本研究评估血清基质金属蛋白酶-12（MMP-12）和肿瘤钙黏蛋白-13（CDH13）作为肺癌的互补生物标志物。这些标志物与分子亚型、治疗反应及生存率相关，支持其在肺癌亚型分类、治疗分层和预后评估中的潜在应用。
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本研究评估血清基质金属蛋白酶-12（MMP-12）和肿瘤钙黏蛋白-13（CDH13）作为肺癌的互补生物标志物。这些标志物与分子亚型、治疗反应及生存率相关，支持其在肺癌亚型分类、治疗分层和预后评估中的潜在应用。
肺癌仍然是全球癌症相关死亡的主要原因，这在很大程度上归因于其生物学异质性、频繁的晚期诊断以及全面分子检测的局限性。单一生物标志物通常不足以指导临床决策，凸显了对能够整合全身和肿瘤特异性生物学信息的互补性且临床可行的指标的需求。在这项单中心队列研究中，共纳入262例肺癌患者。采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血清基质金属蛋白酶-12（MMP-12）水平，并通过免疫组织化学（IHC）结合经验证的免疫反应评分（IRS）评估肿瘤中钙黏蛋白-13（CDH13）的表达。分子亚型信息来自常规临床检测，使用多变量逻辑回归和Cox回归模型评估其与治疗反应及生存结局的关联。MMP-12与CDH13在不同分子亚型中的分布呈相反趋势（P < 0.001），表皮生长因子受体（EGFR）/间变性淋巴瘤激酶（ALK）改变的肿瘤表现为较低的MMP-12和较高的CDH13，而KRAS突变型及野生型肿瘤则呈现相反模式。程序性死亡配体1（PD-L1）表达水平较高始终与MMP-12升高和CDH13降低相关（所有P < 0.05）。MMP-12水平升高独立地与较低的客观缓解率（ORR）（校正后比值比[OR] = 0.662，P < 0.001）以及较差的生存结局相关（无进展生存期[PFS]风险比[HR] = 1.382；总生存期[OS] HR = 1.421；两者P < 0.001）；而CDH13水平较高则预测更好的治疗反应（校正后OR = 1.201，P < 0.001）和更优的生存结局（PFS HR = 0.884；OS HR = 0.862；两者P < 0.001）。联合的高MMP-12/低CDH13特征可识别出预后显著更差的一组患者（PFS HR = 2.281；OS HR = 2.506；P < 0.001）。这些发现表明，血清MMP-12和肿瘤CDH13可能作为肺癌分子分型、治疗分层和预后评估的互补性生物标志物。
肺癌仍然是全球主要的健康负担，2022年全球新发病例近250万例，死亡病例约180万例1。尽管在筛查、影像学和系统性治疗方面取得了显著进展，但由于肺癌具有高度的生物学异质性，且常在晚期才被诊断，许多患者的生存期仍然有限2,3,4,5。因此，精准肿瘤学已成为当代肺癌诊疗的核心，尤其是在非小细胞肺癌（NSCLC）中，可靶向的驱动基因变异定义了具有不同自然病程和治疗敏感性的分子亚型6。临床实践指南推荐对晚期疾病进行广泛的分子谱检测，包括EGFR、ALK、KRAS、ROS1、BRAF、MET外显子14跳跃突变、RET、ERBB2（HER2）以及NTRK融合，同时评估PD-L1等免疫生物标志物7,8,9,10。这些进展已显著改善了特定人群的预后，但也带来了新的临床瓶颈。组织样本可能不足以完成全面检测，检测周转时间可能延迟治疗决策，且不同医疗系统中高质量二代测序的可及性存在差异7,9。即使分子检测可用，基于生物标志物的治疗仍不完善，因为分子状态无法完全反映影响治疗反应和耐药性的肿瘤微环境状态。PD-L1表达被广泛使用，但作为单一预测因子存在公认的局限性，而肿瘤突变负荷在最佳应用方面存在较大变异性和不确定性6,9,10。这些现实突显了对可扩展、具有生物学信息价值的补充性生物标志物的实际需求，以便在基因组信息不完整、延迟或模糊时，能够增强分子分型和治疗分层能力。
