利用液滴界面双层膜表征脂质-蛋白质膜的结构与功能

摘要

本文介绍了一种实验方案，用于组装、电刺激并分析掺有短杆菌肽A的液滴界面双层膜。通过测量膜面积、离子流和单通道电导的变化，并将这些响应与受电突触启发的膜模型中类似可塑性的离子传导变化相关联，从而量化脂质-蛋白质的结构-功能关系。

摘要

液滴界面双层膜（DIBs）提供了一个可调控的平台，用于在受控电刺激条件下研究脂质及脂质-肽膜的机电特性。DIBs 能够在比传统膜片钳技术可及面积大数个数量级的膜区域上进行单通道和整体离子电导测量，从而实现对机电形变及其对导电肽影响的膜级分析。通过体相烃类油相（例如十六烷 [C16] 与十二烷/十六烷 [C12/C16] [25%/75%，v/v]）系统调节膜结构，该自下而上的平台可系统性地改变膜组成和油相环境，进而影响膜的黏弹性与结构重组，并调控肽的离子传导。本文详细描述了使用不同烃类油相组成组装掺有短杆菌肽 A 的 1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DPhPC）膜的操作步骤，以及施加电压脉冲程序以驱动膜进入亚稳态机电状态的方法。在模型膜系统中表征了自适应性膜离子传导行为，包括短期可塑性样（STP-like）、长期增强样和长期抑制样（LTP-like/LTD-like）响应。总体而言，本实验方案为系统研究依赖于组分的、膜层面的机电效应在类突触传导行为中的作用，以及理解脂质膜环境如何调控离子通道功能，提供了一种稳健且可重复的技术路径。

引言

生物膜是一类关键的超分子结构，能够调控离子传导，并通过电突触和化学突触实现神经元之间的通信^1,2,3,4。这类通信进一步受到突触可塑性的调控，即突触的结构变化在多种时间尺度上调节其强度和持续性^5,6，通常以短期可塑性（STP）和长期增强或抑制（LTP 或 LTD）来描述。这些现象涉及膜电导在神经活动响应下的动态变化，通常与神经可塑性相关联⁷，而神经可塑性是学习与记忆的基础⁸。传统的可塑性模型通常强调通过蛋白质合成、转运或磷酸化等生化机制对离子通道进行调控⁹。然而，在大多数可塑性模型中，神经元质膜的作用在很大程度上被忽视了^10,11。

膜片钳技术已应用半个多世纪，用于研究单离子通道的电生理学特性。然而，该技术仅能检测远小于完整突触或大规模合成模型的膜区域，因此在研究介观尺度膜的重组与形变方面存在技术局限性。介观尺度正日益被视为理解膜生物物理学诸多方面的关键长度尺度^12,13。

本文介绍了一种利用掺入单价肽阳离子离子载体短杆菌肽A（gramicidin-A，gA）的1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DPhPC）液滴界面双层膜（DIBs）^14,15 来模拟离子传导过程的方法，该过程类似于电突触处发生的离子传导。该系统具有若干关键优势：（i）DIBs提供了一个可调节的脂质和油相平台，允许对膜结构进行系统性重组¹⁶；（ii）DIBs可在多种空间尺度上研究单通道及通道集合体的事件^17,18；（iii）DIBs能够检测面积达平方毫米以下² 的膜区域，从而捕捉由电机械效应诱导的集体性膜重构现象，同时仍保持分辨单通道离子传导事件的能力^19,20。该方法特别适用于需要在大于传统膜片钳技术可及的膜面积上同时进行电学与光学检测膜电机械行为的研究，且仍能分辨离散通道事件。当实验目标为探究膜组成、油相环境以及施加电压波形如何影响集体性膜重构和肽类离子传导时，该方法尤为有用。然而，对于需要天然细胞结构或对完整生物膜中蛋白质构象变化进行直接分子检测的实验，该方法则不太适用^19,20,21。

通过施加生理相关的电刺激，DIBs 被驱动进入非平衡稳态，在此状态下，动态的电机械重构改变了肽离子通道的导电性。这些新出现的离子导电性变化在描述上类似于神经科学中讨论的短期可塑性（STP）、长期增强（LTP）和长期抑制（LTD）现象^22,23,24。在本研究中，这些行为主要被解释为模型膜系统中与膜固有机械特性（如黏弹性与可压缩性）相关的电刺激所引发的膜层级物理响应²⁵。值得注意的是，本研究所描述的工作建立在先前证据的基础之上，即脂质双层在电刺激后可通过持续的电导变化和电容性电荷存储表现出基本的电记忆特性^{14,15,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34}，从而为脂质双层如何在缺乏复杂细胞机制的情况下支持适应性、类似突触的功能提供了新的见解。最后，该方法还可实现对结构-功能关系的直接研究，并揭示宏观尺度上的涌现行为如何源于简单的结构重组^21,25,27。

方案

在样品制备前，使用适当的实验室洗涤剂彻底清洁所有玻璃器皿和制备设备，并用蒸馏水冲洗。始终佩戴护目镜以及腈类或乳胶手套，以避免污染。 所有化学废弃物应根据机构安全指南进行处理。确保挥发性溶剂按照机构安全指南妥善存放。确保实验空间及设备（图1A）、实验容器（图1B）以及电气和光学连接装置（图1C）保持畅通，无任何障碍物。

1. 水相缓冲溶液的制备

1. 称取适量的3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS）和氯化钾（KCl），以获得所需的终浓度（例如，在500 mL中含10 mM MOPS、0.1 M KCl）。
2. 将MOPS和KCl加入盛有约450 mL蒸馏水的500 mL容量瓶或量筒中，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解。
3. 使用校准后的pH计测量pH值。在持续搅拌下，逐次加入0.25 mL的1 M氢氧化钾（KOH）或盐酸（HCl），将pH值调节至7.4。
4. 用蒸馏水定容至500 mL，充分混匀。将缓冲液转移至洁净并贴有标签的瓶中，密封后于4 ˚C保存。
   注意：该缓冲液可使用约2个月。每次使用前需检测并重新调节pH至7.4。

