我们介绍一种用于毫流体连续培养装置（MCCD）的实验方案，该装置可在恒定的低营养条件下（低至数百纳摩尔浓度）或在分钟时间尺度上的动态营养波动条件下培养细菌群体。
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本文内容
摘要
摘要
自然界中的微生物生境通常以低浓度的混合营养物质、空间异质性和时间上的波动为特征。然而，传统的实验室培养方法难以模拟这些条件。批量培养无法在低营养环境中维持微生物生长，而恒化器虽然能够利用单一限制性营养物质维持稳态生长，但在需要维持定义明确的低浓度营养混合物或引入快速波动时，其实现较为困难。微流控系统虽可生成动态环境，但产生的生物量不足以支持群体水平的组学分析。为克服这些局限，我们推出了毫流控连续培养装置（MCCD），这是一种研究微生物对稳定及波动营养条件响应的多功能平台。MCCD将细菌种群容纳于Sterivex滤器（0.45 µm聚偏二氟乙烯[PVDF]多孔滤膜）内，通过培养基的连续流动维持稳定的培养环境，同时防止营养物质耗竭。由定制Matlab软件控制的三通电磁阀系统，可实现精确到分钟级别的营养波动调控。本实验方案详细介绍了MCCD的两种操作模式：（1）恒定低营养条件；（2）波动营养条件。利用该系统，Escherichia coli在纳摩尔浓度范围（数十至数百纳米）的氨基酸与碱基混合物中实现了指数生长，细胞浓度达到约109个细胞/mL。通过重现自然微生物生境的关键特征，MCCD使得在受控但生态相关条件下研究大肠杆菌（E. coli）及其他微生物物种的生长与生理成为可能。
引言
自然环境中的细菌所面临的营养环境在成分和浓度上通常各不相同，并可在多种时间尺度上发生波动1,2,3,4。在海洋5、土壤3和肠道6等环境中，微生物的生长常受到一种或多种必需营养物质的限制，而营养物质的可利用性可能因物理、化学和生物过程而发生变化4。这些营养物质的混合状态及其动态变化驱动了微生物为生存和生长所采取的策略，从而在不同层次的生物组织水平上塑造其响应机制4。
微生物对营养动态的适应发生在群落、种群和单细胞水平上。在群落水平上，营养波动可促进物种共存7，协调群落组成和代谢活动与时间变化的关系8，并为新物种的定殖创造机会9。在种群水平上，变化的营养条件可通过选择遗传变异加速进化10，或诱导表型异质....
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方案
1. 恒定营养条件下细菌的生长
注意：本方案描述了进行生长曲线实验的步骤 E. coli 在极稀释的富集限定培养基（“低浓度 RDM”）条件下培养 NCM3722。该生长曲线持续 12 小时，每 2 小时采集一次样品（共 6 个时间点）。本实验方案的关键原则是：每个时间点对应一个 Sterivex 滤器（以下简称 0.45 µm PVDF 滤器）。采集样品时，将滤器倒置离心以回收其中的培养物，定量细胞数量后弃去滤器。每个 0.45 µm PVDF 滤器仅能提供一个样品。实验准备需确定三个关键实验参数：蠕动泵的流速、实验持续时间以及所需采集的样品数量（即 0.45 µm PVDF 滤器的数量）。初始流速设为 2 mL/min，并根据需要进行调整（例如，提高流速以维持极低浓度营养物质的供应）。
- 培养基与材料的准备
注意：由于每个滤膜对应一个时间点的样品，每个0.45 µm PVDF滤膜的实验运行时间根据其采集时间的不同而有所差异（例如，第一个时间点为2 h，第二个时间点为4 h，依此类推）。- 使用公式估算所需培养基体积
- 使用公式估算所需培养基体积
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结果
在本研究中，我们使用MCCD来量化生长速率 E. coli NCM3722 在三种 RDM 浓度下的恒定低营养条件下培养。这些浓度源自 Neidhardt 描述的丰富定义培养基（RDM）配方。19，其中氨基酸和碱基补充剂分别稀释至原始配方的0.5%、0.25%和0.01%。
在每种培养基中进行了重复的生长实验，以量化生长速率。对于0.5% RDM和0.25% RDM条件，我们各进行了三次重复实验，每次使用四个Sterivex滤器，分别在2 h、3 h、4 h和5 h取样。由于细胞在0.01% RDM条件下的生长较慢，实验持续时间延长至12 h，使用六个0.45 µm PVDF滤器，每2 h取样一次。我们在0.1% RDM条件下进行了两次重复实验。
通过离心法从0.45 µm PVDF滤膜上收集细胞，用荧光DNA染料染色后，采用流式细胞术分析样品，从而定量各时间点的细胞数量。根据前向散射、侧向散射和荧光信号确定细胞浓度，并乘以测得的样品体积，得到总细胞数。
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讨论
能够模拟自然环境中营养成分复杂性的细菌培养方法，对于超越简化实验室条件的微生物生理学研究至关重要。自然生态系统中含有多种营养物质，其浓度范围广泛，通常无法支持细菌的最大生长速率1,3,4,21,22,23。此外，营养物质的可利用性会随时间波动，有时波动的时间尺度与细菌的世代时间相当，甚至更短24。因此，细菌经常面临在营养组成和时间动态上均具有异质性的环境。MCCD 提供了一个研究细菌在这些条件下响应的平台，而传统培养方法或大多数微流控系统难以重现此类条件。在本研究中，E. coli 在三种低营养条件下均呈指数生长，每种条件支持不同的生长速率，扫描电镜（SEM）成像显示细胞大小存在相.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们衷心感谢戈登与贝蒂·摩尔基金会水生系统共生计划研究员奖（GBMF9197；https://doi.org/10.37807/GBMF9197）、西蒙斯基金会微生物生态系统原理（PriME）合作项目（资助编号 542395FY22）以及瑞士国家科学基金会资助项目 205321_207488（授予 R.S.）提供的资金支持。K.S.L. 感谢韩国基础科学研究所（国家研究设施与设备中心；资助编号 RS2025-00554860）和韩国国家研究基金会（NRF；资助编号 RS2025-23523643）的支持，两项资助均由韩国政府（MSIT）资助，同时感谢联合国大学釜山分校（UNIST）2025 年研究基金（1.260002.01）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1K 欧姆电阻器 | BC Robotics | ELC-021 | 额定功率：1/6 W |
