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用于研究的连续培养毫流体装置 大肠杆菌 在低且波动的营养条件下

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DOI：

10.3791/70652

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2026年7月7日

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1Department of Civil, Environmental and Geomatic Engineering, Institute of Environmental Engineering, ETH Zurich, 2Department of Mechanical Engineering, Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST), 3Department of Plant and Environmental Sciences, Institute of Life Sciences, The Hebrew University of Jerusalem, 4Department of Water Resources and Drinking Water, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology (Eawag)

本文内容

摘要

我们介绍一种用于毫流体连续培养装置（MCCD）的实验方案，该装置可在恒定的低营养条件下（低至数百纳摩尔浓度）或在分钟时间尺度上的动态营养波动条件下培养细菌群体。

摘要

自然界中的微生物生境通常以低浓度的混合营养物质、空间异质性和时间上的波动为特征。然而，传统的实验室培养方法难以模拟这些条件。批量培养无法在低营养环境中维持微生物生长，而恒化器虽然能够利用单一限制性营养物质维持稳态生长，但在需要维持定义明确的低浓度营养混合物或引入快速波动时，其实现较为困难。微流控系统虽可生成动态环境，但产生的生物量不足以支持群体水平的组学分析。为克服这些局限，我们推出了毫流控连续培养装置（MCCD），这是一种研究微生物对稳定及波动营养条件响应的多功能平台。MCCD将细菌种群容纳于Sterivex滤器（0.45 µm聚偏二氟乙烯[PVDF]多孔滤膜）内，通过培养基的连续流动维持稳定的培养环境，同时防止营养物质耗竭。由定制Matlab软件控制的三通电磁阀系统，可实现精确到分钟级别的营养波动调控。本实验方案详细介绍了MCCD的两种操作模式：（1）恒定低营养条件；（2）波动营养条件。利用该系统，Escherichia coli在纳摩尔浓度范围（数十至数百纳米）的氨基酸与碱基混合物中实现了指数生长，细胞浓度达到约109个细胞/mL。通过重现自然微生物生境的关键特征，MCCD使得在受控但生态相关条件下研究大肠杆菌（E. coli）及其他微生物物种的生长与生理成为可能。

引言

自然环境中的细菌所面临的营养环境在成分和浓度上通常各不相同，并可在多种时间尺度上发生波动1,2,3,4。在海洋5、土壤3和肠道6等环境中，微生物的生长常受到一种或多种必需营养物质的限制，而营养物质的可利用性可能因物理、化学和生物过程而发生变化4。这些营养物质的混合状态及其动态变化驱动了微生物为生存和生长所采取的策略，从而在不同层次的生物组织水平上塑造其响应机制4。

微生物对营养动态的适应发生在群落、种群和单细胞水平上。在群落水平上，营养波动可促进物种共存7，协调群落组成和代谢活动与时间变化的关系8，并为新物种的定殖创造机会9。在种群水平上，变化的营养条件可通过选择遗传变异加速进化10，或诱导表型异质性（包括应对不可预测环境的“风险分散”策略）11，从而提高生存能力。在单细胞水平上，细菌会根据营养环境调整其生理状态12,13。最近报道的一个例子是某种特定生理状态，使细菌在波动环境中具有生长优势14。由于细菌经常遭遇营养限制，研究其在低营养和营养多变条件下——无论是作为单个细胞还是在种群或群落中——的响应机制，对于理解其在自然环境中的行为至关重要。

恒化器非常适合研究单一营养物限制条件下的生长，但在需要控制低浓度混合营养物中多种营养物浓度的情况下则难以使用。恒化器作为研究细菌对营养限制适应性的有力工具，能够提供一个高度可控且稳定的环境。然而，其运行机制本身决定了只能应用于生长受单一必需营养元素限制的条件。在恒化器中，通过调节稀释速率使细胞生长与一种限制性营养物的供给达到平衡，从而固定了生长速率，而非各个营养物的浓度15。这一框架难以直接推广至含有可替代性营养物混合物的环境——例如多种碳源——因为稀释速率仅控制总体生长速率，而无法控制培养基中各组分的浓度16,17。因此，各个营养物的浓度及其共利用模式是由微生物自身的利用行为决定的，而非由外部设定16,17。