细胞外基质及肿瘤微环境的蛋白水解重塑是近年来日益受到重视的生物学维度之一，既被视为恶性肿瘤的标志性特征，也被认为是决定治疗反应的关键因素。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）调控肿瘤侵袭、血管生成、免疫细胞迁移以及细胞因子信号传导，从而将肿瘤内在的生物学程序与宿主的炎症及基质环境相联系11。在这些酶中，基质金属蛋白酶-12（matrix metalloproteinase-12, MMP-12），又称巨噬细胞弹性蛋白酶，在肺癌研究中受到广泛关注，因其在多种人类肺癌组织中均有表达，且似乎与侵袭性表型及较差的临床预后相关12。除组织表达外，MMP-12可在循环系统中检测到，使其成为一种具有潜力的微创生物标志物，适用于多次动态监测13。近期的多癌种分析进一步支持了MMP-12在肺腺癌中的临床相关性，提示其可能具有预测和预后价值，值得在具有临床可操作性的亚组中进行深入探索14。重要的是，循环生物标志物正越来越多地用于补充基于组织的检测，在肿瘤学中，人们日益关注那些不仅反映肿瘤负荷，还能体现影响全身治疗敏感性的免疫和基质动态变化的血液指标15。在肺癌中，免疫治疗和靶向治疗常被采用，能够反映肿瘤微环境的生物标志物可能对于理解治疗反应异质性、早期耐药机制以及联合治疗策略的需求尤为有价值16。上述生物学与临床背景促使我们对血清MMP-12进行更深入的评估，不再局限于其诊断意义，而是将其作为与分子亚型及治疗轨迹相关联的候选标志物加以研究。
与此同时，钙黏蛋白13（CDH13），也被称为T钙黏蛋白或H钙黏蛋白，代表了一条在机制上独特的信号通路，与肿瘤分化、黏附信号传导以及上皮可塑性密切相关。CDH13是一种非典型的钙黏蛋白，通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）基团锚定于细胞膜上，已被广泛报道在多种恶性肿瘤中发挥抑癌基因的作用17。在非小细胞肺癌（NSCLC）中，CDH13因启动子区域高甲基化导致的表观遗传沉默已被多次报道，并与肿瘤进展及不良的临床病理特征相关18,19。荟萃分析与整合研究证据进一步表明，CDH13的高甲基化在NSCLC中的发生频率高于正常肺组织，可能具有诊断价值20,21。除了作为恶性转化标志物的潜在价值外，CDH13的状态还可能与治疗敏感性相关。实验研究已将CDH13启动子甲基化及其表达改变与肺癌模型中顺铂耐药表型联系起来，提示CDH13可能反映了与治疗反应及肿瘤在治疗压力下适应性相关的生物学过程22。这些数据共同确立了CDH13作为一种基于组织的生物标志物，可能在风险生物学和治疗分层中具有重要意义。与复杂的多组学检测不同，CDH13可通过常规病理工作流程中的免疫组织化学方法进行检测，若其能提供超越现有临床和分子标志物的附加信息，则具备实际转化应用的潜力。
综上所述，MMP-12 和 CDH13 代表了互补的生物学区室和机制。MMP-12 是一种循环标志物，可能反映免疫和基质激活以及蛋白酶驱动的组织重塑过程；而 CDH13 是一种组织水平的标志物，反映了肿瘤抑制性黏附功能及表观遗传调控。我们假设，整合这两个维度可在定义肺癌精准肿瘤学的两个关键领域中提升临床推断能力。首先，联合血清与组织生物标志物的分析框架可能为分子亚型分类提供互补信息，这种信息既可通过与可靶向的驱动基因变异及免疫生物标志物状态相关联来实现，也可在基因组检测受限时，通过识别与特定分子类别相关的生物学一致的表型来实现2,6,8,10。