2. 短杆菌肽储备液的制备

1. 在化学通风橱中，将 5 mg 短杆菌肽 A（gA）加入一个洁净的 20 mL 玻璃小瓶中。使用玻璃或防漏注射器加入 10 mL 甲醇，并涡旋振荡直至肽完全溶解。将该小瓶标记为“gA 储存液”，并于 -80 ˚C 保存。
   注意：群体实验采用脂质与肽的摩尔比约为 1:10^-4。单通道实验使用约低 10–100 倍的肽浓度（1:10^-5–10^-6），以便在较短的记录时间（<1 分钟）内分辨单个通道事件。制备稀释的储存液有助于在低摩尔比（< ~ 1:10^-4）条件下提高移液的准确性。
2. 使用氩气对另外两个洁净的 20 mL 玻璃小瓶分别吹扫约 5 秒，以去除灰尘。
3. 使用洁净的防漏注射器，向每个吹扫过的小瓶中加入 9.9 mL 甲醇。
4. 用无菌防漏注射器吸取 100 µL gA 储存液，加入其中一个已处理的小瓶中，总体积为 10.0 mL。将此小瓶标记为“A”。浓度 = 甲醇中 2.66 µM gA。
5. 用移液器吸取 100 µL 溶液“A”，加入第二个玻璃小瓶中，总体积为 10.0 mL。将此小瓶标记为溶液“B”。浓度 = 甲醇中 26.6 nM gA。
6. 用瓶盖密封小瓶，并用 Parafilm 封口膜包裹。
7. 将所有 gA 溶液于 -80 ˚C 保存，直至使用。

3. 脂质-多肽囊泡的制备

1. 用氩气对一个洁净的 20 mL 玻璃小瓶吹洗约 5 秒。
2. 向小瓶中加入 4 mg 的 1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DPhPC）脂质。
3. 在通风橱中，使用玻璃移液管加入 1 mL 甲醇。轻轻旋转或涡旋，直至所有脂质完全溶解。
4. 使用 500 µL 耐压气密注射器，向 DPhPC 甲醇溶液中加入 178 µL 溶液“A”（用于群体水平 STP 实验；DPhPC:gA 摩尔比 = 1:10^-4）或 890 µL 溶液“B”（用于单通道实验；DPhPC:gA 摩尔比 = 1:5×10^-6）。轻轻涡旋混合。
5. 在通风橱中，用温和的氩气流吹扫，蒸发甲醇，直至小瓶底部形成一层均匀的薄脂质膜。
6. 将敞口小瓶放入 40 ˚C 的真空烘箱中，抽真空 10–12 小时或过夜，以彻底去除残留溶剂。
7. 从真空烘箱中取出小瓶，加入 2 mL 第 1 节中配制的 0.1 M KCl 缓冲液（用于 STP 实验），得到悬浮液中脂质和短杆菌肽的终浓度分别为 2.36 mM 和 236 nM。对于单通道实验，加入 2 mL 第 1 节中配制的 1 M KCl 缓冲液。涡旋以重新水合脂质膜，获得 2 mg/mL 的脂质悬浮液，此时脂质和短杆菌肽的终浓度分别为 2.36 mM 和 11.8 nM。
8. 将小瓶在 -80 ˚C 冰冻至少 6 分钟，然后在 40 ˚C 的加热板或水浴中解冻 6 分钟。短暂涡旋混合。重复此冻融循环六次，以促进多层囊泡的形成。
9. 按照制造商说明，组装带有孔径为 0.1 µm 的径迹蚀刻膜的脂质囊泡挤出器。将 500 µL 缓冲液通过挤出器 3 次，以润湿膜、检查是否泄漏，并弃去缓冲液。
10. 将 1 mL 解冻后的脂质-肽悬浮液装入挤出器中，通过 0.1 µm 膜挤出 31 次，以获得直径约为 100 nm 的单层囊泡，并确保粒径均一。
11. 将挤出后的囊泡（大单层囊泡，LUV）转移至 1 mL PCR 管中，标记后于 4 ˚C 保存。制备后两周内使用。
12. 将原始小瓶中剩余的未挤出脂质-蛋白悬浮液密封，用 Parafilm 封口膜包裹，于 -80 ˚C 保存以备后续使用。
13. 若使用先前冷冻保存的未挤出样品，可在加热板上于 40 ˚C 重新融化，或让样品自然升温至室温，然后进行挤出处理。

4. 琼脂糖凝胶的制备

1. 将一个洁净的 50 mL 玻璃烧杯置于加热板上。加入一个琼脂糖片至 50 mL 用于水合脂质膜的相同缓冲液中（例如 10 mM MOPS、0.1 M KCl，pH 7.4），配制成 1% 琼脂糖凝胶溶液。
2. 加入一个洁净的聚四氟乙烯搅拌子，剧烈搅拌直至琼脂糖片完全分散。
3. 用铝箔覆盖烧杯，并用金属刮刀戳一个小的通气孔。将加热板温度设定为 220–230 ˚C。溶液将逐渐变澄清并剧烈沸腾，表明琼脂糖已完全溶解。
4. 关闭加热，小心移除铝箔，用洁净的金属刮刀刮去表面薄膜。立即使用热的琼脂糖溶液进行电极涂覆，或让其在烧杯中冷却凝固以备后续使用。
5. 电极琼脂糖涂覆完成后，用铝箔覆盖凝固的琼脂糖，再用封口膜密封，标记后于 4 ˚C 保存。使用时，加热并搅拌至完全重新熔化即可。

5. 电极的制备

1. 将直径为0.125 mm的银丝切成约70 mm长的片段用于前置放大电极，约130 mm长的片段用于接地电极。
2. 使用明火（例如手持打火机或本生灯），将每根银丝的一端水平置于火焰最热的中心锥形区域，直至尖端熔化并形成直径约0.2 mm的球形小球（图2A）。
3. 将银丝放置于清洁表面上，在显微镜下检查小球是否呈球形且大小相近。若小球呈椭圆形或不规则形状，应剪除尖端并重复熔化步骤（步骤5.2）。
4. 将两根银丝的末端放入盛有新鲜家用漂白剂（次氯酸钠，NaClO）的玻璃容器中。确保小球完全浸没，并孵育至少1小时，以氯化表面并形成Ag/AgCl。小球呈现暗棕灰色表明氯化成功（图2B）。
5. 当银丝小球端变为暗灰色后，将其从漂白剂中取出，用蒸馏水彻底冲洗，并平放在洁净无绒的表面上晾干。
6. 取一个前置放大电极夹持器和一个接地电极夹持器。使用玻璃切割器将一根100 mm长的硼硅酸盐玻璃毛细管（外径1.0 mm，内径0.58 mm）切成两半。
7. 将一半毛细管插入前置放大电极夹持器中，并拧紧夹持器以固定。将完整的100 mm毛细管安装到接地电极夹持器上并固定。
8. 将130 mm银丝的非球端插入接地电极毛细管中，直至球端约20 mm伸出。用胶带将导线另一端固定在夹持器上，留出约5 mm裸露部分用于接地连接。
9. 使用70 mm银丝对前置放大电极重复下一步操作，确保导线与前置放大连接器（金色部件）之间接触牢固。剪除前置放大连接器端多余的导线。
10. 将每个氯化后的银球小球浸入琼脂糖溶液中，浸入位置略高于球体与导线连接处，以形成一层薄而均匀的涂层。反复浸入和取出至少10次。
11. 取出电极，让琼脂糖在室温下凝胶化。如需获得光滑、均匀、厚度为数微米的琼脂糖壳层，可重复浸涂。避免在导线上涂覆过高或过低的位置（图2C）。
12. 将前置放大电极和接地电极安装到显微操作器上。使用鳄鱼夹将裸露的接地导线（约5 mm）连接至放大器的接地端。
13. 使用镊子轻轻弯曲每个电极，位置位于球端与毛细管之间的中点，使球端与显微镜载物台垂直。弯曲角度应避免超过90˚，以尽量减少显微镜视野及视频采集中的光学畸变。
14. 调整电极在夹持器中的方向，使琼脂糖包覆的球端与显微镜成像平面垂直（图3A）。