此外，虽然可以在恒化器中诱导营养波动，但由于通常培养体积较大，难以实现分钟级的快速波动或单次营养变化。微流控装置已成为创建精确低浓度和动态营养环境的有力工具14。当与视频显微镜结合时，可实现对单细胞生长的测量。尽管微流控系统能够利用荧光报告蛋白定量特定蛋白的表达，但与恒化器不同，典型的微流控装置体积过小，无法产生组学分析所需的生物量，例如用于研究细菌群体的蛋白质组。为弥补这一不足，我们开发了毫流控连续培养装置（MCCD）。

MCCD 能够在受控的营养条件下支持细菌生长，包括在营养物消耗极小或几乎没有消耗的情况下维持恒定的低营养条件，以及利用连续流动培养系统产生足够生物量以进行后续分析的波动性营养条件。MCCD 使用一个 0.45 µm 的 PVDF 滤膜作为培养腔室，通过蠕动泵从储液器持续补充新鲜培养基（图 1A）。滤膜的多孔结构可截留细菌，同时允许设定流量的营养物质通过，从而即使在低浓度营养条件（数百纳摩尔至微摩尔范围）下也能防止营养耗竭。由于生物量被保留在装置内，而新鲜培养基持续流经系统，MCCD 在原理上与滞留培养系统（retentostat）具有相似性18，即细胞被保留而培养基不断更新。然而，MCCD 在结构设计和营养供给模式上不同于传统的滞留培养系统。典型的滞留培养系统通常为搅拌式整体反应器，细胞悬浮于充分混合的培养体积中。在此类条件下，营养物质的可利用性取决于混合、扩散和细胞摄取之间的平衡，尤其在低营养浓度和高细胞密度时，可能产生局部耗竭或浓度梯度。相比之下，在 MCCD 中，细胞直接在小体积 Sterivex 滤器内的膜表面聚集，形成仅数个细胞厚度的薄层，并持续暴露于流动的培养基中。滤器内部不施加主动搅拌；相反，培养基在上游已实现均质化，并通过连续流动输送。营养物质通过对流方式穿过薄层细胞进行供应，由于扩散距离短且流速高，局部营养梯度被极大降低。因此，群体所经历的营养条件主要由流入培养基的成分决定，从而能够实现比搅拌式滞留系统更稳定且定义更明确的低营养环境。

使用蠕动泵、电磁阀和Arduino装置实现过滤的自动流体控制系统。
图1：用于在低浓度或波动营养条件下进行细菌培养的毫流体连续培养装置（MCCD）。（A）在恒定营养条件下使用的MCCD示意图。蠕动泵驱动新鲜培养基从储液瓶经含细菌细胞的0.45 µm PVDF滤膜流动。滤膜中的多孔结构可截留细菌，同时允许培养基通过。持续的培养基流动可在滤膜内部维持恒定的营养条件，即使在极低的营养浓度下亦可实现。（B）在波动营养条件下使用的MCCD示意图。位于蠕动泵上游的软件控制三通电磁阀在两个储液瓶之间切换培养基流入（例如，高营养浓度 CHigh 和低营养浓度 CLow）。软件控制电磁阀的阀芯位置，以确定当前激活的进液来源。（C）用于恒定营养条件的流体组件。一个带有三根贯穿其中的硅胶管的瓶盖密封住盛有新鲜培养基的瓶子。其中一根管连接通气滤器以实现通气，其余两根管将培养基输送至滤器。鲁尔接头（Barb-to-Male Luer）将这些管路连接至蠕动泵管，并将每根蠕动泵管连接至单向止回阀，作为进入滤器的入口。滤器出口也装配有单向止回阀。图中显示了两个样品，每个样品位于一个滤器中。（D）用于波动营养条件的流体组件。金属平台内安装有微控制器和电子元件，通过定制的MATLAB软件控制两个电磁阀。螺纹转卡套接头（Threaded-to-Barb fittings）将电磁阀的进出口与管路连接。每个阀有两个进口，分别连接两种交替的培养基：高营养浓度培养基 CHigh（红色标记管路）和低营养浓度培养基 CLow（蓝色标记管路）。培养基储存在带通气滤器的密封瓶中，如（C）所示。电磁阀的出口通过蠕动泵管连接至滤器，结构与稳态装置（C）相同。图中显示了两个样品，每个样品位于一个滤器中。 请点击此处查看该图的放大版本。

