利用液滴界面双层进行脂质-蛋白质膜结构-功能表征

Summary

提出了一种实验方案，用于组装、电刺激并分析除氨素A掺杂的液滴界面双层。脂质-蛋白质结构-功能关系通过测量膜面积、离子通量和单通道电导的变化来量化，并将这些反应与电突触启发的膜模型中类似可塑性的离子传导变化联系起来。

Abstract

液滴界面双层（DIBs）提供了一个可调节的平台，用于在受控电刺激下探测脂质和脂质肽膜的机电性能。DIB能够在膜面积上进行单通道和集合离子电导率测量，测量面积远大于传统贴片钳技术，从而实现膜级机电变形及其对离子导电肽影响的分析。通过系统调节膜结构，涵盖整体烃类油相（例如六烯烃[C16]与十二烷/六烯[C12/C16][25%/75%，v/v]），这一自下而上平台实现膜成分和油环境的系统性变化，影响膜的粘弹性和结构重组，进而影响肽离子传导。详细流程包括利用不同烃类油组成组装摻有1,2-二鞘苷-甘油-3-磷胆碱的1,2-二酚酰胺-甘油-3-磷胆（DPhPC）膜，以及将膜驱动至亚稳态机电态的电压脉冲协议的应用。对适应性膜离子传导进行了表征，包括模型膜系统中短期的可塑性样（STP样）以及长期增强和抑制样（LTP样/LTD样）反应。更广泛地说，该方案提供了一种稳健且可重复的方法，用于系统性地研究成分依赖的膜级机电对突触样导电行为的贡献，并理解脂质膜环境如何调制离子通道功能。

Introduction

生物膜是关键的超分子结构，能够调节离子传导，并通过电和化学突触1、^2、3、4实现神经元之间的通信^。 这种类型的交流还受到突触可塑性的进一步控制，突触的结构变化调节其强度和持续时间，涵盖^5,6，通常以短期可塑性（STP）和长期增强或抑制（LTP或LTD）来描述。这些现象涉及细胞膜电导性对神经活动的动态变化，通常与神经可^塑性7相关，而神经可塑性7是学习和记忆⁸的基础。传统的可塑性模型通常强调通过蛋白质合成、运输或磷酸化对离子通道进行生化调^控。然而，神经元质膜在可塑性模型中的作用在很大程度上被忽视了^10,11。

贴片钳方法已被用于研究单离子通道电生理学超过半个世纪。然而，它们只能探测远小于完整突触或大型合成模型的膜区域。因此，它们在研究中尺度膜重组和变形方面存在技术限制。中尺度越来越被认可为理解膜生物物理学许多方面的关键长度尺度^12,13。

提出了一种方法，利用1,2-二叶酸二烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DPhPC）滴界面双层（DIBs）^14,15掺杂单价肽阳离子载体gramicidin-A（gA），模拟离子传导，类似于电突触中的表现。该系统具有几个关键优势：（i） DIBs提供可调节的脂质和油脂平台，允许系统性膜重组¹⁶;（ii） DIBs允许研究跨长度尺度^17,18的单通道和集合通道事件;以及（iii）DIB能够探测亚毫米级膜片，捕捉集体机电诱导膜重构，同时保留分辨单通道离子导电事件的能力^19,20。该方法最适合需要同时对膜电力学进行电学和光学探测，覆盖比传统贴片钳覆盖面积更大的膜区域，同时仍能解析离散通道事件的研究。当实验目标是研究膜的组成、油质环境和外加电压波形如何影响集体膜重构和肽传导时，它尤为有用。该方法较不适合需要原生细胞结构或直接分子读出完整生物膜中蛋白质构象变化的实验 19,20,21。

通过施加生理相关的电刺激，DIB被驱动进入非平衡稳态，动态机电重构改变肽离子通道的传导。这些离子传导的突发变化在描述上类似于神经科学^22、23、²⁴中讨论的神经STP、LTP和LTD现象。在本研究中，这些行为主要被解释为与膜内在力学特性相关的膜层级物理反应，如粘弹性和模型^{膜系统中的}可压缩性。值得注意的是，本文所述的研究建立在先前证据基础上，即脂质双层可以通过持续的电导变化和电容性电荷储存在刺激后表现出基本的电记忆 14,15,25,26,27,28,29,30,31,32,33^，34，提供了关于脂质双层如何在缺乏复杂细胞机制的情况下支持适应性突触样功能的机制的新见解。最后，该方法还能直接考察结构-功能关系，以及宏观行为如何由简单的结构重组产生 21,25,27。

Protocol

在样品准备前，请用适当的实验室洗涤剂彻底清洗所有玻璃器皿和准备设备，并用蒸馏水冲洗。请始终佩戴安全眼镜，并佩戴丁腈或乳胶手套以避免污染。 按照机构安全指南处理所有化学废弃物。确保挥发性溶剂按照机构安全指南妥善储存。确保实验实验室空间和硬件（图1A）、实验容器（图1B）以及电气和光学连接（图1C）保持无障碍且无障碍。

1. 水性缓冲液的制备

1. 称重适当量的3-（N-morpholino）丙烷磺酸（MOPS）和氯化钾（KCl），以获得所需的最终浓度（例如，10 mM MOPS，500 mL中0.1 M KCl）。
2. 将MOPS和KCl加入500毫升容量瓶或分量瓶中的~450毫升蒸馏水中，用磁力搅拌棒搅拌至完全溶解。
3. 用校准好的pH计测量pH值。通过连续搅拌时，将pH值以0.25毫升为单位加入1M氢氧化钾（KOH）或盐酸（HCl）调整至7.4。
4. 将总体积调至500毫升，加蒸馏水，充分搅拌均匀。将缓冲液转移到干净且有标签的瓶子中，密封后在4°C下储存。
   注意：缓冲期可使用最长~2个月。每次使用前都要确认并重新调整pH到7.4。