6. 液滴界面双层膜（DIBs）的形成

1. 将一个洁净、底部透明的培养皿置于倒置显微镜的载物台上。向培养皿中加入烷烃油（例如100%十六烷，或25%/75% v/v 十二烷/十六烷），深度约为5 mm（图1B）。
2. 使用显微操作器控制装置，将两个涂有琼脂糖的球形末端缓慢浸入油中，深度约为油面以下2.5 mm。操作显微操作器时应避免快速移动，以防电极球头与培养皿发生碰撞。
3. 调节显微镜焦距，使两个球形末端及其表面的琼脂糖涂层均清晰对焦。将电极调整至视野边缘附近，以便同时观察两个电极。
4. 使用经校准的2 µL移液器吸取挤出的脂质-肽囊泡悬浮液。分别使用不同的移液器吸头，缓慢将250 nL悬浮液直接滴加到每个涂有琼脂糖的球形末端上，注意移液器吸头不得接触琼脂糖外壳。
   注意：为减少手部震动并提高稳定性，可将双肘固定在防震台边缘。用非操作手稳定移液手腕部，缓慢将移液器浸入油中，并逐步接近电极。在加载液滴时短暂屏住呼吸，可进一步减少不必要的移动。
5. 让液滴自然铺展，覆盖琼脂糖外壳，并在重力作用下从电极处下垂。若培养皿透明，可通过皿壁侧面观察下垂情况（图3B）。
   注意：液滴下垂所需时间取决于囊泡尺寸分布、温度及琼脂糖表面形貌。对于DPhPC双层脂膜（DIBs），在滴加液滴后至少等待5分钟¹⁵。
6. 轻轻轻敲防震台以评估液滴是否准备就绪。确认下垂的液滴相对于电极运动存在轻微延迟，表明已形成完全包被脂单层的液滴。
   注意：延迟运动的发生是因为在水相液滴周围形成脂单层显著降低了表面张力，从而在移动油中电极时延迟了物理响应。
7. 若未观察到此现象，需额外等待2–3分钟，并重复该步骤。

7. 电学装置设置与双层膜监测（视觉与电学）

1. 确保显微镜、防震台、法拉第笼以及所有电子组件（包括放大器、数字化仪、函数发生器和计算机）均连接至同一接地端图1).
2. 根据制造商的安装指南连接仪器。使用 图1C 作为基本电学和光学配置的示意图参考。请参阅有关接地的详细说明³⁵硬件/软件配置及DIB实验的移液器偏移量调整
   注意：请遵循所列所有软件和硬件设备相关的特定设置说明 材料表
3. 将头级电极和接地电极连接至膜片钳放大器。
4. 将外部函数发生器（或采集软件的输出通道）设置为生成10 Hz、10 mV的三角波电压信号。在连接的示波器及采集软件中确认其幅度和频率。
5. 液滴下垂约10分钟后，使用显微操作仪将两个液滴轻轻接触。调节电极位置，使液滴接触区域初始不超过约1/4^th 其直径
6. 打开10 Hz、10 mV的三角波信号，使用放大器和采集软件监测电容性电流响应。
7. 等待自发双层膜形成，其电学特征表现为峰-峰电容电流响应逐渐增大，光学特征表现为双层膜接触区域的内反射（呈椭圆形外观）逐渐增强图4）。确认纯脂质双层在三角波电压刺激下呈现矩形电流平台，而掺有约1:10比例gA的脂质双层^-4 脂质：肽表现出倾斜的平台区，反映整体离子传导特性。
8. 通过轻微移动电极来调节液滴接触面积，使在 C16 或 C12/C16 油中约 250 nL 的 DIBs 对 10 Hz、10 mV 三角波产生的峰-峰值电容电流响应处于约 100–200 pA 范围内，对应电容范围约为 250–500 pF³³.
   注意：高频脉冲或非零直流保持电压可引发电湿润效应及双层膜过度扩张，导致液滴融合和双层膜破裂。100–200 pA 范围可在双层膜稳定性与信噪比之间取得平衡，使刺激期间产生足够的膜面积扩张。
9. 如果双层脂膜（DIB）发生融合，将电极从油中取出，用电极制备脂质样品和琼脂糖时所用的相同水相缓冲液彻底冲洗电极头。
10. 用无菌注射器除去培养皿中的水相液滴。如有需要，补充新鲜油相并重新淹没电极。按照第6节所述方法将LUV溶液重新加样至电极上，并重复该过程。
11. 在确认获得稳定的电容性或电导性响应后，关闭三角波信号，使DIB平衡至少15分钟，然后施加刺激方案。