此外，在Sterivex滤膜上游安装一个由软件控制的三通电磁阀，可使用户在两个不同储液器中的培养基之间切换流动路径（图1B）。因此，该装置可用于研究细菌在稳定环境下的响应，例如在恒定（包括低浓度）营养条件下的生长行为，或在营养物质波动条件下的响应，其波动时间尺度可长达数分钟或更长时间。

本方案概述了用于在低营养和波动营养条件下研究细菌的MCCD装置的组装与操作。作为示例，本方案提供了使用大肠杆菌（Escherichia coli）NCM3722在MCCD两种运行模式下开展生长实验的逐步操作指南：恒定低营养条件和波动营养条件。MCCD系统可轻松适配于其他营养条件和微生物种类，使其成为研究细菌在自然界常见营养环境中生理特性的多功能平台。

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方案

1. 恒定营养条件下细菌的生长

注意：本方案描述了进行生长曲线实验的步骤 E. coli 在极稀释的富集限定培养基（“低浓度 RDM”）条件下培养 NCM3722。该生长曲线持续 12 小时，每 2 小时采集一次样品（共 6 个时间点）。本实验方案的关键原则是：每个时间点对应一个 Sterivex 滤器（以下简称 0.45 µm PVDF 滤器）。采集样品时，将滤器倒置离心以回收其中的培养物，定量细胞数量后弃去滤器。每个 0.45 µm PVDF 滤器仅能提供一个样品。实验准备需确定三个关键实验参数：蠕动泵的流速、实验持续时间以及所需采集的样品数量（即 0.45 µm PVDF 滤器的数量）。初始流速设为 2 mL/min，并根据需要进行调整（例如，提高流速以维持极低浓度营养物质的供应）。