其次，整合性标志物可能通过改善风险分层，并在靶向治疗和免疫治疗模式下与治疗选择及疗效结果相关联，从而指导个体化治疗；在这些治疗模式中，耐药机制具有多因素性，单一标志物往往不足以指导决策9,10,23。在此背景下，我们的方法具有明确的实用性导向。该策略并非取代分子诊断，而是旨在通过提供可扩展、与临床实践兼容且能快速获取的检测指标，来补充现有诊断手段，并可与基因型、PD-L1 表达水平及临床分期共同解读。这一策略在真实世界临床环境中可能尤为有用，例如当组织样本稀缺、重复活检不切实际，或临床关注的问题不仅仅是某个驱动基因是否存在，而是如何预测个体患者对治疗的敏感性及疾病进展风险时。
因此，在本项队列研究中，我们评估了血清MMP-12和肿瘤CDH13在肺癌分子亚型及治疗路径中的临床意义。具体而言，我们探讨这些生物标志物单独或联合使用时是否与主要的分子分类和治疗分组相关，并评估其是否能够提供与个体化管理相关的预后信息。我们还将本研究置于更广泛的替代方法生态系统中进行定位，包括循环肿瘤DNA、甲基化谱分析以及整合临床、影像和分子特征的多模态建模24,25。本研究的创新之处不在于提出新的单一生物标志物，而在于有意将循环蛋白酶信号与基于组织的黏附分子及表观遗传标志物相结合，以解决一个具有临床可操作性的问题：如何利用在常规临床实践中可行的检测手段，来补充分子分型和治疗个体化。通过捕捉系统性肿瘤-宿主相互作用与肿瘤内在生物学特征的互补维度，这一整合框架超越了以往仅单独评估MMP-12或CDH13的研究。该策略可能在诊断病理学与精准治疗之间架起一座实用的桥梁，在优先安排分子检测、解释生物标志物结果不一致以及优化基于个体风险的治疗规划方面具有潜在应用价值。
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所有操作均符合机构和国家规定，并经邢台市人民医院伦理委员会批准（编号：2024-124）。由于使用的是常规收集的临床数据和剩余样本，因此豁免了书面知情同意的要求。所有数据在分析前均已匿名化处理。
研究设计、实施地点及总体示意图
本研究为一项单中心观察性队列研究，旨在评估血清MMP-12和肿瘤CDH13在肺癌分子分型及个体化治疗中的临床意义，分别及其联合应用的价值。研究在邢台市人民医院开展。纳入2021年1月至2022年6月期间收治的符合条件的患者，共连续入组262例符合预先设定的纳入和排除标准的患者。
整体研究流程如图1所示。该示意图展示了从患者识别到分析的完整过程，包括患者筛选与入组、基于常规临床检测获得的基线临床病理学特征和分子谱分析、治疗前血清的采集与处理、用于CDH13免疫组织化学的肿瘤组织制备、血清MMP-12的定量检测、CDH13免疫反应评分、一线治疗的分类及后续治疗路径，以及包括治疗反应、无进展生存期和总生存期在内的纵向结局评估。该示意图区分了诊断与分子分型分析和治疗与结局分析，并标明了生物样本采集、分子检测结果生成、治疗启动以及随访评估的时间点。
受试者筛选、入组标准及临床数据提取
在预设的入组时间段（2021年1月到2022年6月）内，通过医院信息系统和病理登记系统识别潜在符合条件的患者。通过组织病理学检查确诊原发性肺癌，必要时辅以多学科临床评审。连续入组所有符合全部入组标准的成年患者。纳入标准包括：经组织学确诊的原发性肺癌；在启动任何抗肿瘤治疗前（对于接受初始手术切除的患者，须在手术前）采集的治疗前血清样本可获取；具有足够用于CDH13免疫组织化学检测的肿瘤组织；以及在常规临床诊疗过程中已生成的分子亚型信息。排除标准包括：入组前有明确记录的其他恶性肿瘤病史；血清样本体积不足或样本完整性受损；缺乏可用于CDH13评估的可评价肿瘤组织；以及在基线血液采集前已接受过系统性抗癌治疗的患者。