2. 制备左可杀菌素高汤溶液

1. 在化学排气柜中，向一个干净的20毫升玻璃瓶中加入5毫克的杀死素A（gA）。用玻璃或气密注射器加入10毫升甲醇，并用漩涡吸入肽完全溶解。瓶子标注为“gA高压”，并在-80°C下储存。
   注意：集合实验使用脂质：肽摩尔比值为~1：^10-4。单通道实验使用~10–100倍下肽（1：^10-5–^10-6）在短记录时间内（<1分钟）解析单个事件。在低摩尔比（< ~ 1：^10-4）下，制备稀释原料可提高移液精度。
2. 再用氩气清洗另外两瓶20毫升玻璃瓶，各清洗5秒以去除灰尘。
3. 使用干净的气密注射器，向每个排毒小瓶注入9.9毫升甲醇。
4. 用无菌气密注射器将100微升gA液移液移入一个小瓶，获得总容量10.0毫升。把这个小瓶标记为“A”。甲醇中浓度=2.66微M加A。
5. 移液器将100微升溶液“A”注入第二个玻璃瓶，获得10.0毫升总容量。将这瓶标记为溶液“B”。甲醇中浓度=26.6 nM gA。
6. 用瓶盖封口，并用防压膜包好。
7. 所有gA溶液在-80°C下保存，直到使用。

3. 脂肽囊泡的制备

1. 用氩气清洗干净的20毫升玻璃瓶，清洗约5秒。
2. 向小瓶中加入4毫克1,2-二非二基苯二烯-单甘油-3-磷胆碱（DPhPC）脂质。
3. 在排气柜中，使用玻璃移液器加入1毫升甲醇。轻轻旋转或旋转，直到所有脂质溶解。
4. 使用500微升气密注射器，加入178微升溶液“A”（用于集合级STP实验;DPhPC：gA 摩尔比 = 1：^10-4）或 890 微升溶液“B”（用于单通道实验;DPhPC：gA摩尔比=1：5×^10-6）进入DPhPC甲醇溶液中。轻轻地用漩涡混合。
5. 在排气罩内用温和氩气流加热，将甲醇蒸发，直到瓶底形成薄而均匀的脂质膜。
6. 将开瓶放入40°C真空烤箱，吸真空10–12小时或过夜以去除残留溶剂。
7. 将小瓶从真空炉中取出，加入第1节为STP实验准备的0.1 M KCl缓冲液，最终悬浮液中的脂质和除名剂浓度分别为2.36 mM和236 nM。对于单通道实验，加入2毫升1 M KCl缓冲液，如第1节准备。通过涡旋使脂质膜重新水合，获得2 mg/mL的脂质悬浮液，最终在悬浮液中的脂质和杀菌素浓度分别为2.36 mM和11.8 nM。
8. 将小瓶在-80°C冷冻至少6分钟，然后在40°C的热板或水浴中解冻6分钟。漩涡短暂混合。重复此冻融循环六次，以促进多层囊泡的形成。
9. 按照制造商说明组装一台带有0.1微米孔径轨蚀膜的脂质囊泡挤出机。将500微升缓冲液三次通过挤出机，使其膜水化，确认无泄漏，然后丢弃缓冲液。
10. 将1毫升解冻的脂肽悬浮液装入挤出机，并对0.1微米膜进行31次通过，以获得直径约100纳米的单层囊泡，并确保尺寸均匀。
11. 将挤出的囊泡（大型单层囊泡，LUV）转移到1毫升PCR管中，标记后保存于4°C。准备后两周内使用。
12. 将剩余的未挤出脂蛋白悬浮液封入原瓶，用防腐胶膜包裹，保存在-80°C下以备后用。
13. 如果使用先前冷冻的未挤出样品，使用热板在40°C重新熔炼，或让样品冷却至室温后再挤出样品。

4. 琼脂糖凝胶的制备

1. 把一个干净的50毫升玻璃烧杯放在热板上。将一片琼脂糖片加入50毫升用于水合脂质膜的缓冲液（例如10 mM MOPS，0.1 M KCl，pH 7.4），形成1%琼脂糖凝胶溶液。
2. 加入一个干净的特氟龙搅拌棒，用力搅拌直到药片散开。
3. 用铝箔纸覆盖烧杯，用金属刮刀戳一个小通风孔。将热板温度设定在220–230°C。溶液会变得清澈并进入滚动沸点，表示琼脂糖完全溶解。
4. 关掉火，小心地取下锡纸。用干净的金属刮刀刮除任何表面薄膜。立即使用热琼脂糖溶液作为电极涂层，或让其在烧杯中冷却凝固，以备后续使用。
5. 电极琼脂糖涂层后，将凝固琼脂糖覆盖锡箔，用防腐胶封口，标记后保存于4°C。需要时，重新加热至沸腾，搅拌至完全融化。

5. 电极的制备

1. 将直径0.125毫米的银线切割成~70毫米长的头台电极和~130毫米的接地电极长度。
2. 使用明火（例如手持打火机或本生灯），将每根银线的一端水平置于火焰最热的中央锥体中，直到尖端融化形成直径约0.2毫米的球体（见图2A）。
3. 将导线放置在干净的表面上，用显微镜检查球体是否呈球形且大小相近。如果球是长方形或不规则的，切掉尖端并重复融化步骤（步骤5.2）。
4. 将两根银线的末端放入装有新鲜家用漂白剂（次氯酸钠，NaClO）的玻璃容器中。确保球完全浸没并孵育至少1小时，以氯化表面并形成Ag/AgCl。暗棕灰色外观确认氯化成功（见图2B）。
5. 当漂白剂的球端变成暗灰色时，取下线材，用蒸馏水彻底冲洗，然后放在干净、无绒毛的表面上晾干。
6. 准备一个头级移液器座和一个接地电极座。用玻璃切割器将100毫米硼硅玻璃毛细管（外径1.0毫米，内径0.58毫米）切成两半。
7. 将一个半毛细管插入头级移液器支架，并拧紧支架以固定。在接地电极支架上安装一整根100毫米毛细管并固定。
8. 将130毫米银线的非球形端插入接地电极毛细管，直到球端突出~20毫米。将线的另一端用胶带固定在支架上，留下~5毫米的接地空间。
9. 再用70毫米的导线连接舞台电极，确保线与舞台连接器（金色接头）保持牢固接触。剪掉头台连接器端多余的线。
10. 将每个氯化银球浸入琼脂糖中，靠近球轴连接处，形成薄且均匀的涂层。至少进进出出10次。
11. 取出电极，让琼脂糖在室温凝胶。如有需要，重复浸泡以获得厚度数十微米的平滑均匀琼脂壳。避免在导线上涂得太高或太低（图2C）。
12. 将头台和接地电极安装到微型机械臂上。用鳄鱼夹将裸露的地线（~5毫米）连接到放大器的地线。
13. 用镊子轻轻弯曲每个电极，使其球端与显微镜台垂直。避免弯曲超过90°，以减少显微镜视觉和视频捕捉画面中的光学畸变。
14. 调整其支架内的电极方向，使琼脂糖涂层球端垂直于显微镜成像平面（见图3A）。

