从Xenopus早期胚胎中分离单个细胞并按大小分选

摘要

我们描述了一种从Xenopus laevis早期胚胎中分离单个细胞并根据细胞大小进行分选的方法。

摘要

早期胚胎发育需要细胞尺寸呈指数级减小，而胚胎在发育的最初阶段总体大小保持不变。细胞尺寸影响胚胎发育的功能重要性及其作用机制目前仍缺乏深入研究。Xenopus 早期胚胎 为解决这些关键问题提供了独特的研究体系。与其他模式生物相比，Xenopus 早期胚胎体积极大，在中囊胚转换时期的整个胚胎中存在明显的细胞尺寸梯度，从动物极的较小细胞到植物极的较大细胞均有分布。本文介绍了一种从 Xenopus 早期胚胎中分离单个细胞，并利用不同孔径的细胞筛网按尺寸进行分选的实验方案。通过成像和尺寸测量结果确认，分选后的细胞尺寸处于预期范围内，可用于活细胞分析或测序，也可固定后用于成像研究。该体系将有助于揭示早期发育过程中依赖于细胞尺寸的调控机制。

引言

细胞大小的变化是早期胚胎发育的常见特征，在受精卵经历多轮卵裂并产生越来越多的细胞时尤为明显。尽管关于细胞大小作为调控细胞功能主要参数的作用已有较多研究^1,2,3，但细胞大小如何影响早期发育仍知之甚少。近年来在多种模式胚胎系统中的研究表明，细胞大小可调控合子基因组激活（ZGA）⁴ 和细胞命运决定⁵，提示细胞大小在发育决策中具有重要作用^6,7。

Xenopus 早期胚胎是研究细胞大小调控发育决策的重要模型。由于 Xenopus 早期胚胎体积较大（直径约 1.2 mm），易于通过物理手段操控其大小，因此适用于评估细胞大小变化的直接后果。例如，可通过毛发环收缩单细胞胚胎产生不同大小的微型胚胎^4,8，从而证明 ZGA 具有剂量依赖性⁴。此外，Xenopus 早期胚胎沿动-植物极轴存在细胞大小梯度，动物极的细胞最小，植物极的细胞最大，体积差异超过 100 倍⁴。重要的是，通过对整体胚胎单个细胞中新生成的转录本进行直接可视化和定量分析，我们鉴定出一个调控 ZGA 的细胞大小阈值⁴。进一步地，从 Xenopus 早期胚胎中分离单细胞并按大小分选，也证实了该细胞大小阈值对 ZGA 的重要性⁴。

在此，我们描述了从单个细胞中分离的详细步骤 Xenopus laevis 早期胚胎并按大小进行分选。 非洲爪蟾 早期胚胎可通过在含Ca的溶液中孵育而解离为单个细胞²⁺，Mg²⁺无血清培养基（CMFM）⁹，这些单细胞可使用不同孔径的细胞筛进一步分选。分选后的细胞可进行纯化，并用于多种应用，包括活细胞分析、测序或成像检测。

方案

本文所述动物实验已获得南卡罗来纳大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 溶液配制

注意：在开始实验方案之前，准备好以下溶液。

1. 配制 20× MMR：混合 100 mM HEPES、2 mM EDTA、2 M NaCl、40 mM KCl、20 mM MgCl₂₂，以及 40 mM CaCl₂用 NaOH 调节 pH 至 7.8。高压灭菌后室温保存。
2. 制备 Ca²⁺，Mg²⁺无血清培养基（CMFM）：混合 50.3 mM NaCl、0.7 mM KCl、9.2 mM Na₂HPO₄，0.9 mM KH₂PO₄，2.4 mM NaHCO₃₃，以及 1.0 mM EDTA。必要时调节 pH 至 7.4。高压灭菌后室温保存。
3. 在60 mm培养皿中制备1.5%琼脂糖凝胶：将0.75 g琼脂糖加入50 mL CMFM中，用微波炉加热至完全溶解。取5–10 mL琼脂糖溶液倒入60 mm培养皿，均匀覆盖形成薄层。
4. 配制15%密度梯度介质（wt/vol）/CMFM：将15 g密度梯度介质缓慢加入100 mL CMFM中。为促进溶解，置于加热板上加热并搅拌，直至密度梯度介质完全溶解。溶液于4 °C保存，待用。
5. 配制 4% PFA/1× MEM：取 1 瓶（10 mL）16% 多聚甲醛储备液与 4 mL 10× MEM（1000 mM MOPS，pH 7.4，20 mM EGTA 和 10 mM MgSO₄）混合₄加入超纯水至40 mL。
   注意：为了获得 非洲爪蟾 胚胎，遵循标准方案进行 体外 体外受精（IVF）（例如，参见 Sive 等，2007）¹⁰胚胎应置于预冷的0.1× MMR溶液中备用。