临床病理学和治疗数据采用标准化病例报告表，从电子病历中提取，该报告表包含预定义的变量定义和编码规则。记录的变量包括人口学特征（年龄和性别）、吸烟暴露、美国东部肿瘤协作组（ECOG）体能状态评分、合并症、基线影像学发现、组织学亚型、肿瘤-淋巴结-转移（TNM）分期（依据研究期间常规临床实践中使用的分期系统）、基线实验室参数以及详细的治疗信息（包括一线治疗方案、开始日期、剂量调整和治疗转换）。吸烟暴露以“包年”为单位进行量化，计算方法如下：包年 =（每日吸烟支数 ÷ 20）× 吸烟年数。当吸烟史在不同记录中不完整或不一致时，吸烟变量被归类为“未知”，并在数据提取日志中注明为差异来源；缺失数据的处理依据预先制定的统计分析计划进行。
标本采集、处理与保存
在开始任何抗肿瘤治疗之前，于基线时采集外周静脉血。血清通过在室温下以1,500 × g离心10分钟分离。将血清上清液转移至低吸附性冻存管中，避免扰动细胞层。为尽量减少冻融循环，将血清分装为200–500 µL每份，分装后样品储存于−80 °C，直至进行批量分析。记录每份标本从采血到冷冻的时间间隔，采集至冷冻时间超过2小时的样本予以排除。
在样本处理过程中，通过记录溶血和脂血情况来实施预先规定的分析前质量控制程序。 visibly hemolyzed specimens 在ELISA定量分析中被排除。血清分装样本在检测前立即置于冰上解冻，轻轻翻转混匀，必要时在2,000 × g 离心5分钟以去除颗粒物。避免剧烈震荡和涡旋，以防在吸光度检测过程中产生气泡和光学干扰。
肿瘤组织的获取与制备
通过常规诊断操作（活检、支气管镜检查、穿刺活检或手术切除）获取肿瘤组织。根据标准病理学操作，将组织置于中性缓冲福尔马林中固定，并包埋于石蜡中。在带电荷的载玻片上制备3–4 µm厚的切片，用于免疫组织化学染色。未染色的切片保存在室温干燥环境中，并在预先规定的时限内进行染色，以尽量减少抗原降解。建立样本追踪记录，将标本标识符与去标识化的研究编码相关联。进行CDH13评分的病理学家对血清MMP-12水平、分子亚型、治疗方案及临床结局保持盲法。
通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）定量血清 MMP-12
在任何抗肿瘤治疗开始前采集外周静脉血，最好在活检或治疗启动前7天内采集。使用商用的人MMP-12 ELISA试剂盒检测血清MMP-12水平。每份血清样品在冰上解冻一次，轻轻混匀，并根据试剂盒说明书进行双复孔检测。每次实验使用提供的重组标准品进行系列稀释，在每块板上建立标准曲线，并用酶标仪在450 nm波长下读取吸光度，同时进行参考波长校正。通过拟合四参数逻辑回归标准曲线计算浓度。为确保分析的稳健性，每块板均包含内部质控（QC）血清，以监测板内和板间精密度（变异系数目标值与试剂盒验证结果一致）。若检测结果低于定量下限，则在统计分析中赋值为该下限的一半；若结果超过定量上限，则在适当稀释后重新检测。为尽量减少批间差异，样本在各板间随机分配，且每块板均包含相同的一组质控血清，以追踪板间变异。执行ELISA的实验人员对临床分组和结局保持盲法。
肿瘤 CDH13 免疫组织化学及免疫反应评分
采用经验证的抗 CDH13 一抗，对福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤切片进行 CDH13 免疫组织化学染色。使用基于聚合物的检测系统检测抗原-抗体复合物，并以 3,3′-二氨基联苯胺（DAB）显色。所有研究样本均采用相同的染色流程；切片分批处理，并包含适当的对照。