6. 液滴界面双层（DIBs）的形成

1. 将一个干净、底部透明的培养皿放在倒置显微镜的台上。将烷烃油（例如100%六烯烷，或25%/75% v/v的十二烷/六烯烷）填充天线，深度为~5毫米（见图1B）。
2. 利用微操作手控制，将两端琼脂糖涂层的球端放入油中，深度约为油面以下约2.5毫米。避免微型机械手快速运动，以防止电极球头与培养皿碰撞。
3. 调整显微镜焦点，直到球端及其琼脂涂层都清晰聚焦。将电极放置在视场边缘附近，以便同时观察两者。
4. 使用校准的2微升移液管，抽取挤出的脂质肽囊泡悬浮液。用独立的移液头缓慢地将250 nL悬浮液直接滴入每个琼脂涂层球端，且不接触琼脂糖壳体。
   注意：为了减少手部震动并提高稳定性，请将双肘固定在防震桌台上。用非移液手稳定移液手腕，缓慢将移液器浸入油中，逐渐接近电极。在液滴加载时短暂屏气可能进一步减少意外动作。
5. 让液滴扩散并覆盖琼脂糖壳，并在重力作用下下从电极上下沉。如果没有，观察从侧面通过培养皿壁下垂（见图3B）。
   注意：液滴下沉所需的时间取决于囊泡大小分布、温度和琼脂糖地形。对于DPhPC（双重沉积）DIB，至少在液滴沉积¹⁵分钟后等待5分钟。
6. 轻轻推动防震台，以评估飞沫的敏感度。确认下垂液滴相对于电极运动有轻微延迟，表明形成了完全包覆的脂质单层液滴。
   注意：延迟运动的发生是因为水液滴周围形成脂质单层显著降低表面张力，从而延迟电极在油中移动时的物理响应。
7. 如果未观察到此行为，再等待2-3分钟并重复此过程。

7. 电气装置与双层监测（视觉和电气）

1. 确保显微镜、防震台、法拉第笼以及所有电气部件，包括放大器、数字化器、功能发生器和计算机，都连接到一个公共接地（见图1）。
2. 按照制造商的安装指南安排乐器连接。以 图1C作为基本电气和光学配置的示意参考。请参阅关于接地³⁵、硬件/软件配置以及DIB实验移液器偏移调整的详细说明。
   注意：所有材料表中列出的软硬件，请遵循设备特定的安装说明 。
3. 将头置和地电极连接到贴片钳放大器。
4. 配置一个外部函数发生器（或采集软件的输出通道），生成10 Hz、10 mV的三角电压波形。在连接的示波器和采集软件中确认振幅和频率。
5. 液滴下沉约~10分钟后，使用微型机械臂将两滴轻柔接触。调整电极位置，使液滴接触面积最初不超过其直径的~1/4。
6. 打开10 Hz、10 mV三角形波形，并用放大器和采集软件监测电容电流响应。
7. 等待自发双层形成，电学上表现为峰对峰电容电流响应的扩展，光学上则通过双层接触时内部反射（椭圆形）增加（见图4）。确认纯脂质双层对三角形电压刺激呈矩形电流平台，而γ-A掺杂双层在~1：^10-4 脂质上：肽表现出斜坡平台，反映集合离子传导。
8. 通过稍微移动电极来调整液滴接触面积，直到对10 Hz、10 mV三角形波形的峰值电容电流响应在约250 nL DIB的C16或C12/C16油中介于~100–200 pA之间，对应电容范围~250–500 pF³³。
   注意：高频脉冲或非零直流保持电压可诱发电润和双层过度膨胀，导致液滴聚合和双层破裂。100–200 pA范围在双层稳定性和信噪比之间取得了平衡，允许在刺激过程中实现足够的面积膨胀。
9. 如果DIB凝结，就把电极从油中取出来。用与脂质样品和琼脂糖相同的水性缓冲液彻底冲洗电极头。
10. 用无菌注射器去除培养皿中的任何水珠。如有需要，补充新机油，电极重新浸入水中。按照第6节描述，将LUV溶液重新装入电极，重复此过程。
11. 一旦确认电容或导电响应稳定，关闭三角形波形，让DIB平衡至少15分钟后再应用刺激方案。