8. 电刺激方案

1. 脉冲实验（类似群体STP以及类似LTP/LTD的反应）
   1. 配置函数发生器或数据采集软件，以输出所需幅度、持续时间和脉冲间间隔的电压脉冲（例如，PPF[成对脉冲易化]和PPD[成对脉冲抑制]模式）。
   2. 打开视频采集软件。选择合适的相机和物镜设置。将帧率设为至少20帧/秒，并确认在录制期间保持稳定。
   3. 在数据采集软件中，将电流信号的采样频率设置为至少5 kHz。
   4. 点击 采集 > 新建协议 创建新协议，或点击 采集 > 编辑协议 修改现有协议。在 采集模式 选项卡中，选择 间歇性刺激。将 试验次数/次 设为1，扫描次数/运行 设为1。
   5. 将单次扫描持续时间设置为比总实验时长长4秒。对于一个120秒的STP协议（60秒PPF + 60秒PPD），将扫描持续时间设为124秒，以留出刺激前和刺激后各2秒的基线期。
   6. 在 输入 选项卡中，将记录通道分配给电流输入。在 输出 选项卡中，将刺激通道分配给控制电极的电压输出。
   7. 打开 波形 选项卡。在 列A 中，将 类型 设为 阶跃，第一级 设为0 mV，第一级持续时间 设为2000 ms，以定义刺激前基线。
   8. 在 列B（PPF）中，将 类型 设为 阶跃。设定所需的 电压幅度（例如+100 mV）、脉冲持续时间（例如100 ms），并设置 脉冲频率 以获得目标占空比对应的脉冲间间隔（例如90.9%）。
   9. 在 列C（PPD）中，同样将 类型 设为 阶跃，使用相同的幅度和脉冲持续时间，但提高 脉冲频率 或延长脉冲间间隔，以实现所需的较低占空比（例如28.6%）。
   10. 在 列D 中，配置一个与 列A 相同的刺激后基线（0 mV，2000 ms）。
       注：如果 波形 选项卡中所有时段的总持续时间超过 模式/速率 选项卡中的扫描持续时间，请略微增加扫描持续时间，直至错误消除。
   11. 使用描述性名称保存该协议（例如“STP_120s”）。
   12. 开始视频录制，然后立即点击红色圆形“录制”按钮启动电生理数据采集/刺激。或者，可配置数字触发信号，使刺激开始同时触发视频录制和电生理数据采集。
   13. 在前60秒的刺激（PPF）期间，测得的电流响应通常从第一个脉冲开始逐渐增强，并可能在t = 60 s时达到可见的平台期；而在后60秒的刺激（PPD）期间，测得的电流响应通常呈下降趋势（图5）。协议结束后，同时停止电生理数据采集和视频录制。
2. 单通道实验
   1. 在膜片钳放大器前面板上，将 外部命令输入 开关设为 关闭。将 保持电压 设为+200 mV。将放大器内置的 低通滤波器 设为1 kHz。在数据采集软件中，将 采样率 设为10–50 kHz，并选择连续的“无间隙”记录模式。
      注：高采样率可能会降低所采集数据的信噪比。在需要分辨快速门控行为或短暂闪烁状态时，使用较高采样率至关重要。短杆菌肽A的平均开放寿命通常在0.1秒至10秒之间，而闪烁状态可能发生在亚毫秒（ms）和微秒（µs）时间尺度上；因此，约50 kHz的采样率可能是捕捉此类事件所必需的³⁶。后续使用JSMURF进行的单通道理想化分析，可在不同信噪比的记录中实现稳健的事件检测³⁷。
   2. 在未施加外部命令的情况下，开始记录基线电流信号。在放大器上，将 电压命令 从 关闭 切换至“+”，以在DIB上施加+200 mV的直流电压。
   3. 记录约15秒，以捕获单通道事件，同时限制基线漂移。在脂质:gA摩尔浓度比为1:5×10^-6 的条件下，由于通道电导门控行为的形成与消失，所记录的电流呈现阶梯状。
   4. 在停止记录前，将 电压命令 从“+”切换回 关闭。停止数据采集，并使用描述性文件名保存记录（例如“DIB_C16_postPPF_200mV.abf”）。
      注：也可通过编程设置的 间歇性刺激 进行固定时长的单通道记录，其固定幅度和持续时间如第8节中PPF/PPD所述。对于“PPF后”单通道实验，可在60秒PPF结束后立即叠加一个+200 mV直流电压的 间歇性刺激。

9. 膜面积与通量外推

1. 每次集成实验（STP、LTP/LTD）结束后，使用显微操作器缓慢横向移动一个电极，以分离双层脂膜（DIB）。
2. 松开显微操作器的电极夹具，将电极在其夹具内旋转约45˚，使125 µm的银丝位于成像平面内。
3. 调节电极高度，直至在显微镜下银丝清晰聚焦。使用相机软件拍摄聚焦银丝的静态图像或截图。保存该标尺图像，用于后续将像素尺寸校准为毫米。
4. 根据参考文献28中所述步骤处理记录的电流轨迹，获得连续且无伪迹的电流-时间数据（图6A）。
5. 通过将帧索引除以测得的帧率，并与采集时间戳对齐，确定帧与时间的对应关系。
6. 将标尺校准图像和实验帧导入图像分析软件。
7. 利用标尺校准图像中已知的银丝直径（125 µm），使用软件的校准功能设置空间尺度（分析 > 设置尺度）。
8. 针对每次实验的通量计算，选择N个时间点覆盖整个刺激周期（例如，在120秒的实验中选择30个时间点）。确保第一个时间点对应于第一个刺激脉冲。
9. 在每个时间点，通过在双层膜边缘交界处画一条线并记录其校准单位下的长度，测量DIB的直径。
10. 将每个测得的直径转换为膜面积（A），假设为圆形几何形状，或根据特定的脂质-油配置使用相应的椭圆几何校正因子。利用所得面积评估不同实验条件下膜面积随时间的演变（图6B）。
11. 对每个时间点，将对应的电流值除以面积，得到通量（I/A）。在需要进行归一化通量分析时，将所有N个通量数据点除以第一个通量值，得到相对于首个脉冲归一化的通量（(I/A) / (I₀/A₀)）（图6C）。
12. 绘制通量或归一化通量随时间或脉冲次数随时间的变化曲线。对所有集成实验（STP、LTP/LTD）重复通量分析（图6D）。
13. 将PPD期间或超过2分钟时通量或归一化通量持续升高解释为传导增强；而恢复至基线或低于首个脉冲值则表明传导抑制。利用所得的时间尺度将响应分类为类似短期可塑性行为（<2分钟）或类似长期增强/抑制行为（>约5分钟）。

