需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

多基因座测序用于弓形虫（Toxoplasma gondii）菌株分型

265 次观看

⸱

DOI：

10.3791/70645

⸱

2026年5月26日

 , 
1Department of Biosciences, Durham University, 2Department of Parasitology, Faculty of Veterinary Medicine, New Valley University

本文内容

摘要

本文介绍一种利用便携式纳米孔测序技术对选定的遗传标记进行快速鉴定和基因分型的方案，可实现对实验室保存的弓形虫（Toxoplasma gondii）菌株进行可扩展的靶向鉴定，并具备未来应用于监测场景的潜力。

摘要

Toxoplasma gondii 是一种在全球范围内分布的顶复门寄生虫，具有显著的遗传多样性，因此需要准确的分子方法来进行菌株区分。本实验方案的目标是建立一个可重复的、针对培养的 T. gondii 分离株进行多位点基因分型的工作流程。该流程包括 I 型（RH）和 II 型（ME49）代表性菌株的 体外 增殖、基因组 DNA 提取、SAG2 和 SAG3 基因的位点特异性扩增，以及基于测序的分析，以检测单核苷酸多态性（SNPs）和插入/缺失（INDEL）事件。测序数据经处理后生成高置信度的共识序列，并进行比对分析，以鉴定菌株特异性的多态性。将该工作流程应用于典型菌株时，表现出高效的比对率、在目标位点间一致的测序深度，以及对预期扩增子大小的准确还原，证实了其在检测位点水平遗传变异方面的可靠性。尽管全面的基因型鉴定需要纳入更多标准化标记，本方案仍为实验室维持的 T. gondii 分离株提供了可扩展且可重复的靶向遗传特征分析框架，并支持一致的多位点序列分析。

引言

Toxoplasma gondii 是一种全球分布的顶复门寄生虫，也是主要的食源性和水源性人畜共患疾病威胁，几乎可以感染所有温血动物，其中猫科动物为其终末宿主1。人类和动物通常通过摄入组织包囊或孢子化卵囊而感染；该寄生虫能够在速殖子和缓殖子阶段之间相互转换，从而长期存在于神经和肌肉组织中，导致肉类传播和环境传播2,3。

尽管三种克隆系（I型、II型和III型）在欧洲和北美占主导地位，但全球范围内已记录到广泛的遗传多样性，特别是在具有丰富野生动物宿主的地区，存在大量非典型和重组株系4。因此，准确的虫株鉴别对于阐明传播动态、调查暴发疫情以及理解区域流行病学至关重要。传统的基因分型方法，如PCR-RFLP、基于Sanger测序的多位点序列分型（MLST）和微卫星分析，已在解析T. gondii种群结构方面发挥了重要作用，但其分辨率、通量以及检测基因型内变异的能力有限。这些方法通常需要进行多个独立的反应，且可能无法检测到多态性位点内的插入、缺失或复杂单倍型1。短读长的高通量测序（NGS）提高了对稀有变异的检出能力，但在识别复杂的结构变异方面仍存在局限性4。

长读长测序平台，尤其是牛津纳米孔技术（Oxford Nanopore Technologies），现已能够生成连续的高精度读段，适用于解析结构变异和高度多态性位点5。其便携性、实时分析能力以及与基于扩增子的工作流程的兼容性，使其成为现场应用和疫情调查中极具前景的工具6。尽管具有这些优势，目前仍缺乏用于常规T. gondii基因分型的标准化多基因座长读长工作流程。

为弥补这一不足，我们建立了一种可扩展的长读长扩增子测序工作流程，靶向两个多态性位点（图1）。结合一致性校正和变异检测分析流程，该方法能够准确检测单核苷酸多态性（SNPs）和插入缺失突变（INDELs），实现菌株水平的区分。本方案适用于具备PCR扩增和长读长测序能力的实验室，并已使用培养分离株进行了验证。尽管该方法可能适用于临床原始样本或环境样本，但此类应用需要进一步优化和验证。总体而言，该工作流程为靶向分子表征提供了系统化的框架，有望支持流行病学调查研究。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本研究使用了已建立的实验室寄生虫菌株和商业获取的人成纤维细胞系。未直接涉及人类或动物受试者。