8. 电刺激方案

1. 脉冲实验（集合STP类和LTP / LTD类反应）
   1. 配置功能发生器或采集软件，以提供所需的幅度、持续时间和脉冲间隔的电压脉冲（例如，PPF[成对脉冲促进]和PPD[成对脉冲抑制]模式）。
   2. 打开视频采集软件。选择合适的相机和物镜设置。将帧率设置为至少20帧/秒，并确认录制过程中保持稳定。
   3. 在数据采集软件中，将当前信号的采样频率设置为至少5 kHz。
   4. 点击“ 获取> 新协议 ”创建新协议，或点击 “获取 > 编辑协议 ”修改现有协议。在 获取模式 标签中，选择“ 间歇性刺激”。把 跑数/试跑 数设为1，扫荡 /跑 动设为1。
   5. 将扫描持续时间设置为比实验总持续时间长4秒。对于120秒的STP协议（60秒PPF + 60秒PPD），将扫描时长设为124秒，以便刺激前后基线有2秒。
   6. 在 输入 标签页中，将录音通道分配给当前输入。在 输出 标签页中，将刺激通道分配给控制电极的电压输出。
   7. 打开波形标签页。在A列，将类型设为步进，第一级为0 mV，第一次持续时间为2000毫秒，以定义刺激前基线。
   8. 在B列（PPF）中，将类型设置为阶梯。指定期望的电压幅度（例如：+100 mV）、脉冲持续时间（例如100毫秒）和列车速率，以设定对应目标占空比的脉冲间隔（例如90.9%）。
   9. 在C列（PPD）中，同样将类型设置为步进，振幅和脉冲持续时间相同，但增加列车速率或脉冲间隔以达到期望的较低占空比（例如28.6%）。
   10. 在 D列，配置与 A列 相同的刺激后基线（0 mV，2000毫秒）。
       注意：如果 波形 标签页中所有历元的总时长超过 模式/速率 标签中的扫频时长，请略微延长扫描时长直到错误解决。
   11. 将协议保存为描述性名称（例如“STP_120s”）。
   12. 开始录制视频，然后立即通过点击红色圆圈“录制”按钮开始电获取/刺激，记录数据。或者，配置数字触发器，使刺激起始同时触发视频录制和电采集。
   13. 在刺激的前60秒（PPF），测得的电流响应通常从第一个脉冲开始增加，可能在t = 60秒时达到可见的平台期;而在刺激的最后60秒（PPD），测得的电流响应通常下降（见图5）。协议结束时，同时停止电采集和视频录制。
2. 单通道实验
   1. 在电阻放大器前面板上，将 外部指令输入 开关设置为 关闭。 将 保持电压 设置为+200 mV。将放大器内置 的低通滤波器 设置为1 kHz。在采集软件中，将 采样率 设置为10–50 kHz，并选择连续的“无间隙”录制模式。
      注意：高采样率可能会降低采集数据的信噪比。在解析快速门控跃迁或短暂闪烁状态时，使用更高的采样率非常重要。左挽糖蛋白A的平均开放寿命通常在0.1秒到10秒之间，而闪烁态可能出现在亚兆秒和微秒的时间尺度上;因此，可能需要~50 kHz的采样率来捕捉此类事件³⁶。随后使用JSMURF进行单通道理想化分析，可在可变信噪比录音中实现稳健事件检测³⁷。
   2. 在未施加外部指令的情况下，开始记录基线电流信号。在放大器上，将 电压指令 从 关闭 切换到“+” ，使DIB两端施加+200 mV直流电压。
   3. 记录约15秒以捕捉单通道事件，同时限制基线漂移。在脂质：gA摩尔浓度为1：5×^10-6_时， 由于通道导电门控事件的形成和消除，记录的电流呈阶梯状。
   4. 在停止录制前，将 电压命令 从“+” 切换回关闭 。 停止数据采集，并用描述性文件名保存录音（例如，“DIB_C16_postPPF_200mV.abf”）。
      注意：定义时长的单通道录音也可以通过程序化的 情节刺激进行，按第8节描述的PPF/PPD固定幅度和持续时间。对于“后PPF”单通道实验，PPF60秒后立即搭载+200毫伏直流电压的 情节刺激 。

9. 膜面积与通量外推

1. 在每个集合实验（STP、LTP/LTD）结束时，用微操作手缓慢地将一个电极横向移动以分离DIB。
2. 松开微操作手电极支架，将支架内的电极旋转~45°，使125微米银线位于成像平面内。
3. 调整电极高度，直到显微镜下导线清晰聚焦。用相机软件拍摄聚焦银线的静态图像或截图。将比例图像保存，以备后续像素尺寸校准至毫米。
4. 按照参考文献28中描述的程序处理记录的电流轨迹，以获得连续且无伪质的电流随时间数据（图6A）。
5. 通过将帧索引除以测量的帧率，并匹配采集时间戳来确定帧到时间的映射。
6. 将比例校准图像和实验帧导入图像分析软件。
7. 利用刻度校准图像中已知的导线直径（125微米）通过软件校准函数（分析 > 设定刻度）设定空间刻度。
8. 对于每个实验的通量计算，选择N个时间点，涵盖整个刺激周期（例如，120秒实验中的30个时间点）。确保第一个时间点对应第一个刺激脉冲。
9. 在每个时间点，通过在双层边交点画一条线，并以校准单位记录其长度，来测量DIB直径。
10. 将每个测量直径转换为膜面积（A），假设为圆形几何或使用针对特定脂质-油配置的相应椭圆几何尺度因子。利用这些区域评估不同实验条件下膜面积随时间的演变（见图6B）。
11. 对每个时间点，将对应的当前值除以面积，得到通量（I/A）。将所有N个通量数据点除以第一个通量值，得到归一化至第一脉冲（I/A） / （I₀/_{A 0}）的通量，当需要归一化通量分析时（见图6C）。
12. 绘制通量或归一化通量与时间，或脉冲数与时间。对所有集合实验（STP、LTP/LTD）进行重复通量分析（见图6D）。
13. 将PPD期间相对于第一脉冲持续上升或归一化通量的持续升高或归一化通量解释为传导增强，而回归基线或低于第一脉冲值则表示传导降低。利用所得时间尺度将反应分类为短期可塑性样行为（<2分钟）或长期增强/抑郁类行为（>~5分钟）。