将石蜡包埋组织切片至3–4 µm厚度，用二甲苯脱蜡，并通过梯度乙醇逐步水化至蒸馏水中。在柠檬酸盐缓冲液（10 mM，pH 6.0）中，采用微波炉于95–100 °C进行热诱导抗原修复15分钟，随后室温冷却20分钟。室温下用3%过氧化氢孵育10分钟以封闭内源性过氧化物酶活性，再用正常血清封闭液于室温孵育20分钟进行蛋白封闭。切片在4 °C下与抗CDH13一抗抗体孵育过夜。洗涤后，室温下加入基于聚合物的二抗检测试剂孵育20–30分钟，随后在显微镜监控下用3,3′-DAB显色剂显色3–5分钟。切片经苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，最后用永久性封片剂封片。
每次染色过程均包含内部质控。已知CDH13阳性组织切片作为阳性对照平行处理，阴性对照则省略一抗。只有当阳性对照显示出预期的染色模式且强度适当，同时阴性对照无特异性染色时，该次染色结果方可被接受。若染色背景过高、对照结果不合格，或出现影响结果判读的非特异性信号，则需重新进行染色。
CDH13 的表达水平通过免疫反应评分（IRS）进行量化，该评分由染色强度和阳性肿瘤细胞比例综合得出。两名经过培训的病理学家在不知晓血清生物标志物检测结果、分子亚型、治疗方案及临床结局的情况下，独立对所有切片进行评分。存在分歧的评分通过多头显微镜联合阅片达成共识，并记录最终裁定的 IRS 值。染色强度分为 0 分（无染色）、1 分（弱染色）、2 分（中等染色）或 3 分（强染色）。阳性肿瘤细胞比例分为 0 分（0%）、1 分（1–10%）、2 分（11–50%）、3 分（51–80%）或 4 分（81–100%）。IRS 计算公式如下：IRS = 染色强度评分 × 阳性细胞比例评分。IRS 取值范围为 0 至 12。根据免疫反应评分中常用的阈值，将 CDH13 低表达定义为 IRS ≤ 3。在后续分析中，IRS 同时作为连续变量和二分类变量使用，包括亚组比较和联合生物标志物建模。研究预先设定从全部病例中随机抽取 30% 的样本，采用加权 kappa 统计量评估观察者间的一致性，并将抽样过程、一致性估计值及裁定决策记录于审计追踪文件中。
分子分型与治疗分类
分子分型信息来源于对诊断性肿瘤组织进行的常规临床检测。检测结果由临床验证过的检测方法在标准诊疗中实施生成，包括基于PCR的靶向检测、靶向下一代测序 panel、免疫组织化学以及荧光原位杂交。对每位患者，均记录检测方法类型、标本来源、标本充分性说明及报告日期。患者根据可操作的驱动基因变异状态进行分类，包括 EGFR 激活突变、ALK 重排、ROS1 重排、KRAS 突变、BRAF 突变、MET 第14号外显子跳跃突变、RET 重排、ERBB2 变异以及 NTRK 融合。若进行了 PD-L1 肿瘤比例评分，则记录该评分，并根据研究期间常规实践中所采用的分层标准对 PD-L1 表达水平进行分类。所有分子分型类别均在分析前预先确定。当报告存在多个可操作变异时，将依据预设的分级分类规则对患者进行归类，该规则优先考虑具有明确基因型导向治疗意义的变异，其优先顺序如下：EGFR 突变、ALK 重排、ROS1 重排、BRAF 突变、MET 第14号外显子跳跃突变、RET 重排、ERBB2 变异、NTRK 融合和 KRAS 突变。
从医疗记录中提取治疗信息，包括一线治疗方案、起止日期以及后续治疗线数。初始治疗被分为预先定义的互斥治疗类别：基于基因型的靶向治疗、基于免疫检查点抑制剂的治疗、基于化疗的治疗，以及根据情况结合手术与围手术期全身治疗的多模式治疗。索引日期定义为一线全身治疗的开始日期；对于接受初始手术切除的患者，索引日期为手术日期，后续的全身治疗则根据临床记录归类为辅助治疗。在针对个体化治疗的分析中，患者根据分子亚型与治疗类别进行联合分层，并比较驱动基因阳性与驱动基因阴性疾病之间，以及靶向治疗组与免疫检查点抑制剂治疗组之间的血清MMP-12浓度和肿瘤CDH13表达水平。