  1. 培养基与材料的准备
    注意：由于每个滤膜对应一个时间点的样品，每个0.45 µm PVDF滤膜的实验运行时间根据其采集时间的不同而有所差异（例如，第一个时间点为2 h，第二个时间点为4 h，依此类推）。
    1. 使用公式估算所需培养基体积
      Static equilibrium formula, medium volume = 1.2 × Q Σni=1 ti, equation analysis chart.,
      其中 n 是样本数量（0.45 µm PVDF 滤膜）， Q 是流速（单位：mL/min），以及 ti 每个样本的实验运行时间（以分钟计）。
    2. 乘以1.2以增加20%的额外体积，以补偿流速变化。本示例中，计算如下
      Medium volume calculation, formula, Σ(mL) over time intervals, equation analysis.
    3. 将计算出的体积向上取整（例如，本示例中准备 6,200 mL）。
    4. 准备灭菌材料（参见 表1).
      注意：实验前一天准备好材料并进行灭菌，以确保实验准备就绪并尽量减少延迟。除单向鲁尔阀外，其余材料均通过高压灭菌；单向鲁尔阀使用70%乙醇灭菌。
      1. 将六根硅胶蠕动泵管的两端分别连接到“公鲁尔接头转接头”塑料接头上，方法是将接头的接头端插入管中。用铝箔覆盖公鲁尔接头端，以防止污染。
        注意：需准备六根蠕动泵管，因为实验使用了六个0.45 µm的PVDF滤膜。所有管路后续将安装在同一蠕动泵泵头上，以确保所有滤膜获得相同的流速。
      2. 将管路置于密闭的可灭菌容器内。
      3. 将通气滤器放入密闭的可灭菌容器中。
      4. 将带有硅胶管穿过的试管瓶盖放入一个可密闭且可灭菌的容器中。
        注意：本方案中使用的带管瓶盖上设有三个贯穿瓶盖的管道：两个直径相同的管道用于向0.45 µm PVDF滤膜输送培养基，另一个直径较宽的管道。这些管道牢固地固定在瓶盖上，不可拆卸。
      5. 将12个单向鲁尔接头止回阀浸入70%乙醇溶液中，浸泡过夜以灭菌。
        注意：（暂停点）灭菌后的材料可在室温下浸没并密封保存，最长可保存24小时。使用前，将阀门从乙醇中取出，并用无菌超纯水冲洗，以去除残留的乙醇。或者，可使用可高压灭菌材料通过3D打印制备单向阀，从而采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，替代乙醇处理。
    5. 使用标准实验器具设置对蠕动泵管、通气滤器、瓶盖、量筒和瓶子进行高压灭菌。
    6. 准备6,200 mL低浓度丰富定义培养基（RDM；参见 材料表) 通过混合下表所列的试剂 表2.
      注意：在预培养开始后约5小时的等待期间（见步骤1.2.1），于实验当天配制培养基。此举可保持培养基的新鲜度，并最大限度降低污染风险。
  2. 细菌预培养物的制备
    注意：使用处于对数生长期的预培养物开始实验。在此阶段，细菌以恒定速率生长，均衡合成细胞组分，并在特定细胞质量下进行分裂。使用对数期细胞可最大限度减少实验变异，并标准化起始的生理状态。
    1. 实验前一天，按如下步骤制备过夜（ON）培养物：取3 mL完全RDM培养基，接种一管冻存的甘油菌种 E. coli 在无菌的15 mL培养管中加入NCM3722。在摇床培养箱中，37 °C、200 rpm振荡培养过夜（约16 h）。
      注意：（暂停点）将过夜培养物放入培养箱后，当天不再进行后续步骤。第二天继续进行步骤 1.2.2。
    2. 实验当天，按下述方法制备预培养物：将6 µL过夜培养物加入6 mL完全RDM培养基中，均分至两个15 mL培养管，标记为A管和B管。于37 °C、200 rpm振荡条件下培养两管。
      注意：预培养通常需要约 5 h 才能达到对数生长期（OD600 ≈ 0.5）。在此期间准备新鲜培养基（见步骤 1.1.6）。在 OD 达到之前，不要进行步骤 1.2.3。600 约为 0.5。
    3. 使用 B 管监测 600 nm 处的光密度（OD）。当 OD 达到指定值时，继续实验。600 达到约 0.5，表明在完整的 RDM 中呈指数增长 E. coli NCM3722（见第1.4节）。
      注意：为提高实验的可重复性并标准化起始条件，应使用对数生长期的细胞开始实验。
  3. 在MCCD中准备营养条件恒定的实验
    注意：在预培养开始生长后，立即在无菌生物安全柜内执行步骤 1.3.1 至 1.3.5。
    1. 将总培养基体积分配至每瓶。
      注意： 将瓶子用作培养基储存器。使用配有两条培养基输送管的瓶盖，每条输送管将培养基输送至一个0.45 µm PVDF滤膜。根据实验过程中各时间点样品（即每个0.45 µm PVDF滤膜）所需的培养基量，将步骤1.1.6中配制的总培养基体积分配至各瓶子中。
      1. 使用步骤 1.1.1 中提供的公式计算每个 0.45 µm PVDF 滤膜所需的培养基体积。例如，使用以下参数：