10. 单通道分析

1. 将原始单通道记录导入首选的分析环境或 clampSeg 界面并参考³⁷ 有关软件功能的完整描述和说明。
2. 应用 数字的 低通滤波器 匹配实验采集滤波器（例如，1 kHz 贝塞尔滤波器）。
3. 参数配置。
   1. 设置 α（α） = 0.05，定义统计置信水平，使得每个检测到的步骤均具有 <5% 的概率为随机噪声波动。
   2. 指定 5,000-10,000 次蒙特卡洛模拟 每1秒时间段内的迭代次数，用于估计噪声分布并增强事件检测的统计稳健性。
      注意：如果条件允许，可通过1秒“片段”进行并行计算处理，以缩短分析时间。
   3. 运行 JSMURF 在滤波后的电流轨迹上应用算法。
4. 模型验证。
   1. 将理想化的（方波）电导轨迹叠加到滤波后的电流轨迹上，并通过视觉确认阶跃转换与实验信号的突变是否一致。
   2. 利用已知的低通滤波器特性，生成理想化轨迹的卷积重建结果，并将其叠加在原始轨迹上³⁷确认重建信号在时序和振幅包络上与记录的电流高度吻合。
5. 电导与寿命的量化分析
   1. 将理想化轨迹中最低的稳定平台定义为关闭基线状态。将第一个非零平台幅度确定为主要开放态电导（单通道水平）。
   2. 将该振幅的更高整数倍归类为多通道开放态（2+, 3+ 等）。将稳定但低于完全开放水平的中间平台识别为亚电导态。
   3. 从理想化轨迹中提取每个事件的幅度和持续时间，并对其进行分组以生成电导幅度直方图和寿命直方图。
6. 振幅直方图与寿命分布
   1. 将理想化的电导-幅度直方图与直接从滤波数据生成的幅度直方图进行比较。确认理想化直方图呈现出更尖锐、分辨更清晰的峰，对应于离散的电导态。³⁷.
   2. 对于每种实验条件，计算生存函数 N(t)/N(0)，其中 N(0) 为开放事件（包括全电导和亚电导）的总数，N(t) 为持续时间长于 t 的事件数量。本分析中排除关闭状态的时间区间。
   3. 绘制 N(t)/N(0) 随时间变化曲线，并使用首选软件中的非线性最小二乘法拟合指数衰减函数。
   4. 将电导分布峰在振幅直方图中的右移解释为电导增加，将N(t)/N(0)随时间变化曲线中衰减时间常数延长解释为开放态稳定性增强，将分布左移解释为通道寿命缩短。
      注意： 尽量减少环境干扰，例如气流、振动和附近移动的物体。避免倚靠光学平台，并在远离实验装置的位置进行交谈。将手机、平板电脑、笔记本电脑及其他个人电子设备置于距离法拉第笼至少1.5 m以外，以降低电磁干扰。使用光学透明的油储液池，并优化显微镜照明与对比度，以增强液滴和双层膜边缘的清晰度。若灰度模式可提高边界对比度并简化对DIB直径的手动测量，则应采集和/或导出灰度视频。对于不研究温度效应的实验，应确保实验室环境、显微镜载物台和油均维持在21–22 ˚C。

结果

DIB 实验装置
记录系统置于法拉第笼内，并安放在防震台上，电生理信号和视频数据由两台独立的计算机分别采集。图1A)，尽管也可以使用一台具有分屏功能的计算机。DIB样品环境由两个涂有琼脂糖的电极组成，这两个电极浸没在定量的烷烃油中（图1B). 图1C 展示了本文所述实验装置中必要的电学和光学连接示意图。

图 1：实验装置。（A）防震台和法拉第笼屏蔽装置，标注了主要组件，包括放大器、数字化仪、噪声滤波器、函数发生器，以及用于电信号和视频采集的双计算机接口。（B）DIB样品环境及电极的前上方视图。（C）本论文所述实验装置中电学与光学连接关系的示意图。所有独立组件均共用实验室建筑内的同一接地。所有实验均在室温（21–22 ˚C）下进行。请点击此处查看该图的放大版本。

Ag/AgCl 电极的制备与质量控制
熔化银丝尖端可形成球形小球（图 2A）；质量较差的熔球呈椭圆形或不规则形状。在漂白剂中进行氯化处理后，Ag/AgCl 表面呈暗棕灰色（图 2B）。在小球表面涂覆一层厚度约为数十微米的薄而均匀的琼脂糖层，对于稳定支撑液滴并实现低阻抗的电化学耦合至关重要；而不均匀的涂层则会导致液滴附着不良（图 2C）。

图 2：电极制备。（A）质量良好与较差的电极熔融体的显微镜图像。（B）非氯化与氯化电极头部的比较。（C）质量良好与较差的琼脂糖包被示例。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：电极装置。（A）安装电极角度对准的顶视图。（B）LUV 加载后立即形成的不塌陷液滴与单层膜形成后的塌陷液滴的侧视图比较。请点击此处查看该图的放大版本。

电极定位与液滴下垂行为
俯视图显示电极的适当角度定位，以尽量减少光学畸变（图3A)侧视图 比较非下垂状态（LUV 溶液加载后立即观察）与下垂状态（加载后 5 分钟）的脂质包被液滴图3B)下垂液滴用于构建DIB时，由于脂质单层导致表面张力显著降低，对运动的物理响应出现延迟，从而在视觉上证实了完全被脂质单层包覆的悬浮水相液滴的形成。在液滴下垂状态稳定后，采用三角波刺激以提供双层膜形成及稳定性的电学验证。³⁵.

图 4：液滴界面双层膜的形成。（A）时间序列显示液滴接触后双层膜的形成与扩展过程。（B）利用内部膜反射进行双层膜直径和面积的估算。DIB成像通过倒置显微镜从装置下方进行。比例尺 = 50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

DIB 的形成与面积测量
当两个下垂的液滴接触时，连续图像可捕捉到双层膜自发“拉链式”闭合及面积扩展的过程（图 4A）。液滴接触处明亮的内侧椭圆形反射区域可用于估算双层膜直径，进而推算膜面积随时间的变化（图 4B）。

图 5：STP 协议——刺激与响应。成对脉冲易化（PPF，0–60 秒，红色）和成对脉冲抑制（PPD，60–120 秒，蓝色）期间的代表性电流响应如上图所示（顶部），并附有相应的刺激方案（底部）。PPF 和 PPD 脉冲持续时间为 100 毫秒，关闭时间分别为 10 毫秒和 250 毫秒，占空比分别为 90.9% 和 28.6%。易化对应离子电流的净增加；抑制则对应净减少。电流响应仅在开启期间记录；为便于可视化，脉冲之间的数据已进行插值处理，以突出电流的整体变化趋势。PPF 和 PPD 阶段的脉冲示意图时间长度及脉冲数量未按比例绘制，仅为可视化目的而示意。代表性电流响应数据改编自 Podar PT 等人²⁵，遵循 CC BY-NC-ND 4.0 许可协议。版权所有 © 2025 作者。由 PNAS 出版。当前稿件对刺激示意图进行了修改。请点击此处查看该图的放大版本。