注意：除非另有说明，本方案中使用的缓冲液和试剂均来自 材料表 中列出的商业试剂盒。

1. 生物标志物选择

  1. 从 ToxoDB（https://toxodb.org/toxo/app）基因组数据库中下载 SAG2 和 SAG3 的 FASTA 格式基因组序列。
  2. 使用 EMBOSS Water（https://www.ebi.ac.uk/jdispatcher/psa/emboss_water）进行成对序列比对。
  3. 选择长度不超过 1,600 个碱基对（bp）的扩增子区域，以缩短测序时间并确保高效的 PCR 扩增。
  4. 确保每个区域包含可用于区分毒株的 informative SNP 或 INDEL 多态性位点。

2. 培养与收获 弓形虫（Toxoplasma gondii） 速殖子

  1. 宿主细胞培养的维持
    1. 从经认证的商业来源获取人包皮成纤维细胞（HFFs），并在完全生长培养基中进行培养，该培养基由添加了10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）组成。
    2. 将细胞培养物置于37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育。
  2. 寄生虫株系的维持与扩增。
    1. 使用速殖子以每个宿主细胞感染1–3个寄生虫的感染复数，感染汇合度为80–90%的成纤维细胞单层。对于含有约1 × 106个成纤维细胞的T25培养瓶，加入1–3 × 106个速殖子。
    2. 每天使用倒置光学显微镜在20×或40×放大倍数下观察培养物。通过观察单层细胞广泛破裂来判断宿主细胞裂解。
      注意：为避免与培养相关的异常现象，成纤维细胞培养物传代次数不应超过20代。
    3. 速殖子的收获。
      1. 当观察到≥90%的宿主细胞发生裂解时，收集培养物。
      2. 在4 °C下以1,300 × g离心10分钟。
      3. 用移液器轻轻将沉淀重悬于10 mL无菌磷酸盐缓冲液中，并在4 °C下再次以1,300 × g离心10分钟。重复此步骤一次。

3. 基因组DNA提取与扩增子生成

  1. 使用基于硅胶柱的基因组DNA纯化试剂盒提取基因组DNA7。用50 µL洗脱缓冲液洗脱DNA。
  2. 使用微量分光光度计测定DNA浓度。
  3. 短期储存将DNA保存在4 °C，长期储存则保存在−20 °C。
  4. 使用高保真DNA聚合酶预混液、位点特异性引物（补充表1）和无核酸酶水配制PCR反应体系。
  5. 在已校准的热循环仪中进行PCR扩增，循环条件如下：(a) 初始变性：98 °C下30秒；(b) 35个循环：98 °C下10秒，位点特异性退火：对于SAG2为60 °C、对于SAG3为68 °C，持续30秒；72 °C延伸20秒；(c) 最终延伸：72 °C下2分钟。
  6. 通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
  7. 根据制造商说明书，使用基于柱子的PCR产物及凝胶回收纯化系统纯化PCR产物8。用15–20 µL洗脱缓冲液洗脱DNA。
    注意：若DNA模板质量差、浓度过低或反应条件不理想，可能导致PCR效率和产量降低。若扩增产物产量较低，应使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA模板完整性，并使用分光光度计检测其浓度和纯度。还应针对所用引物对优化PCR退火温度和引物浓度，并根据需要增加PCR循环次数。