10. 单通道分析

1. 将原始单通道录音导入首选分析环境或 clampSeg 接口，并参考³⁷ 以获取软件功能的完整描述和说明。
2. 应用与实验采集滤波器匹配的数字低通滤波器（例如，1 kHz 贝塞尔滤波器）。
3. 参数配置。
   1. 设 alpha （α） = 0.05，定义统计置信水平，使得每个检测到的步骤有<5%的概率是随机噪声波动。
   2. 每1秒段指定 5,000-10,000次蒙特卡洛 迭代，以估算噪声分布并增强事件检测的统计鲁棒性。
      注意：如果有并行计算处理，请按1秒“块”进行，以减少分析时间。
   3. 对滤波后的电流走线运行 JSMURF 算法。
4. 模型验证。
   1. 将理想化的（方波）导电迹叠加在滤波后的电流轨迹上，并直观确认阶跃变与实验信号的突然变化一致。
   2. 利用已知的低通滤波器特性生成理想化迹的卷积重建，并将其叠加在原始迹³⁷上。确认重建后的信号与记录电流的时序和幅度包线高度匹配。
5. 电导和寿命的量化。
   1. 定义理想迹中最低的稳定平台为闭基线态。将第一个非零平台振幅确定为主要开态电导（单通道电平）。
   2. 将该振幅的更高整数倍分类为多通道开态（2+、3+等）。识别稳定但低于完全开放能级的中间平台，称为亚导通状态。
   3. 从理想化的痕迹中提取每个事件的幅度和持续时间，并将其分组生成电导幅度直方图和终生直方图。
6. 振幅直方图与终生分布
   1. 将理想化的电导-振幅直方图与直接由滤波数据生成的振幅直方图进行比较。确认理想直方图显示出更锐利、更分离的峰值，对应离散电导状态³⁷。
   2. 对于每个实验条件，计算生存函数N（t）/N（0），其中N（0）为开放事件（满事件和亚导事件）总数，N（t）为持续时间超过t的事件数。排除闭合态区间。
   3. 在首选软件中使用非线性最小二乘法，绘制N（t）/N（0）对时间的比拟合指数衰减函数。
   4. 将幅度直方图中电导分布峰的右移解释为电导度增加，N（t）/N（0） 较长的衰变时间常数与时间图的较长解释为开态稳定性的提升，左移分布则为通道寿命缩短。
      注意：尽量减少环境干扰，如气流、振动和附近移动物体。避免靠在光学台上，避免与实验设备相关的对话。保持手机、平板电脑、笔记本电脑及其他个人电子设备距离法拉第笼至少1.5米，以减少电磁干扰。使用光学透明的油槽，优化显微镜的照明和对比度，以锐化液滴和双层的边缘。如果能提升边界对比度并简化DIB直径的手工测量，可以采集和/或导出灰度视频。对于不研究温度效应的实验，确保实验室环境、显微镜架和油液温度保持在21–22°C之间。

Results

DIB实验装置
录音系统安装在法拉第笼内，配备防震台，电气和视频数据由两台独立计算机采集（见图1A），但也可使用具分屏功能的单台计算机。DIB样品环境由两个琼脂涂层电极浸没在一定体积的烷烃油中组成（见图1B）。图1C 展示了本手稿中描述的实验装置的基本电气和光学连接示意图。

图1：实验装置。（A） 防震台和法拉第笼外壳，主要组件包括放大器、数字化器、噪声滤波器、功能发生器和用于电气和视频采集的双计算机接口。（B）DIB样品环境和电极的正面上视图。（C）与本手稿中描述的实验装置相关的电气和光学连接示意图。所有组件在实验室建筑内共用一个接地。所有实验均在室温（21–22°C）下进行。请点击此处查看该图的放大版本。

Ag/AgCl电极的制备与质量控制
银线尖端熔化后形成球形球体（见图2A）;质量差的熔体呈椭圆形或不规则。漂白剂中的氯化会产生暗棕灰色的Ag/AgCl表面（见图2B）。球体上厚度达数十微米级的薄均匀琼脂糖涂层对于液滴稳定支撑和低阻抗电化学耦合至关重要，而涂层不均匀则会导致液滴附着不良（见图2C）。

图2：电极制备。 （A）优质和劣质电极熔体的显微图像。（B）非氯化与氯化电极头的比较。（C）优质和劣质琼脂糖涂层的例子。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：电极布置。 （A）安装电极角度对准的上视图。（B）比较LUV加载后立即下垂液滴与单层形成后下垂液滴的侧面视图。请点击此处查看该图的放大版本。

电极位置与液滴下垂行为
俯视图显示电极角度正确定位，以最小化光学畸变（见图3A）。侧面视图比较了非下垂（LUV溶液装载后立即下垂）和下垂的脂质包裹液滴（5分钟后）（见图3B）。用于形成DIB的下垂液滴由于脂质单分子层表面张力显著降低，导致运动物理反应延迟，视觉上确认形成了完全被脂质单层覆盖的悬浮水性液滴。在形成下垂后，使用三角波刺激以电学确认双层形成和稳定性³⁵。

图4：液滴界面双层形成。 （A） 延时序列，显示液滴接触后双层的形成和膨胀。（B）用于双层直径和面积估计的内部膜反射。DIB成像通过倒置显微镜从装置下方进行。比例条=50微米。请点击此处查看该图的放大版本。

DIB形成与面积测量
连续图像捕捉到当两个下沉液滴接触时自发的双层“拉链”和面积扩展（见图4A）。液滴接触处明亮的内椭圆形反射被用来估算双层直径，进而推算膜面积随时间变化（见图4B）。

图5：STP方案——刺激与反应。 上图展示了配对脉冲促进（PPF，0–60秒，红色）和配对脉冲减退（PPD，60–120秒，蓝色）期间的代表性电流反应，以及相应的刺激方案（下）。PPF和PPD脉冲持续时间为100毫秒，关闭时间分别为10毫秒和250毫秒，占空比分别为90.9%和28.6%。促进率对应离子电流的净增加;抑郁对应于净减少。当前的回复仅在ON期间记录;为了可视化，脉冲间的数据会插值以突出整体电流趋势。脉冲示意图的时间长度及PPF和PPD相内脉冲数未按比例绘制，仅为可视化目的进行示意。代表性的当前响应数据，摘自Podar PT等人，²⁵页，依据CC BY-NC-ND 4.0。版权所有 © 2025 作者。由美国国家科学院院刊物发表。刺激示意图为本稿修改。请点击此处查看该图的放大版本。