用于诱导短期可塑性样行为（STP样）的电刺激方案
此处表示的刺激模式类比神经科学术语中的成对脉冲易化（PPF）和成对脉冲抑制（PPD），类似于Koner和Najem^28,29。成对脉冲易化（PPF；0–60 s）和成对脉冲抑制（PPD；60–120 s）分别采用100 ms脉冲，其关闭时间（OFF time）分别为10 ms和250 ms，对应的占空比分别为90.9%（PPF）和28.6%（PPD）。上图显示了在开启期（ON period）期间的代表性电流响应，下图则显示了刺激模式。

STP期间及后续长期刺激中的电流、膜面积和离子流
在PPF和PPD过程中，展示了C16和C12/C16油中gA掺杂DPhPC双层膜的归一化电流（I/I₀）（图6A）。在30个时间点测得的归一化膜面积（A/A₀）显示，尽管电流不同，两种油条件下膜面积的变化趋势相似（图6B）。每种油条件下28个独立DIBs的归一化电流和面积数据分别以均值±标准差云图和柱状图表示。归一化流（J/J₀ = (I/I₀)/(A/A₀)）分离了与面积无关的电导变化，表明膜电导的变化超出了单纯的面积扩张效应（图6C）。然而，这些变化可能同时反映了单通道电导和活性导电通道数量的贡献。长达30分钟的持续PPD刺激在C16膜中引发类似长时程抑制（LTD）的行为，而在C12/C16膜中则维持升高的离子流，表现出类似长时程增强（LTP）的行为（图6D）。综上，这些数据表明膜组成可调节离子流在短时间和长时间尺度上的类似可塑性变化。

图 6：DIBs 在 STP 及向 LTP/LTD 转变期间的电流、膜面积和计算得到的离子流。（A）C16（橙色）和 C12/C16（蓝色）油相中 gA 掺杂的 DPhPC 膜在 PPF（0–60 秒，白色背景）和 PPD（60–120 秒，灰色背景）期间的归一化电流（I/I₀），每种条件下包含 n = 28 个独立形成的 DIBs。（B）归一化膜面积（A/A₀），在 30 个时间点测量，显示尽管电流响应不同，但面积变化轨迹相似；数据以均值 ± 标准差表示，对应每种油相条件下相同的 n = 28 个独立 DIBs。（C）归一化离子流 J/J₀ = (I/I₀)/(A/A₀) 由相应的电流和面积测量值计算得出，突出了超出面积效应的电导变化。（D）在长时间 PPD 刺激下的长期行为：在初始 120 秒 STP 阶段（灰色阴影区域）之后，DIBs 接受持续 30 分钟的 PPD 刺激，其中 ON = 100 毫秒，OFF = 250 毫秒（实线红/绿色）或 30 秒（橙色/灰色）脉冲。C16 膜中的离子流衰减至基线水平或以下，表现出类似 LTD 的行为，而 C12/C16 膜中的离子流仍维持在较高水平，表现出持续的类似 LTP 的行为。阴影区域表示由 I/I₀ 和 A/A₀ 传播的误差。图（D）中的长时间 PPD 数据集来自每种油相条件下 n = 6 个独立 DIBs 的 120 秒协议，随后为每种延长 PPD 条件下的 3 个 DIBs。所有数据点仅为了可视化目的进行连接。图 A、B 和 D 根据 CC BY-NC-ND 4.0 许可协议转载。版权所有 © 2025 作者。由 PNAS 出版。图 C 基于 Podar PT 等人²⁵ 报道的数据为本稿件新生成。 请点击此处查看该图的放大版本。

在C16油中形成的含gA的双层脂膜经PPF刺激后的代表性15秒单通道电流轨迹
该轨迹包含以50 kHz采样频率采集并经1 kHz低通滤波的原始信号、经250 Hz八极点贝塞尔滤波处理的信号，以及理想化的JSMURF拟合结果。最低的稳定水平定义为关闭态，较高的水平则对应单通道、多通道及亚电导事件。这些轨迹为电导幅值和寿命分析提供了基础。所示的电导态停留时间表示特定电导水平的持续时间，其幅值和持续时间反映了多个同时发生的完全电导和/或亚电导事件的综合贡献。

电导幅度与寿命分布
C16 和 C12/C16 膜在 DPhPC:gA 摩尔比为 1:5×10^-6 条件下的电导幅度直方图（图 7A–B）比较了 PPF 处理前后的状态。数据下方的高斯拟合显示，PPF 处理后平均电导峰发生偏移，并可分辨出对应于亚电导态和多通道态的独立峰。对电导分布的统计比较基于合并的事件级数据，采用 Welch t 检验和 Mann-Whitney U 检验（α = 0.05），每种条件包含 3 次独立的 DIB 记录，某一特定电导态的 N 表示在这些记录中合并检测到的事件总数。PPF 处理前后（图 7C–D）的寿命概率分布 N(t)/N(0) 显示，与 C16 膜相比，C12/C16 膜的电导分布具有更长的拖尾特征，且寿命发生变化，表明通道稳定性出现改变。直方图数据代表了每种条件下获取的 15 秒过滤轨迹（红色轨迹）。电导态寿命分布由每种条件下的 3 次独立 DIB 记录生成；虚线表示单个重复实验，实线表示对 N(t)/N(0) 与 t 的全局指数拟合。

图7：电导幅值直方图与电导态停留时间分布。在5 × 10^-6 gA:脂质摩尔比条件下，C16（A）和C12/C16（B）膜中gA活性的电导幅值直方图比较了PPF刺激前（灰色）与PPF刺激后（橙色/蓝色）的情况。直方图下方的高斯近似曲线表示单通道态和多通道态的平均电导峰值及其标准差的变化。PPF刺激后平均电导的偏移由虚线（黑色 = PPF前；蓝色/橙色 = PPF后）和箭头标示。每种条件均来自3次独立的双层脂膜（DIB）记录。对电导分布的统计学比较基于合并的事件级数据，采用Welch t检验和Mann-Whitney U检验（α = 0.05），其中某一电导态的N值表示在这三次记录中检测到的事件总数。分析中也包含了亚电导事件，并在每种膜条件下首个开放态峰左侧展示了代表性亚电导分布。C16（C）和C12/C16（D）膜中电导态事件的寿命概率分布在PPF刺激前（橙色/蓝色）和PPF刺激后（深橙色/深蓝色）的情况，对应于5×10^-6 M gA:脂质条件下的电导分析，如图7A–B所示。此处，N(t)表示持续时间长于时间t的全电导和亚电导事件的累积数量。点线表示来自各个重复实验的寿命分布（每种条件n = 3次独立DIB），实线内插图为使用非线性曲线拟合软件进行的全局指数拟合结果。图A–D改编自Podar PT等人的研究²⁵，根据CC BY-NC-ND 4.0许可为本稿件汇编。版权所有 © 2025 作者。由PNAS出版。 请点击此处查看该图的放大版本。