4. 长读长测序文库的制备

  1. 末端修复与dA加尾
    1. 解冻所有试剂，并通过涡旋充分混匀。首次使用时，仅需将DNA对照样品用10.5 µL洗脱缓冲液稀释，并置于冰上保存。
      注意：每次使用前务必彻底涡旋磁珠。
      ​警告：切勿涡旋末端修复酶混合液；应通过移液器轻柔混匀。
    2. 将每种DNA样品各200 fmol（约130 ng，对应1 kb片段）移入0.2 mL PCR管中，并用无核酸酶水调整体积至11.5 µL。
    3. 每管加入1 µL稀释后的DNA对照样品，通过移液混匀10–20次。
    4. 为每个样品配制末端修复主混合液，包含1.75 µL反应缓冲液和0.75 µL酶混合液（含5%过量）。
    5. 向每个样品中加入2.5 µL主混合液，轻柔混匀后短暂离心。
    6. 在热循环仪中于20 °C孵育5分钟，随后在65 °C孵育5分钟。
  2. 末端修复后DNA的纯化
    1. 将15 µL反应液转移至1.5 mL低DNA结合微离心管中。
    2. 加入15 µL重悬的磁珠，轻柔混匀后短暂离心。
    3. 在旋转混合器上室温孵育样品5分钟。
    4. 配制新鲜的80%乙醇用于洗涤。
    5. 将管子置于磁力架上，待磁珠完全沉淀后小心移除上清液。
    6. 用200 µL 80%乙醇洗涤磁珠两次。
      注意：确保磁珠完全沉淀，然后小心移除乙醇。
    7. 将磁珠在空气中干燥约30秒；避免过度干燥以防止开裂。
    8. 用10 µL无核酸酶水重悬磁珠，并在室温下孵育2分钟。
    9. 将管子置于磁力架上，将10 µL洗脱液转移至洁净的低DNA结合微离心管中。
    10. 使用分光光度计对1 µL样品进行DNA浓度测定。
  3. 原生条形码标记
    1. 解冻平末端/TA连接酶主混合液、EDTA、短片段缓冲液（SFB）以及原生条形码（NB01–NB24）。
    2. 为样品1–24分配各自的条形码。
    3. 构建条形码反应体系：7.5 µL末端修复后的DNA、2.5 µL原生条形码和10 µL平末端/TA连接酶主混合液。
    4. 通过移液混匀10–20次，确保充分混合。
    5. 室温孵育20分钟，加入4 µL EDTA终止反应，通过移液充分混匀， 短暂离心。
    6. 将带有条形码的样品合并至一个1.5 mL低DNA结合微离心管中。按总合并样品体积的0.4×加入磁珠（例如，向575 µL合并DNA中加入230 µL磁珠）。通过移液充分混匀，然后在旋转混合器上室温孵育10分钟。
    7. 用700 µL短片段缓冲液（SFB）洗涤磁珠。轻弹管壁使磁珠重悬， 短暂离心，再将管子放回磁力架上，待磁珠沉淀后用移液器移除缓冲液并弃去。
    8. 重复上一步操作。
    9. 短暂离心并将管子放回磁力架上。用移液器移除任何残留缓冲液。
    10. 将管子从磁力架上取下，通过轻弹管壁使沉淀在35 µL无核酸酶水中重悬。
    11. 在37 °C孵育10分钟，期间间歇混匀，然后将洗脱液转移至洁净的低DNA结合微离心管中。
  4. 接头连接与文库纯化
    1. 构建连接反应体系：30 µL合并的条形码DNA、5 µL原生接头、10 µL连接缓冲液（5×）和5 µL T4 DNA连接酶。
    2. 通过轻柔移液充分混匀反应液，短暂离心。在 室温下孵育20分钟。
    3. 向反应液中加入20 µL重悬的磁珠，并通过移液混匀。在 旋转混合器上于 室温孵育10分钟。
    4. 短暂离心 样品并在磁力架上沉淀。保持管子在磁铁上，用移液器移除上清液。
    5. 加入125 µL短片段缓冲液（SFB）洗涤磁珠。轻弹管壁使磁珠重悬， 短暂离心，再将管子放回磁力架上，待磁珠沉淀后用移液器移除上清液并弃去。
    6. 重复上一步操作。
    7. 短暂离心并将管子放回磁铁上。用移液器移除任何残留上清液。将管子从磁力架上取下，通过轻柔轻弹使沉淀在15 µL洗脱缓冲液（EB）中重悬。
    8. 短暂离心 并在37°C孵育10分钟。每2分钟轻弹10秒以促进DNA洗脱。
    9. 将磁珠置于磁力架上沉淀，直至洗脱液澄清无色，至少1分钟。
    10. 将含DNA文库的15 µL洗脱液转移至洁净的1.5 mL低DNA结合微离心管中并保留。
    11. 使用分光光度计对最终文库进行定量。