结局定义与随访
索引日期定义为开始一线抗肿瘤治疗的日期。对于接受初始手术切除治疗的患者，索引日期定义为手术日期；后续的全身治疗则根据病历记录分类为辅助治疗或姑息治疗。每位患者的随访从索引日期开始，直至死亡、最后一次确认联系的日期或行政删失日期，以先发生者为准。随访时长以月为单位记录，对于每个终点事件，均保留事件指示符及相应的事件发生日期或删失日期。结局通过系统性提取电子病历信息确定，包括影像学报告、肿瘤科门诊记录、住院记录，必要时还包括电话随访。采用预先设定的病例报告表，并应用统一的信息来源层级规则。当不同记录之间的日期或分类存在差异时，优先依据同期的影像学报告和治疗决策记录进行争议裁决，并记录最终裁定结果及其支持性来源。维护一份随访日志，记录影像检查日期、治疗转换、住院情况及联系尝试，以尽量减少失访并确保可追溯性。
根据RECIST 1.1版标准，对具有可测量病灶的患者评估肿瘤反应。最佳总体疗效分为完全缓解、部分缓解、疾病稳定或疾病进展。客观缓解率定义为完全缓解或部分缓解，疾病控制率定义为完全缓解、部分缓解或疾病稳定。疗效和进展时间根据最早记录的证据确定。
无进展生存期（PFS）定义为从索引日期到首次出现疾病进展或任何原因导致死亡的时间间隔，以先发生者为准。进展主要依据RECIST 1.1标准的影像学报告来确定。当临床恶化时无法获得影像学资料，若临床医生记录的进展明确与肿瘤负荷加重相关，并促使抗肿瘤治疗方案的改变，则该记录可被接受为进展依据。对于在最后一次客观评估日期时尚未发生事件的患者，以删失处理，并确认其无疾病进展。若在无明确进展记录的情况下启动了新的系统性治疗，则需复查影像资料，并提供同期的临床记录。若仍无法确认进展，则患者在治疗变更前的最后一次影像学评估时间点被删失，并记录所应用的判定规则。
总生存期（OS）定义为从索引日期至因任何原因死亡的时间间隔。患者的生存状态通过医院记录和门诊随访记录确定，并在必要时辅以结构化电话确认。死亡日期以病历中记录的日期为准；若病历中无记录，则以随访联系时家属确认的日期为准，相关证明文件记录于随访日志中。在最后一次确认随访时仍存活的患者按删失处理。
实施了与常规诊疗路径相一致的标准化随访流程。在进行主动全身治疗期间，记录每个治疗周期的临床评估，并根据临床方案规定的固定时间间隔记录影像学再评估结果，每次评估均记录影像学检查方式及日期。在完成一线治疗后或术后监测期间，根据机构安排的时间表记录随访就诊和影像学评估。当无法完成面对面随访时，将进行结构化电话随访，以确认治疗是否持续进行，记录期间的住院情况，在适用情况下通过外部影像资料确认疾病状态，并确认患者的生存状态。所有 missed visits（失访）、无法取得联系的尝试以及随访中断的原因均被详细记录。在将患者归类为失访之前，需在不同日期至少再进行两次联系尝试，并记录每次尝试的情况。
生物标志物评估与结局确定在操作上保持分离。进行血清MMP-12检测和CDH13评分的人员对临床结局设盲。在可行的情况下，结局数据提取在不知晓生物标志物结果的前提下进行。对于疾病进展和治疗反应终点，采用两阶段裁定流程。首先由经过培训的数据提取员根据预先规定的原则确定事件分类及日期，随后由高级临床医生独立审核这些判定。如有分歧，则通过共同审阅原始影像学报告、肿瘤科记录和治疗时间线进行解决，并保留所有裁定决策的审计轨迹。
进行了数据一致性检查，以识别不可信的事件序列，包括发生在索引日期之前的事件、无相应评估记录的治疗转换，或缺乏支持性文件的死亡日期。对于被标记的案例，通过返回原始资料进行核对，并在数据集中添加带日期的更正说明，注明修改原因及支持证据，以完成数据校正。