| 1N4001 二极管 | BC Robotics | ELC-001 | 直流反向电压：50 V；平均整流电流：1 A |
| 3段铂金硫化硅胶蠕动泵管 | Innofluid | SE-TUB-SIL-SSS-2.4*0.8 | 内径 0.8 mm；外径 2.4 mm；可与所用蠕动泵兼容 |
| 三通电磁阀 | Emerson Electric Co. | 0055A301L0T00F3 | 12 V 直流，1 W |
| 铝箔 | 适用于高压灭菌 | ||
| Arduino Uno Rev4 | Arduino | 货号 ABX00173 | |
| 高压灭菌 | Systec | D-200 | 或其他公司 |
| 三端口帽盖封闭 – 适用于1和2升瓶 | Nalgene | 2162-0531 | 或其他公司（需确保其适用于所选的瓶子） |
| 三端口帽盖封闭 – 4 L 瓶 | Nalgene | 2162-0830 | 或其他公司（需确保其与所选瓶子匹配） |
| 细胞密度计 CO8000 | WPA 生物波 | 光密度计 | |
| 离心 | Eppendorf | 5804R | 可容纳50 mL Falcon管的离心机 |
| 离心 | Eppendorf | 5424R | 可容纳 1.5 和 2 mL 离心管的离心机 |
| 50 mL 锥形离心管 | Fischer Scientific | 10788561 | Falcon管 |
| 培养管（14 mL，无菌） | Greiner bio-one | 培养管 | |
| 乙醇 | Sigma Aldrich | 493511 | 稀释至70% |
| 流式细胞仪 | 贝克曼 | C09756 | CYTOFlex |
| 25% 戊二醛 | Sigma Aldrich | G5882 | 或其他公司 |
| 量筒 - 500 mL | Nalgene | 3662-0500 | 或其他公司 |
| 培养箱 | 定制培养箱 – 请联系通讯作者以获取构建细节 | ||
| LabV1 智能低流速蠕动泵 | Innofluid | SE-LABV1-AMC12(10) | 达尔文微流控公司有售 |
| 雄性鲁尔转接至鲁尔接头 | Aldrich | Z277142 | 与内径为0.8 mm管路兼容的雄性鲁尔转接头（见图1C） |
| 雄性鲁尔转螺纹接头 | Aldrich | Z277142 | 用于连接电磁阀与 "进样管" （见图1D） |
| Matlab | Mathworks | R2022b 或更高版本 | 运行电磁阀定制软件的软件 |
| MOPS EZ Rich 培养基试剂盒 | Teknova | M2105 | 用于肠杆菌的 MOPS 培养基 |
| 单向鲁尔单向阀 | Masterflex | 30505-92 | 防止倒流至培养基储液槽 |
| 管道切割器 - 0-37 mm | KS Tools | 2222051 | 或其他公司 |
| 移液器套装 | Fisher Scientific | 05-403-151 | 或其他公司 |
| 铂固化硅胶管 - 1/16 英寸 | Nalgene | 8060-0020 | 内径 1/16 英寸（1.6 mm）；用于营养物质波动实验 |
| 铂固化硅胶管 - 1/8 英寸 | Nalgene | 8060-0030 | 内径 1/8 英寸（3.2 mm）；用于营养波动实验 |
| 聚丙烯共聚物瓶 - 1 L | Nalgene | 2126-1000 | 或其他公司 |
| 聚丙烯共聚物瓶 - 2 L | Nalgene | 2126-2000 | 或其他公司 |
| 聚丙烯共聚物瓶 - 4 L | Nalgene | 2126-4000 | 或其他公司 |
| 5 mL 血清移液管 | 康宁 | CLS4487 | 或其他公司 |
| 无焊面包板 | BC机器人技术 | PROTO-001 | |
| Sterivex-HV 滤器 - 0.45 µm PVDF | Millipore | SVHV01015 | |
| SYBR Green I 核酸凝胶染料 | Invitrogen | S7563 | 用于流式细胞仪细胞计数的核酸染色剂 |
| TIP120 达林顿晶体管 | BC机器人技术 | TRN-005 | |
| 1.5 mL 离心管 | Eppendorf | 3810X | 用于离心细胞培养物和储存沉淀物的离心管 |
| 通气滤器 | Millex | SLFG05000 | 0.2 µm 疏水性通气滤器 |
| 废液容器 | 体积容量应至少为实验中要使用的总培养基体积 |
参考文献
- Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338 (6107), 628-633 (2012).
- Vorholt, J. A. Microbial life in the phyllosphere. Nat Rev Microbiol. 10 (12), 828-840 (2012).
- Or, D., et al.
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