        medium volume calculation formula, showing step-by-step ml/min conversions and total volume result
        每个时间点按时间顺序所需的培养基总体积分别为 288、576、864、1152、1440 和 1728 mL。
      2. 将计算好的培养基体积分装到各个瓶子中，将两个时间点所需的体积合并至同一个瓶子中。例如：一个1 L瓶中分装约900 mL（用于第1和第2个时间点），一个2.5 L瓶中分装约2,100 mL（用于第3和第4个时间点），一个4 L瓶中分装约3200 mL培养基（用于第5和第6个时间点）。
    2. 用带管的瓶盖密封每个瓶子（图1C）。拧紧管盖，防止泄漏。
    3. 将一个0.2 µm通气滤器连接到瓶盖上延伸出的最粗的硅胶管图1C这可在实验过程中实现无菌空气交换。
    4. 将每个蠕动泵管的一端（已安装接头；参见材料准备部分 1.1.4）连接到瓶盖上伸出的较小直径硅胶管图1C）。确保连接牢固以维持无菌状态。实验开始前，保持游离的雄性鲁尔锁扣配件上的铝箔盖原位不动，以防止污染。
    5. 将装有已组装管路的瓶子和蠕动泵放入设定为 37 °C 的培养箱中。将管路固定在蠕动泵头的通道内。
      注意：所有蠕动泵管均安装在同一台蠕动泵的泵头上，以确保所有0.45 µm PVDF滤膜均由同一泵供给培养基。使用单台蠕动泵可保证各滤膜间的流速一致，避免因不同泵之间的差异而引入变异。
  4. 在MCCD中进行营养条件恒定实验的方案
    1. 将预培养物（OD = 0.5）取600 µL加入到5.4 mL新鲜的低浓度RDM中，按1:10比例稀释。
    2. 使用1 mL移液器，将1 mL稀释后的预培养液分别加入六个0.45 µm PVDF滤膜中。
    3. 用经高压灭菌的超纯水冲洗单向止回阀，并在每个0.45 µm PVDF滤膜的两端各连接一个止回阀。
    4. 移除蠕动泵管接头上的铝箔盖。
    5. 将六个0.45 µm PVDF滤器分别连接至蠕动泵管路上的雄性鲁尔接头（图1C).
    6. 将蠕动泵的流速设置为 2 mL/min 并启动流动。将此时刻定义为时间 0。
    7. 在0.45 µm PVDF滤膜下方放置废液容器，以收集流出液。
      注意： 图2A 显示实验装置在培养箱内的完整组装情况。
  5. 样本采集
    1. 2小时后，拔下连接在1 L瓶子上的两个0.45 µm PVDF滤器中的一个。
    2. 拧下单向止回阀，将0.45 µm PVDF滤膜放入50 mL离心管中，滤膜入口朝下。
    3. 将含有 0.45 µm PVDF 滤膜的离心管在 2,000 × g 2 分钟。
    4. 使用管子切割器，在靠近出口端的塑料外壳处施加轻柔压力，打开0.45 µm PVDF滤膜。
      注意：使用前对管子切割器进行消毒（例如，用70%乙醇擦拭），以避免打开0.45 µm PVDF滤膜时造成污染。
    5. 取出内筒（含多孔膜），弃去固定膜的滤器部分。
    6. 用离心管中收集的培养基冲洗0.45 µm PVDF滤膜外壳的内壁（与流动方向垂直的部分）。
      注意：此步骤可确保收集在离心过程中滞留在管壁上的任何细胞。
    7. 使用5 mL血清移液管测量收集的总体积。
    8. 在后续时间点（4 h、6 h、8 h、10 h 和 12 h），拔下相应0.45 µm PVDF滤膜，重复步骤1.5.2–1.5.6。请遵循以下特定顺序：
      1. 在4小时时，拔下连接到1 L瓶子的第二个0.45 µm PVDF滤膜。
      2. 在6小时和8小时时，拔下连接至2.5 L瓶子的0.45 µm PVDF滤膜。
      3. 在10小时和12小时时，拔下连接至4 L瓶的0.45 µm PVDF滤膜。
        注意：请按照此顺序将采样时间点与步骤 1.3.1 中分配的培养基体积相对应。
  6. 下游分析
    1. 从每个样品中取出三份100 µL等分试样，用戊二醛固定至终浓度为1.5%。
      警告: 戊二醛具有毒性，为强刺激物，并可能引起过敏反应。操作时应在化学通风橱内进行，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、丁腈手套和护目镜）。避免皮肤接触和吸入。含戊二醛的废弃物应依照机构规定的危险化学品废弃物管理法规进行处置。
    2. 使用固定后的样品，经荧光DNA染料标记后，通过流式细胞术计数每微升中的细胞数量。
      注意：荧光DNA染料可能具有致突变性。请佩戴手套，并根据机构生物安全规定处理含染料的废弃物。
      注意：作为DNA染色和流式细胞术的替代方法，可通过将少量样品接种于富含培养基的琼脂平板（如LB琼脂）上，培养后计数菌落形成单位（CFUs）来估算细胞密度。
    3. 将每微升的细胞数乘以步骤1.5.7中测得的总体积，以计算0.45 µm PVDF滤膜中所含的总细胞数。
    4. 将剩余体积在1.5 mL微量离心管中以10,000 × g 4 分钟。
    5. 移除上清液。
    6. 将细胞沉淀在 -80 °C 保存，以备后续分析（如转录组学）。