统计学分析
统计学分析使用 SPSS（版本 26.0）和 R（版本 4.3.0）进行。连续变量根据情况以均值 ± 标准差或中位数（四分位间距）表示，分类变量以频数和百分比表示。组间比较根据情况采用参数检验或非参数检验，分类数据采用卡方检验或 Fisher 精确检验。所有检验均为双侧检验，以P < 0.05 为差异具有统计学意义。
协变量根据临床相关性和既往证据预先选定，并在相关模型中采用相同的协变量集，以确保可比性。核心调整变量包括年龄、性别、吸烟暴露、TNM 分期、ECOG 体力状态评分和组织学亚型；当分析目标为治疗人群中分子亚型时，额外对治疗组进行调整。采用方差膨胀因子评估多重共线性，并根据预先规定的变量缩减规则处理存在严重共线性的问题。报告调整后的比值比及其 95% 置信区间和双侧 P 值。多变量逻辑回归和 Cox 回归模型中包含的协变量数量已预先规定，并相对于结局事件数进行限制，以最小化过拟合风险。所有模型的每变量事件数比均保持在可接受范围（≥10）。对于多分类分子亚型结局，采用多项逻辑回归模型，或使用预先规定的参照类别进行一系列二分类逻辑回归比较，建模策略将明确说明。
采用Kaplan–Meier法估计无进展生存期和总生存期，使用对数秩检验比较生存曲线。生物标志物与结局之间的关联通过Cox比例风险回归模型进行量化，报告风险比及其95%置信区间。多变量Cox模型基于预先设定的临床病理协变量（包括分子亚型和治疗类别）构建，以评估其对个体化治疗的意义。通过Schoenfeld残差诊断和对数减对数生存图验证比例风险假设。若某协变量违反比例风险假设，则采用预先设定的方法进行处理，例如对该协变量进行分层或引入时间依赖的交互项，并报告最终模型的设定。
采用预先规定的策略处理缺失数据。当缺失程度极小时，进行完全病例分析；否则，使用链式方程进行多重插补，并纳入分析模型中的所有变量。生成了10个插补数据集，采用Rubin规则计算合并估计值。对于涉及多个亚型比较或多终点的分析，采用预先规定的程序控制错误发现率，或将分析明确标注为探索性分析，以确保对多重性问题的透明性。
在模型拟合之前，分析数据集已被锁定，并维护了一份全面的数据字典，其中定义了每个变量、单位、编码方案及允许的取值范围。在检测板中包含了重复的质量控制样本，以量化板间变异并监测信号漂移。对于免疫组织化学评分，记录了评分标准、盲法操作流程以及观察者间一致性评估，并保留了分歧病例的裁决日志。针对关键变量（包括索引日期、样本采集日期、治疗开始日期和结局日期）实施了程序化的范围检查和逻辑一致性检查。所有统计分析脚本及版本控制的输出日志均被完整保存，以确保分析流程可完全重复。
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队列构建与分子亚型分布
总体研究流程见图1。共纳入262例连续的肺癌患者，并根据临床上具有重要意义的分子亚型分为四类：EGFR（n = 92）、ALK（n = 48）、KRAS（n = 54）和野生型（n = 68）。各亚型之间的基线临床病理特征存在差异（表1）。携带EGFR和ALK变异的患者平均年龄低于KRAS和野生型组患者（P = 0.006）；而男性性别和吸烟暴露在KRAS和野生型肺癌中明显更为常见（两者均P < 0.001）。晚期（III–IV期）疾病在整体队列中占主导地位，但在KRAS和野生型患者中更为普遍（P = 0.021）。高PD-L1表达（TPS ≥ 50%）在KRAS和野生型肿瘤中也更常见（两组均约半数患者），而EGFR和ALK驱动的肿瘤中则较少见（P < 0.001）。
血清MMP-12和肿瘤CDH13在分子与免疫分层中的分布<...