2. 将早期胚胎解离为单个细胞

1. 向一个涂有1.5%琼脂糖凝胶的新60 mm培养皿中加入约15 mL CMFM。使用塑料移液管将10–100个胚胎（根据实验需求）转移至培养皿中。将培养皿置于体视显微镜下。
2. 用双手各持一把镊子，小心去除卵黄膜：用一把镊子夹住胚胎表面的卵黄膜，另一把镊子将其轻轻剥离。操作过程中避免损伤胚胎。
3. 将去卵黄膜的胚胎在CMFM中于室温孵育约1小时。每5分钟轻轻摇动培养皿一次，以促进细胞解离。定期观察，直至不再见到成堆的卵裂球（图1）。

3. 按细胞大小对解离后的细胞进行分选

1. 进行卵裂球解离时，将细胞筛（40 µm、70 µm 和 100 µm）分别浸入盛有 CMFM 的培养皿中（图2）。按照图示从左到右的顺序放置培养皿。在每组之间再额外放置两个盛有 CMFM 的培养皿，用于每次分选过程中对细胞筛进行短暂清洗。
2. 轻轻晃动含有分离后单个卵裂球的培养皿，使其富集于皿中央。小心地将卵裂球转移至盛有 CMFM 的 40 µm 筛中。
3. 轻轻振荡筛子数次，使直径 < 40 µm 的卵裂球通过筛孔。随后迅速将 40 µm 筛转移至盛有 CMFM 的培养皿中进行短暂清洗。小心地将保留在 40 µm 筛上、直径 > 40 µm 的卵裂球转移至 70 µm 筛中。
4. 重复上述步骤，直至卵裂球被分选至 100 µm 筛中。
5. 轻轻晃动每个含有已分选卵裂球的培养皿，使其富集于皿中央。小心地将卵裂球（约 4 mL）转移至流式细胞分选（FACS）管中，加在 0.5 mL 15% 密度梯度介质的液面上方（图3）。避免混合。
6. 静置试管 10 分钟。完整的卵裂球将因重力作用沉降至管底，而破裂卵裂球释放出的卵黄颗粒则与之分离（图3）。
7. 根据后续实验目的，可进行活细胞分析，或将卵裂球在液氮中冷冻保存用于 RNA 相关实验，或对卵裂球进行固定以用于免疫染色（图3）。

结果

Xenopus laevis 胚胎（n = 50）在 9 期阶段按照本方案在 CMFM 培养基中孵育，以解离为单个卵裂球（见图 1中的示例）。解离后的单个卵裂球依次通过 40 µm、70 µm 和 100 µm 的细胞筛进行分选，具体操作如上所述。未分选的对照混合物和分选后的单个卵裂球用 4% 多聚甲醛固定，并在明场显微镜下成像（图 4A）。如图 4B、C所示，与包含多种尺寸的未分选对照卵裂球相比，分选后的卵裂球尺寸分布范围较窄，且落在各自预期的尺寸范围内：< 40 µm 组为 33 ± 5.3 µm；40–70 µm 组为 55 ± 11 µm；> 70 µm 组为 91 ± 17 µm（图 4），表明根据细胞大小实现了有效的分选。这些按尺寸分选的细胞可用于进一步分析，例如验证早期胚胎发生过程中依赖于细胞大小的合子基因组激活

讨论

细胞大小对细胞功能具有根本性的重要意义³，其对早期发育的影响需要在模式胚胎系统中进行更深入的探究。本文详细描述了从Xenopus laevis早期胚胎中分离单个细胞，并利用细胞筛网按大小对细胞进行分选的方法，该方法可能适用于细胞大小相关研究。本方法使我们能够提供在早期胚胎发生过程中由细胞大小调控合子基因激活的直接证据⁴。

该实验方案的成功依赖于几个关键步骤。由于非洲爪蟾（Xenopus）早期胚胎中存在细胞大小的梯度轴——从动物极到植物极，细胞由小逐渐变大⁴，因此不同大小的细胞所占比例差异显著；即胚胎中较大细胞的数量远少于较小的细胞。此外，在细胞解离和分选过程中，大细胞会继续分裂，且比小细胞更容易破裂。因此，估算进行卵裂球解离所需的胚胎数量非常重要；如果实验需要特定数量的细胞，尤其是大细胞，则应增加胚胎数量，以获得足够数量的大卵裂球。

CMFM孵育的时...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16% 多聚甲醛（PFA）	EMS	15710-S	用于配制固定液
60 mm 一次性培养皿	VWR	25384-092	用于胚胎孵育
ACCU-SCOPE 3075 变倍体视显微镜	VWR	470351-130	用于观察胚胎
琼脂糖	Sigma-Aldrich	A-9414	用于包被培养皿
细胞筛，100 µm	VWR	76327-102	用于按细胞大小进行分选
细胞筛，40 µm	VWR	76327-098	用于按细胞大小进行分选
细胞筛，70 µm	VWR	76327-100	用于按细胞大小进行分选
一次性移液管	VWR	414004-035	用于转移胚胎
Dumont 镊子，5 型	Electron Microscopy Sciences	72701-D	用于去除卵黄膜
玻璃培养皿，60 × 15 mm	VWR	75845-542	用于胚胎孵育