5. 流通池制备与纳米孔测序

  1. 流动池准备
    1. 检查流动池，并确认活性孔数量 ≥80。
    2. 在微量离心管中将 117 µL 冲洗液与 3 µL 锚定溶液混合，配制引物混合液，总体积为 120 µL。通过移液轻轻混匀，避免引入气泡。缓慢将全部 120 µL 引物混合液加入流动池的引物加样口，确保加样过程中不引入气泡。
  2. 文库加样与测序
    1. 将 15 µL 测序缓冲液（SB）、10 µL 文库磁珠（LIB）和 5 µL DNA 文库混合，配制测序混合液。通过上下移液 3–5 次轻轻混匀，避免产生气泡。最终得到 30 µL 测序混合液，可直接加样；如有需要，也可调整至 45 µL。
    2. 以逐滴方式缓慢将 30–45 µL 测序混合液加入流动池的样品加样口。
      注意： 避免引入气泡，且移液枪头不得接触膜表面。加样完成后应牢固封闭加样口。
    3. 启动测序，启用实时碱基识别，并监测孔道活性。
    4. 持续测序直至每个扩增子达到 ≥500× 覆盖深度（建议 ≥1000×），以确保足够的读长深度，用于准确的碱基识别、可靠的共识序列生成以及低频变异的可信检测。
      说明：若测序覆盖度较低，应确保输入的扩增子质量高且浓度达标、流动池具有足够数量的活性孔，并延长测序时间以达到推荐的覆盖深度。

6. 数据处理与变异分析

  1. 碱基识别与去卷积
    1. 使用平台配套的碱基识别软件，采用默认的高精度设置进行高精度碱基识别，生成每个样本的FASTQ文件。根据条形码对测序读段进行去卷积，并仅保留通过质量控制过滤的读段。
  2. 读段比对与BAM文件处理
    1. 从美国国家生物技术信息中心（NCBI）基因组数据库下载Toxoplasma gondii参考基因组组装序列GCF_000006565.2（TGA4）。提取用于SAG2分析的8号染色体（NC_031476.1）和用于SAG3分析的12号染色体（NC_031480.1）。使用SAMtools对参考序列建立索引，并利用长读段比对索引构建工具生成比对索引。
    2. 使用针对纳米孔测序数据优化的长读段比对算法（例如，设定为长读段比对模式；-ax map-ont）将读段比对至已索引的参考基因组。
    3. 将比对结果转换为BAM格式，使用SAMtools对BAM文件进行排序和索引。使用Picard工具为每个BAM文件添加读段组信息。利用深度统计计算每个位点的平均覆盖度，并使用flagstat指标生成比对统计信息。
  3. 一致性序列生成
    1. 使用基于神经网络的一致性优化算法（默认参数）生成每个扩增子的一致性序列。以FASTA格式导出一致性序列，用于后续分析。
    2. 利用公开可用的基因组数据库进行基于参考序列的比对和比较序列分析。使用基因组可视化软件展示读段比对结果及多态性位点。
  4. 变异检测
    1. 使用基于一致性序列的变异检测算法进行变异识别。利用变异筛选工具分离单核苷酸多态性（SNPs）和插入/缺失事件（INDELs）（补充文件1）。
    2. 应用质量过滤阈值。对于SNP，过滤QD < 2.0、FS > 60.0或MQ < 40.0的变异；对于INDEL，过滤QD < 2.0或FS > 200.0的变异。
    3. 使用标准VCF处理工具压缩并索引过滤后的VCF文件。利用VCF汇总工具生成变异统计信息。
  5. 基因型分配
    1. 从SAG2和SAG3区域提取位点特异性变异，并将多态性谱型与参考菌株序列进行比对，以确定T. gondii的基因型。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

通过针对两个遗传标记 SAG2 和 SAG3 的聚合酶链式反应（PCR），成功扩增了Toxoplasma gondii的基因组DNA（图2）。经纯化后，PCR产物在琼脂糖凝胶电泳中显示出预期大小的清晰条带，分别对应于639 bp（SAG2）和1158 bp（SAG3）。这些条带的清晰度和一致性证实了目标基因片段的成功扩增及其完整性，可用于后续的序列分析。