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本研究评估了血清MMP-12与肿瘤CDH13作为整合生物标志物在支持肺癌分子亚型临床解读及治疗分层中的互补作用。该核心假设源于这两种生物标志物的生物学功能互补性：MMP-12是一种循环蛋白酶，反映免疫-间质重塑和肿瘤侵袭性；CDH13则是一种组织源性肿瘤抑制因子，与表观遗传调控和上皮可塑性相关26,27,28,29,30。通过整合系统性与局部肿瘤生物学信息，我们旨在解决精准肿瘤学中若干尚未满足的关键需求，包括组织样本稀缺、分子检测结果延迟以及单一生物标志物预测能力不足等问题，同时提供可扩展且符合临床应用的检测方法，以补充现有的基因组和免疫标志物（如EGFR、ALK和PD-L1）。该策略符合当前日益形成的共识，即需要多维度生物标志物组合来全面捕捉肿瘤内在因素与微环境因素之间的复杂相互作用，从而影响治疗反应和临床结局。...
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作者声明不存在利益冲突。
我们衷心感谢邢台市人民医院的医护人员在患者招募、临床数据收集和生物样本处理方面所提供的支持。本研究由邢台市重点研发计划项目（编号：2024ZC116）资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗体，抗CDH13（T-钙黏蛋白） | Abcam，英国剑桥 | ab15126 | 免疫组织化学一抗；已验证适用于石蜡包埋组织 |
| 高速冷冻离心机 | Eppendorf，德国汉堡 | 5424 R | 用于血清分离和样品澄清 |
| DAB底物试剂盒 | 中杉金桥，中国北京 | ZLI-9017 | 用于免疫组织化学的显色检测 |
| ELISA酶标仪 | BioTek Instruments，美国维努斯基 | ELx800 | 用于在450 nm波长下读取吸光度，并进行参比校正 |
| 中性缓冲福尔马林（10%） | 国药集团化学试剂有限公司，中国上海 | 10009218 | 用于活检及手术组织标本的固定 |
| 苏木精-伊红染色试剂盒 | 索莱宝，中国北京 | G1120 | 用于免疫组织化学切片的复染及质量控制 |
| 人MMP-12 ELISA试剂盒 | Abcam，英国剑桥 | ab246533 | 用于血清基质金属蛋白酶-12的定量检测 |
| 明场显微镜 | 尼康，日本东京 | Eclipse E200 | 用于CDH13免疫染色结果的评估与评分 |
| 切片机 | 徕卡生物系统，德国韦茨拉尔 | RM2235 | 用于对石蜡包埋组织进行3–4 µm厚度切片 |
| 封片介质 | 索莱宝，中国北京 | S2100 | 用于免疫组织化学染色后切片的永久封片 |
| 石蜡包埋工作站 | 徕卡生物系统，德国韦茨拉尔 | EG1150 | 用于石蜡包埋组织块的制备 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Gibco，赛默飞世尔科技，美国 | 10010023 | 用于免疫组织化学染色过程中的洗涤步骤 |
| 聚合物检测系统 | 迈新生物，中国福州 | DAB-0031 | 免疫组织化学二抗检测试剂盒 |
| R统计软件 | 统计计算基金会，奥地利维也纳 | 版本 4.3.0 | 用于统计分析与建模 |
| 血清分离管 | BD Vacutainer，美国富兰克林湖 | 367988 | 用于外周静脉血采集 |
| SPSS统计软件 | IBM公司，美国阿蒙克 | 版本 26.0 | 用于连续型和分类数据的统计分析 |
| 冻存管 | 康宁公司，美国康宁 | 430488 | 低吸附冻存管，用于血清样本分装 |
| 水浴锅（用于抗原修复） | Grant Instruments，英国剑桥 | JBN26 | 在抗原修复过程中维持恒定温度 |
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