图8：检测单通道行为——C16中DIBs在PPF刺激后的电流响应轨迹。 (A) 15秒电流轨迹示例，显示原始数据（蓝色）、经250 Hz八极贝塞尔低通滤波器处理后的数据（红色）以及用于识别电导状态的理想化轨迹（绿色）。最稳定的最低水平定义为基线“关闭”状态。B) 在2之间的代表性亚电导水平检测结果^nd 和 3^rd 全导电水平，由幅度直方图中明显的中间峰予以证实（见 图7A，橙色）。通过每个已识别的电导水平（不包括闭合状态）的持续时间提取电导停留时间，以生成 N(t)/N(0) 寿命分布。转载自 Podar PT 等。²⁵ 根据知识共享署名-非商业性-禁止演绎4.0国际许可协议发布。© 2025 作者。由 PNAS 出版。 请点击此处以查看此图的放大版本。

在施加脉冲电场（PPF）后，C12/C16膜的电导幅值分布出现明显的向右偏移，表明单通道电导增强，同时电导状态寿命分布向左偏移，提示通道开放时间缩短。这些变化与PPF过程中C12/C16双分子层发生电机械性变薄的现象一致，该现象得到了参考文献25中直接的力学和厚度测量结果的支持：双分子层变薄降低了离子通过gA通道的能垒，从而在每次通道开放时提高离子通量，但同时降低了通道的稳定性。相比之下，C16膜在这两类分布上均表现出极小的变化，凸显其结构适应能力有限。综上所述，这些结果表明DIB平台能够捕捉到膜电机械适应的群体水平和单通道水平的相关特征，包括由膜组成依赖性动力学所引发的类似短时程可塑性（STP）以及类似长时程增强/抑制（LTP/LTD）的离子传导变化（图8）。

讨论

从实际应用角度来看，该方法提供了三种关键的实验能力：通过调节脂质组成和油相来可控地改变双层膜的组成，同时对膜的重构过程进行光学和电学监测，以及能够研究介于单通道电生理学与介观尺度膜力学之间的膜面积范围^{14,15,20,21,25}。这些特点使得该方法在简化膜系统的结构-功能研究中尤为有用，特别适用于关注膜电机械特性而非完整细胞复杂性的实验研究视角^{14,15,20,21,25,39}。

本方案描述了在烷烃油中组装并分析掺杂短杆菌肽A的双层脂膜（DIBs），以研究脂质膜在生理相关电刺激条件下发生结构重构的能力^{14,15,25,35,38}。与膜片钳技术相比²¹，DIB平台所检测的膜片面积大几个数量级，同时仍能保持足够的分辨率以捕捉离散的离子通道事件^{14,15,19,20,21,28,38}。该能力对于解析介观尺度的电机械重构（例如电润湿和电压缩）并将其与微观通道行为相关联尤为有价值，这些共同作用可在生理启发式刺激下产生类似短时程可塑性（STP）、长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD）的膜电导表型^13,25,27,38。当前的DIB系统并非旨在复制生物突触的分子复杂性^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11}。因此，术语如STP、LTP、LTD、成对脉冲促进（PPF）和成对脉冲抑制（PPD）在此仅以描述性和类比性方式使用，用于表示在特定刺激方案下膜离子电导在短时间和长时间尺度上的增强或减弱。本研究的主要发现应直接从膜电机械行为、电导适应性以及依赖于组分的非平衡态重构角度进行解释，这些现象可能为突触可塑性提供有益的概念类比和物理视角，但并不意味着与神经回路或生化突触调控具有机制上的等同性^10,11,25,38。

获得可重复结果的关键在于多个技术步骤。仔细制备银/氯化银（Ag/AgCl）电极至关重要，包括均匀熔融银球形尖端、充分氯化处理以及覆盖一层薄而均匀的琼脂糖涂层，这些措施可确保液滴稳定附着并实现低阻抗的电化学耦合^20,35。通过视觉确认液滴下垂情况及电极方向正确，可最大限度减少视频记录过程中的光学畸变，提高膜面积测量的准确性。在数据采集后，利用已知的银丝直径进行尺度校准，可建立可靠的像素到毫米的换算关系，这对于膜面积和离子流的准确计算至关重要。本研究中，膜电导（通量）定义为单位面积上的电流（I/A）；由于在电润湿过程中双层膜面积会发生变化，因此精确的通量定量需要同步获取电流与双层膜面积的时间匹配测量数据^13,25,27,35。

该方法在同一平台上还支持互补的集合水平和单通道读出^{14,15,20,25,35,38}。在集合水平上，同步的视频和电学记录可量化面积（电润湿）和电流的动态变化，并由此推导出离子通量（电流/面积）。在电刺激下，膜被驱动进入非平衡稳态（NESS），其依赖于组成的膜重构会产生类似短期可塑性的响应，并可在较长时间尺度（分钟级）内演变为类似长时程增强或长时程抑制的行为^{25,26,28,29,30,31,32,33,38}。在单通道水平上，分析涉及将电流轨迹理想化为阶梯状的电导水平（包括关闭态、单通道态、多通道态和亚电导态）。传统的方波理想化工具通常只能分辨有限数量的离散水平；对于更复杂或噪声较大的数据，推荐使用无需模型的理想化方法，例如 JSMURF³⁷。利用 JSMURF 分析短时直流钳制电位，可在异质噪声条件下实现统计上严格的事件检测，获得电导幅值直方图（整数及亚电导水平）以及 N(t)/N(0) 寿命分布。叠加理想化和滤波后的幅值直方图可实现电导态指派的可视化与定量交叉验证，而卷积重建（将理想化轨迹通过已知的低通滤波器）则可确认参数选择的合理性及事件保真度³⁷。

通过周围油相（例如 C16 与 C12/C16）调节膜组成，预计将影响双层膜在电刺激下的黏弹性及重构能力，这与先前研究中报道的直接测量结果一致^22,25,39。更柔韧的膜在PPF过程中预期会表现出更大的电容驱动变薄效应，并与gA实现更佳的疏水匹配^22,23,25，从而导致单通道电导增加以及促进作用增强，这种增强可稳定表现为类似LTP的行为^25,38。相反，较刚性的膜结构响应有限，在PPF和PPD期间电导变化较小，并在长时间脉冲刺激下倾向于表现出LTD。这些依赖于组成的差异性结果凸显了材料特性如何使膜倾向于形成不同但功能相关的长期状态^22,23,25,39。