高通量纳米孔测序在Toxoplasma gondii的RH和ME49株系所检测的各个位点均产生了高质量的数据集（表1）。对于SAG2位点，ME49株系的测序共获得1,499条读长，总计849,707个碱基，平均读长为553.8 bp，平均质量值为Q13.6（碱基准确率为95.6%）。仅有8条读长未能比对，最终获得的共识序列长度为635 bp，与预期基因大小高度一致。同样，RH株系产生了1,005条读长（556,55...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本研究展示了牛津纳米孔长读长测序技术结合靶向多位点方法在Toxoplasma gondii快速且可靠基因分型中的应用价值。通过聚焦于两个特征明确的表面抗原位点SAG2和SAG3，我们通过对RH（I型）和ME49（II型）菌株的比较分析，验证了基于牛津纳米孔技术的多位点测序的可行性，证明了该平台解析菌株特异性遗传变异的能力。

两个位点的PCR扩增均产生了清晰、界限分明的条带，大小符合预期，证实已成功获得高质量的模板DNA，适用于后续基因组分析。随后的纳米孔测序获得了较高的测序深度、良好的比对效率，且一致性序列与预期扩增子长度高度匹配6。这些结果凸显了纳米孔测序在基于扩增子的应用中的可靠性，与先前报道一致9,10，证明其在靶向多位点序列分型（MLST）和病原体基因分型工作流程中具有高准确性11。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

本工作由埃及高等教育部资助 & 科学研究，由埃及文化局代表 & 伦敦教育事务处以及英国研究与创新署医学研究理事会（MR/X502947/1）。图1使用BioRender.com制作

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂糖粉末Thermo Fisher Scientific16500100用于凝胶电泳
Dulbecco’s 修饰 Eagle 培养基 (DMEM)Thermo Fisher Scientific11995065细胞培养基
epi2me-labs/wf-amplicon Nextflow 工作流程 (v1.2.1)Oxford Nanopore Technologies, UKN/A用于处理和分析纳米孔扩增子测序数据的 Nextflow 工作流程；版本 1.2.1 用于 MinION 数据的可重复分析
epi2me-labs/wf-alignment Nextflow 工作流程 (v1.2.3)Oxford Nanopore Technologies, UKN/A用于将纳米孔测序读段比对至参考序列，并使用 IGV 进行集成可视化的工作流程；版本 1.2.3 用于 MinION 数据的可重复分析
纯乙醇Merck Life Science51976-500ML-F用于磁珠纯化
胎牛血清 (FBS)Sigma-AldrichMFCD00132239细胞培养添加剂
流通池清洗试剂盒Oxford Nanopore TechnologiesEXP-WSH004流通池清洗
GeneRuler 1 kb Plus DNA 标准品 (10 kb)Thermo Fisher ScientificSM1331片段大小确认
HFF-1 人包皮成纤维细胞系American Type Culture Collection (ATCC)SCRC-1041从新生儿包皮组织中分离的人皮肤成纤维细胞；用于寄生虫扩增
MinION 流通池 (R10.4.1)Oxford Nanopore TechnologiesFLO-MIN114用于测序的流通池
MinION Mk1B 测序仪Oxford Nanopore Technologies, UKMIN-101B纳米孔测序仪；使用 MinKNOW 软件 (v25.09.16) 进行设备控制和实时碱基识别
MinKNOW 软件Oxford Nanopore Technologies, UKN/A用于 MinION Mk1B 设备控制、实时测序和碱基识别的软件；版本 25.09.16
Native Barcoding Kit 24 V14Oxford Nanopore TechnologiesSQK-NBD114.24用于多重样本的条形码标记
NEB Blunt/TA 连接酶主混合液New England BiolabsM0367DNA 连接
NEBNext 快速连接模块New England BiolabsE6056接头连接
NEBNext 快速连接反应缓冲液 (5×)New England BiolabsB6058用于 DNA 连接
NEBNext Ultra II 末端修复/dA 尾添加模块New England BiolabsE7546文库制备
无核酸酶水Thermo Fisher ScientificR0581分子生物学级别
NucleoSpin 凝胶和 PCR 纯化试剂盒 Macherey-Nagel740609.5PCR 产物纯化
青霉素–链霉素 (1%)Thermo Fisher Scientific (Gibco)15140-122抗生素混合物
磷酸盐缓冲液 (PBS)Thermo Fisher Scientific (Gibco)10010023洗涤缓冲液
Q5 高保真 2× 主混合液New England BiolabsM0492S高精度聚合酶
QIAamp DNA 血液微量试剂盒Qiagen69504DNA 提取
Quick T4 DNA 连接酶New England BiolabsM2200接头连接酶
SYBR Safe DNA 凝胶染料Thermo Fisher ScientificS33102DNA 染色染料
TriTrack DNA 上样染料 (6×)Thermo Fisher ScientificR1161将样品加入凝胶
胰蛋白酶–EDTA (0.25%)Thermo Fisher Scientific (Gibco)25200056用于 HFF 细胞传代
1× TAE 或 1× TBE 缓冲液——电泳运行缓冲液
2× PCR 预混液——PCR 用即用型混合液