诱导短期类可塑性行为（类STP）的电刺激方案
此处所指的刺激模式代表了神经科学术语中的成对脉冲促进（PPF）和抑郁（PPD），类似于Koner和Najem^28,29页。成对脉冲促进（PPF;0–60秒）和成对脉冲减压（PPD;60–120秒）分别通过100毫秒的脉冲实现，关闭时间分别为10毫秒和250毫秒，对应PPF的占空比为90.9%，PPD为28.6%。上方面板显示了ON期间的代表性当前反应，下方面板显示刺激模式。

STP及后续长期刺激期间的电流、面积和离子通量
在PPF和PPD期间，γ掺杂DPhPC双层的C16和C12/C16油的归一化电流（I/I₀）显示（见图6A）。在30个时间点测量的归一化膜面积（A/A₀）显示，尽管电流不同，两种油品条件下面积演变相似（见图6B）。归一化的流流和面积数据分别以28个独立油±DIB的平均S.D.云和柱表示。归一化通量 J/J₀ = （I/I₀）/（A/A₀）分离了面积无关的电导变化，并且与膜导导变化相符，超越了简单面积扩张（见图6C）。然而，这些变化可能反映了单信道导电和有源导通信道数量的共同影响。长达30分钟的PPD刺激会在C16膜中产生长期抑制样（LTD）行为，但保持与C12/C16膜中LTP样行为一致的升高通量（见图6D）。这些数据共同表明，膜的组成能够调节离子通量中短时间尺度和长期可塑性样的变化。

图6：在C16（橙色）和C12/C16（蓝色）油中掺杂的DPhPC膜，在SPP和LTP/LTD过渡过程中DIB的电流、面积及计算离子通量。（A） 在PPF（0–60秒，白底）和PPD（60–120秒，灰底）期间，C16（橙色）和C12/C16（蓝色）油中，每个条件包含n=28个独立形成的DIBs。（b） 30个时间点的归一化膜面积（A/A₀），尽管当前响应不同，但显示出可比的面积轨迹;数据±以相同n=28个独立DIB在每种机油条件下的平均分数显示为S.D.。（C） 归一化通量，J/J₀ = （I/I₀）/（A/A₀）），由相应的电流和面积测量计算得出，突出显示除面积效应外电导的变化。（D）在长时间PPD刺激下的长期行为：在初始120秒STP（灰阴影）后，DIB接受30分钟PPD，脉冲为ON = 100毫秒，OFF = 250毫秒（红绿实心）或30秒（橙/灰）脉冲。C16膜的通量衰减至或低于基线，表明LTD样行为，但在C12/C16膜中仍升高，表明LTP样行为持续存在。阴影区域表示I/I₀和A/A₀的传播误差。（D）中的扩展PPD数据集从每个油质条件n=6个独立DIB中获得，采用120秒方案，随后每个扩展PPD条件下获得3个DIB。所有数据点仅用于可视化目的。面板A、B和D依据CC BY-NC-ND 4.0再现。版权所有 © 2025 作者。由美国国家科学院院刊物发表。本稿的面板C是根据Podar PT等人²⁵页中报道的数据重新生成的。请点击此处查看该图的放大版本。

在PPF刺激后形成的gA掺杂DIB的代表性15秒单通道电流迹
该走线包括用1 kHz低通滤波器在50 kHz捕获的原始信号、250 Hz 8极贝塞尔滤波器跟踪以及理想化的JSMURF拟合。最低稳定能级定义闭合态，更高能级对应单信道、多信道和亚导事件。这些痕迹为电导幅度和寿命分析提供了基础。所示的导电态滞留时间代表特定电导水平的持续时间，其幅度和持续时间反映了多个同时发生的全导和/或亚导事件的综合贡献。

电导幅度与生命周期分布
C16和C12/C16膜的电导振幅直方图（见图7A–B）比较了PPF前后条件，DPhPC：gA摩尔比为1：5×10-6。数据下方的高斯近似显示PPF后平均导电峰的偏移，并解析对应亚导态和多通道态的独立峰。对汇聚事件级数据进行了导电分布的统计比较，采用Welch's t检验和Mann-Whitney U检验（α = 0.05），每个条件包含3个独立的DIB记录，N表示该电导状态中检测到的事件总数。寿命概率分布 N（t）/N（0），前后（图7C–D）显示，C12/C16 膜发展出更长尾的导电分布和相对于 C16 的寿命变化，表明通道稳定性发生变化。直方图数据代表了每种条件下获得的过滤后的15秒痕迹（红色轨迹）。电导态生命周期分布由每个条件的3个独立DIB记录生成;虚线表示单个重复，实线曲线表示对 N（t） / N（0） 对 t 的全局指数拟合。

图7：电导幅度直方图和电导-状态滞留时间分布。 （A）C16和（B）C12/C16膜中gA活性的电导振幅直方图比较了PPF前（灰色）和PPF后（橙色/蓝色）条件下的5×10-6gA：脂质摩尔比值。直方图下方的高斯近似显示了单通道和多通道状态的平均导电峰值和标准差的移动。PPF后平均电导率的偏移用虚线表示（黑色=PPF前;蓝色/橙色=PPF后）和箭头。每个条件代表3个独立的DIB记录。对合并事件级数据进行了导电分布的统计比较，使用韦尔奇t检验和曼-惠特尼U检验（α = 0.05），其中N表示这三种记录中检测到的事件总数。分析中还包括亚导通事件，代表性亚导分布标示在每个膜状态第一个开态峰左侧。C16（C）和C12/C16（D）膜在PPF刺激前（橙色/蓝色）和之后（深橙色/深蓝色）在5×10-6 M gA：脂质下电导态事件的终生概率分布，对应图7A–B所示的电导分析.这里，N（t） 表示持续时间超过时间 t 的全导和亚导事件的累计数量。虚线表示单个复制的生命周期分布（每个条件n = 3个独立DIB），实心插入表示使用非线性曲线拟合软件进行的全局指数拟合。A–D面板摘自Podar PT等人，²⁵页，并依据CC BY-NC-ND 4.0编纂。版权所有 © 2025 作者。由美国国家科学院院刊物发表。 请点击此处查看该图的放大版本。

