E 抗体（克隆 M5/114.15.2）	BioLegend	107667	使用稀释比例为 1:300
青霉素-链霉素（PEST），10,000 U/mL	Gibco	15140-122
PerCP/Cyanine5.5 抗小鼠 CD45 抗体（克隆 30-F11）	BioLegend	103132	使用稀释比例为 1:80
磷酸盐缓冲液（PBS）10X，pH 7.4	Gibco	70011044
Prism（版本 10）	GraphPad
RN 针头（27/51/3）S	Hamilton Company	7762-01
RPMI 1640 培养基，含 GlutaMAX 补充物	Gibco	61870044
手术刀片，碳钢	B Braun	BB510
Sedaxylan 20 mg/mL	Bio2	1112384	赛拉嗪
Spark Blue 574 抗小鼠 CD4 抗体（克隆 GK1.5）	BioLegend	100490	使用稀释比例为 1:50
立体定位仪	Stoelting Europe	51730D
缝合线 Silkam 黑色 5/0 10x45 cm	B Braun	C0266639	不可吸收
手术器械套装（剪刀、钳子和镊子、持针器）	Stoelting Europe	52189
0.5 mL 注射器，带 0.3x12 mm 针头	B Braun	9151125
TruStain FcX PLUS 抗小鼠 CD16/32 抗体（克隆 S17011E）	BioLegend	156604	FcR 封闭剂（使用稀释比例为 1:50）
台盼蓝溶液 0.4%	Sigma-Aldrich	T8154
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红	Gibco	25200-072
U 型底 96 孔板	Avantor	734-2328
50 mL 离心管	Avantor	525-0610
701 RN 微量™ 注射器	Hamilton Company	548-2273