DIB 平台也存在重要的局限性²¹。本文提出的机制性解释是：油相成分的差异会改变双层膜的材料特性及其对电机械重构的敏感性，进而调节短杆菌肽 A 的导电性^22,23,25。该解释得到了先前研究的支持，该研究在这些膜条件和刺激下直接测量了膜的黏弹性、界面张力以及动态膜厚度变化²²。然而，在本研究中，这些材料特性并未在每次实验中同步测量，因此本文仅用它们来支持 C16 与 C12/C16 环境下膜对电刺激产生不同结构和力学响应的观点，而非独立确立数据的机制性解释。此外，总体电流和通量可能同时反映了单通道电导的变化以及导电通道数量的变化，而后者可能随膜面积、肽的扩散以及非平衡条件下的二聚化过程而变化^17,18,22,23。在刺激过程中，周围的油相也可能动态地渗入或退出双层膜核心区域，导致单通道记录中基线漂移以及膜组成随时间逐渐改变^13,21,25。上述因素共同限制了长时间恒压记录用于定义静态膜特性的适用性，并强调 DIB 表现为开放的动态系统，而非封闭的平衡态膜系统^13,21,25。因此，尽管本实验方案能够捕捉在预期实验时间尺度内与刺激相关的、类似可塑性的导电性变化^25,38，但未来仍需结合直接的力学测量与同步的电学和光学记录，可能还需联合基于荧光的单分子成像技术，以更全面地解析膜重构、通道电导和通道数量各自所起的作用^21,25。

常见的失败模式包括液滴附着不稳定、液滴下垂不完全、双层膜形成过程中液滴过早融合，以及在面积分析期间双层膜边缘光学定义不清。液滴附着不稳定通常由银球几何形状不规则或琼脂糖涂层不均匀引起，可通过检查银球对称性并保持琼脂糖外壳光滑来减少。电极加样还需要将纳升级的水相液滴手动沉积到亚毫米尺寸的电极头上，这要求在不同折射率的介质（空气与油）之间具备良好的手眼协调能力和深度感知能力。因此，在加样过程中移液器尖端可能意外接触琼脂糖外壳或错过电极头。通过使用稳定增强技术，如固定手腕、在油中缓慢推进移液器以及屏住呼吸，并结合反复练习，可提高加样熟练度。此外，液滴下垂不完全或单层膜形成延迟可能由囊泡异质性、温度变化或琼脂糖表面形貌引起，可通过在液滴沉积后延长等待时间来改善^15,20,35。双层膜形成过程中的融合现象通常与过大的接触面积或过于强烈的电刺激（> ± 200 mV）有关，可通过减小初始液滴接触面积、给予更长时间使单层膜稳定，以及在施加脉冲前确认低幅度三角波电容响应正常来缓解^25,35,38。

尽管存在这些限制，DIB 平台仍具有高度可调性、可扩展性和可重复性^{14,15,20,21,25,35,38,40}，并通过分离脂质力学对传导的贡献，补充了以蛋白质为中心的电生理学研究^22,23,25。该方案通过在一个系统中整合群体与单通道测量，为剖析电功与膜黏弹性如何共同产生类突触传导行为（类 STP、类 LTP 和类 LTD 响应）提供了一条切实可行的途径，适用于可控的自下而上模型^{25,29,30,31,32,33,38}。因此，该方法为系统探索膜中依赖组分的学习规则，以及量化机械力与电力如何在时间和空间尺度上将膜蛋白与其宿主双层膜耦合提供了基础^21,22,23,25。总体而言，这些能力使 DIB 成为一种强大的框架，可用于将复杂的神经生物学行为分解为可处理、可验证的生物物理机制^10,11,25,38。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DPhPC）	Avanti Polar Lipids	850356P/850356C	以冻干粉末（P）或氯仿溶液（C）形式购买
琼脂糖	Sigma-Aldrich	A9539
琼脂糖（0.5 g 琼脂糖片剂）	Benchmark	A2501	可使用粉末或片剂形式
Agilent Technologies 33522A 波形发生器	Keysight	–	可使用任何具有 BNC 电缆输出的波形发生器
氩气（Ar）	Airgas	AR UHP300; 72-402221259-1	压缩氩气；超高纯度
分析天平	Mettler Toledo	型号：MS304S/03	任何精度为 0.0001 g 的实验室级分析天平
Axopatch 200B 放大器	Molecular Devices	–
BK Precision 4017B 10 MHz DDS 扫频/函数发生器	Digi-Key	BK4017B-ND
硼硅酸盐玻璃毛细管	World Precision Instruments	1B100F-4
Clampex pCLAMP 11 软件套件	Molecular Devices	–
DigiData 1550B 系统	Molecular Devices	–	包括微型挤出器、2 支注射器、100 张 PC 膜、100 个滤膜支撑环和 1 个支架/加热块
十二烷，99%	Sigma-Aldrich	112-40-3
带支架/加热块的挤出器套装	Avanti Polar Lipids	610000
Fiji 软件	ImageJ	–
超低温冰箱（-80 °C）	Fisher Scientific	Isotemp；型号：8964；序列号：828278-21
玻璃器皿	VWR International	–
短杆菌肽 A（Gramicidin-A）	Millipore Sigma	368020
十六烷，99%	Sigma-Aldrich	544-76-3
Hum Bug 噪声消除器（60 Hz）	A-M Systems	726300
倒置显微镜系统（Nikon Ti2-A）	Nikon	–	可使用任何倒置或正置显微镜
异丙醇	VWR International	BDH1133-4LP
微电极夹持器	World Precision Instruments	MEH1S
显微操作器	Sutter Instrument	MP-285	可使用手动操作器
显微镜相机	Olympus	DP74
Microsoft Excel	Microsoft	–
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
NIS-Elements 显微镜相机软件	Nikon	–	可使用具备实时预览和/或视频采集功能的相机捕获软件。实时预览结合同步屏幕录制可替代视频采集功能。
Parafilm M 通用实验室薄膜	Parafilm	PM999
培养皿	-	-	皿底必须透明，侧壁也最好透明
氯化钾（KCl）	Sigma-Aldrich	P3911
无粉柔软腈检查手套	VWR International	CA89-38-272
冰箱（4 °C）	Fisher Scientific	货号：97-938-1；型号：3556FS
银丝	GoodFellow	147-346-94
搅拌加热板	Thermo Scientific	SP131325