图8：探测单通道行为——PPF刺激后C16中DIBs的当前反应追踪。 （A） 示例15秒电流迹，显示原始数据（蓝色），经过250 Hz 8极贝塞尔低通滤波器滤波（红色），以及用于识别导电态的理想化轨迹（绿色）。最低稳定水平定义了基线“闭合”状态。（B）在第2至第3^全电导水平之间检测到代表性的亚电导水平，并由振幅直方图中明显的中间峰值支持（见图7A，橙色）。电导滞留时间从每个识别的电导能级（不包括闭合态）的持续时间中提取，以生成N（t）/N（0）的寿命分布。摘自Podar PT等人，^第25页，依据CC BY-NC-ND 4.0。版权所有 © 2025 作者。由美国国家科学院院刊物发表。请点击此处查看该图的放大版本。

继PPF之后，C12/C16膜的电导振幅分布明显向右偏移，表明单通道电导增强，导电态寿命分布向左移动，符合通道开启时间缩短。这些变化与PPF期间C12/C16双层的机电变薄现象一致，这一点得到了文献25中直接机械和厚度测量的支持，这降低了通过gA的离子输运能量障碍，提高了每次开口的离子通量，同时降低了通道稳定性。相比之下，C16膜在任一分布上变化极小，凸显其结构适应性有限。综合来看，这些结果表明DIB平台捕捉了膜机电适应的集合和单通道相关，包括由膜组成依赖动力学引起的STP样和LTP/LTD样离子传导变化（见图8）。

Discussion

在实际操作中，该方法具备三项关键实验能力：通过脂质组成和油相可控的双层成分变化，膜重构的同时光学和电监测，以及实现连接单通道电生理与中尺度膜力学的膜区域范围 14,15,20,21,25.这些特性使该方法在简化膜系统中的结构功能研究中尤为有用，因为膜电力学而非完整细胞复杂性是实验视角的重点，14,15,20,21,25,39。

本方案描述了在烷烃油中组装和分析含姴麦苷A掺杂的DIBs，以探究脂膜在生理相关电刺激下的重构能力（14,15,25,35,38）。与贴片钳技术²¹相比，DIB平台询问的膜膜片段数量级大得多，同时保持足够分辨率捕捉离散离子通道事件14,15,19,20,21,28,38.这一能力对于解析中尺度机电重塑（例如电润和电压缩）以及将其与微观通道行为联系起来尤为重要，这些行为在生理启发刺激下共同产生STP、LTP和LTD样膜电导表型13,25,27,38.当前的DIB系统并非旨在复制生物突触1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11的分子复杂性.因此，像STP、LTP、LTD、PPF和PPD等术语通常以描述性和类比的方式使用，指代在定义刺激协议下膜离子传导在短时间尺度和长期尺度上的增减。因此，这项工作的主要发现最直接地从膜电力学、导电适应以及DIB中的成分依赖性非平衡重构来解释，这些理论可以为突触可塑性提供有用的概念类比和物理视角，而不意味着与神经回路或生化突触调控具有机械等价性（10,11,25,38）。

获得可复现结果的关键步骤是若干技术步骤。对Ag/AgCl电极的精心制备，包括均匀熔化银球形尖端、彻底氯化以及薄且均匀的琼脂涂层，确保液滴稳定附着和低阻抗电化学耦合^20,35。液滴下垂的目视确认和正确的电极方向可最大限度减少视频录制时的光学畸变，并提高膜面积测量的准确性。利用已知银线直径进行采集后尺度校准，实现了稳健的像素到毫米转换，这对于可靠计算膜面积和离子通量至关重要。在本研究中，膜电导率（通量）定义为单位面积的电流（I/A），由于DIB面积在电润过程中会发生变化，准确的通量量化需要时间匹配电流和双层面积测量^{13、25、27、35}。

该方法还支持同一平台内的互补集成级和单通道读数，地址为^{14、15、20、25、35、38}。在集合层面，同步视频和电记录量化面积（电润）和电流的动态变化，从而获得离子通量（电流/面积）。在电刺激下，膜被驱动进入非平衡稳态（NESS），成分依赖膜重构产生短时间尺度的可塑性反应，这些反应可在较长时间内演变为更长的增强类或抑制行为^（min）25,26,28,29,30,31,32，^33,38。在单通道层面，分析涉及将电流轨迹理想化为阶梯导电能级（闭合状态、单通道状态、多通道状态和亚导状态）。传统的方波理想化工具通常只解析有限数量的离散能级;对于更复杂或噪声较大^{的数据，首}选无模型的理想化方法，如JSMURF。使用JSMURF分析的短暂直流保持电位，在异构噪声下提供统计严谨的事件检测，得出电导-振幅直方图（整数和亚电导水平）及N（t）/N（0）寿命分布。叠加理想化和滤波幅度直方图可实现导电态赋值的视觉和定量交叉验证，而卷积重建（通过已知低通滤波器的理想化痕迹）则确认参数选择和事件保真度³⁷。

通过周围油相调谐的膜成分（例如C16对C12/C16），预计在电刺激下调节双层粘弹性和重构能力，这与之前22,25,39中报告的直接测量一致。更顺从的膜预计在PPF 22,23,25期间表现出更大幅度的EC驱动稀释和与gA的疏水匹配，从而提升单通道导电和促进率，并可稳定为LTP样行为^25,38。相反，较硬的膜表现出结构响应性有限，PPF和PPD期间电导变化较小，且在长时间脉冲下倾向于LTD。这些成分依赖性结果凸显了材料性质如何使膜倾向于形成不同且功能相关的长期模式 22,23,25,39。