参考文献

  1. Uzelac, A., Djurkovic-Djakovic, O. Isolation, genotyping and phenotyping Toxoplasma gondii in Europe - A critical perspective. Food Waterborne Parasitol. 40, e00279(2025).
  2. Yaman, Y., Bay, V., Kişi, Y. E. Discovery of host genetic factors through multi-locus GWAS against toxoplasmosis in sheep: addressing one health perspectives. BMC Veterinary Research. 21 (1), 263(2025).
  3. Khedr, A. A., et al. Exploring the role of chitosan and curcumin-loaded chitosan nanoparticles against chronic Toxoplasma infection in experimental mice. Scientific Reports. 15 (1), 41765(2025).
  4. Joeres, M., et al. Genotyping of European Toxoplasma gondii strains by a new high-resolution next-generation sequencing-based method. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 43 (2), 355-371 (2024).
  5. Gohar, Y., et al. Intra-strain genetic heterogeneity in Toxoplasma gondii ME49: Oxford Nanopore long-read sequencing reveals copy number variation in the ROP8-ROP2A locus. BMC Genomics. 26 (1), 1094(2025).
  6. Koutsogiannis, Z., Denny, P. W. Rapid genotyping of Toxoplasma gondii isolates via Nanopore-based multi-locus sequencing. AMB Express. 14 (1), 68(2024).
  7. DNeasy Blood & Tissue Kit Handbook. , QIAGEN. (2023).
  8. User manual PCR clean-up and Gel extraction. , MACHEREY-NAGEL. (2024).
  9. Karst, S. M., et al. High-accuracy long-read amplicon sequences using unique molecular identifiers with Nanopore or PacBio sequencing. Nature Methods. 18 (2), 165-169 (2021).
  10. Yu, P. -L., et al. Next-generation fungal identification using target enrichment and Nanopore sequencing. BMC Genomics. 24 (1), 581(2023).
  11. Vilares, A., et al. Towards a rapid sequencing-based molecular surveillance and mosaicism investigation of Toxoplasma gondii. Parasitology Research. 119 (2), 587-599 (2020).
  12. Fazaeli, A., Ebrahimzadeh, A. A new perspective on and re-assessment of SAG2 locus as the tool for genetic analysis of Toxoplasma gondii isolates. Parasitology Research. 101 (1), 99-104 (2007).
  13. Targa, L. S., et al. Toxoplasma gondii SAG2, SAG3 and GRA6 alleles and single nucleotide polymorphism in congenital infections with known parasite load and clinical outcome. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 65, e8(2023).
  14. Rico-Torres, C. P., et al. Can cloning and sequencing help to genotype positive Toxoplasma gondii clinical samples? Results and validation using SAG3 as a model. Infect Genet Evol. 101, 105283(2022).
  15. Sanchez, S. G., Besteiro, S. The pathogenicity and virulence of Toxoplasma gondii. Virulence. 12 (1), 3095-3114 (2021).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

基因分型流程基因组DNA提取位点特异性扩增SAG2基因SAG3基因单核苷酸多态性序列比对
多基因座测序用于弓形虫（Toxoplasma gondii）菌株分型
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。