DIB平台也存在重要限制²¹。这里提出的机械解释是，油成分差异改变了双层材料的性质和机电重组的敏感性，进而调节了22,23,25的氧化酰亚基苷A导电。这一解释得到了之前的研究的支持，该研究直接测量了膜粘弹性、界面张力以及在这些膜条件下的动态膜厚度变化和刺激。然而，在本研究中，这些材料性质并未在每个实验中同时测量，因此这里用于支持C16和C12/C16环境中膜电刺激时结构和机械响应的不同，而非独立确定数据的机理解释。此外，集合电流和通量可能反映单通道电导的变化以及导电通道数量的变化，这些变化可能随膜面积、肽扩散和非平衡条件下的二聚化变化，^{条件为17,18,22,23}。周围油相在刺激过程中也可能动态地渗透或退离双层核心，这导致单通道记录中的基线漂移以及膜成分随时间的渐变 13,21,25。这些因素共同限制了长时间恒压记录用于定义静态膜性质的使用，并强调DIB表现为开放的动态系统，而非闭合平衡膜13,21,25。因此，虽然当前方案捕捉了刺激依赖、类似可塑性的导电变化，但未来将需要结合直接机械测量与同时电光记录，并可能配合基于荧光的单分子成像，以更全面地解析膜重构、通道电导率和通道数量的相关贡献^21,25。

常见的失效模式包括液滴附着不稳定、液滴下陷不完全、双层形成过程中液滴过早合并，以及面积分析中双层边缘光学定义不佳。液滴附着不稳定通常由银球几何形状不规则或琼脂糖涂层不均引起，通过验证球对称性和保持琼脂糖壳体光滑可减少。电极加载还需要将纳米级水滴手工沉积到亚毫米级电极头上，这需要在不同折射率介质（空气与油）之间进行高度的手眼协调和深度感知。因此，移液器尖端可能无意中接触琼脂糖壳体，或在分配过程中错过电极头。增强稳定性的技巧，如手腕支撑、缓慢移液器在油中推进和屏气练习，结合反复练习，可以提升装注熟练度。此外，囊泡不均匀性、温度变化或琼脂糖地形可能导致不完全下陷或延迟单分子层形成，通过增加滴滴沉积后的等待时间^15、20、35可改善。双层形成过程中的聚合通常与过大的接触面积或过激的电刺激（> ±200 mV）有关，可以通过使用更小的初始液滴接触面积来缓解，给予单分子稳定更多时间，并在脉冲^25、35、38前验证低振幅三角波电容响应。

尽管存在这些限制，DIB平台高度可调、可扩展且可重复，14,15,20,21,25,35,38,40，并通过分离脂质力学对传导的贡献，补充了以蛋白质为中心的电生理.通过将集合测量和单通道测量统一到一个系统中，该协议提供了切实可行的途径，分析电功与膜粘弹性如何结合，产生突触样的导电行为（STP类、LTP类和LTD样反应），在可控的自下而上模型25,29,30,31,32,33,38.因此，该方法为系统性探索膜中成分依赖的学习规则提供了基础，并用于量化机械力和电力如何将膜蛋白与其宿主双层在时间和空间尺度上耦合 21,22,23,25.综合来看，这些能力使DIB成为将复杂神经生物学行为解构为可处理、可测试生物物理机制的强大框架（10,11,25,38）。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-二叶酸-单-甘油-3-磷胆碱（DPhPC）	Avanti极地脂质	850356P/850356C	购买时可以冻干粉末（P）或氯仿（C） 形式购买;
琼脂糖	西格玛-奥尔德里奇	A9539
琼脂糖（0.5克琼脂糖片）	基准测试	A2501	你可以选择粉末形态或片剂;
安捷伦科技33522A波形发生器	瞄准器	–	你可以使用任何带有BNC线输出的波形发生器
氩气（Ar）	气气	AR UHP300;72-402221259-1	氩压缩;超高纯度
分析平衡	梅特勒·托莱多	型号：MS304S/03	任何具有0.0001克精度的实验室级分析天平
Axopatch 200B 放大器	分子器件	–
BK Precision 4017B 10 MHz DDs 扫描/函数发生器	Digi-Key（数字钥匙）	BK4017B-ND
硼硅玻璃毛细管	世界精密仪器	1B100F-4
Clampex pCLAMP 11 软件套件	分子器件	–
DigiData 1550B 系统	分子器件	–	这包括一个迷你挤出机、2个注射器、100个PC膜、100个滤芯支架和1个加热块
十烷，99%	西格玛-奥尔德里奇	112-40-3
挤出机套装带夹持/加热块等;	Avanti极地脂质	610000
斐济软件	图片J	–
冷冻室（-80度;C)	费舍尔科学	等温;型号：8964;质量号：828278-21
玻璃器皿	VWR国际	–
Gramicidin-A	米利波尔西格玛	368020
六角石，99%	西格玛-奥尔德里奇	544-76-3
Hum Bug 噪声消除器（60Hz）	A-M系统	726300
倒置显微镜系统（尼康Ti2-A）	尼康	–	任何倒置显微镜或立式显微镜均可使用。
异丙醇	VWR国际	BDH1133-4LP
微电极持有器	世界精密仪器	MEH1
微操纵器	萨特乐器	MP-285	也可以使用手动操作器
显微镜相机	奥林匹斯	DP74
Microsoft Excel	Microsoft	–
MOPS	西格玛-奥尔德里奇	M1254
NIS-Elements 显微镜相机软件	尼康	–	可以使用具备实时画面和/或视频功能的相机捕捉软件。实时画面和同时屏幕录制可以用来替代视频录制。nbsp;
Parafilm M 多功能实验室胶片	副胶片	PM999
培养皿	-	-	天线底部必须透明，理想情况下侧壁也要透明
氯化钾（KCl）	西格玛-奥尔德里奇	P3911
无粉软丁腈检查手套及nbsp;	VWR国际	CA89-38-272
冷藏器（4 & deg;C)	费舍尔科学	货号：97-938-1;型号：3556FS
银线	好家伙	147-346-94
搅拌热板	热力科学	SP131325