用于控制培养基流动的蠕动泵和过滤器在培养箱中的细胞培养系统示意图。
图 2：MCCD 的实验装置。（A）MCCD 装置在恒定营养条件下运行的照片。该装置置于培养箱内以维持恒定温度，废液收集容器用于收集流出的培养基。（B）MCCD 装置在波动营养条件下运行的照片。标有红色胶带的瓶子中含有高营养浓度的培养基（CHigh），而标有蓝色胶带的瓶子中含有低营养浓度的培养基（CLow）。中央的金属平台支撑着控制营养波动的组件，对应于图 1D 中描述的部件。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 营养条件波动下的细菌生长

  1. 电磁阀控制器的组装
    注意：使用基于微控制器的开关电路控制三通电磁阀，该电路连接至运行自定义图形用户界面（GUI）的计算机，GUI 由 MATLAB 开发。
    1. 组装电磁阀控制电路（图3A).
      1. 将微控制器的一个数字输出引脚通过一个1 kΩ电阻连接到NPN型晶体管的基极。
      2. 将晶体管的集电极连接到电磁阀的负极。
      3. 将晶体管的发射极连接到地。
      4. 将电磁阀的正极端子连接至与阀门电压兼容的外部直流电源。
      5. 在电磁阀端子两端并联一个二极管，将二极管有条纹的一侧连接到正电源线上。
        注意：二极管可抑制电磁阀关闭时产生的电压尖峰。
    2. 将塑料“螺纹转软管接头”接头连接至电磁阀上，确保接头的软管端向外延伸。
    3. 在具备USB连接功能的计算机上安装 MATLAB R2022b 或更高版本。
    4. 安装 MATLAB 中用于与微控制器硬件进行串行通信所需的支持包。
    5. 使用USB线将微控制器板连接到计算机，以建立串行通信。
    6. 打开基于 MATLAB 的图形用户界面（GUI），该界面用于在 MCCD 中生成波动的营养条件（可从以下链接获取：https://github.com/juanitaLara/MCCD）。
    7. 验证电磁阀与 MATLAB GUI 平台之间的连接：
      1. 在 Matlab 中打开图形用户界面平台并点击 连接 按钮（图3B）。等待消息 控制器连接成功 出现在命令窗口中。
      2. 输入一个值 时间步长 （例如，高相位和低相位均为5秒）下 自动化操作 面板
      3. 观察电磁阀并倾听其声音 点击 两种介质间切换时产生的声音。
      4. 使用手表确认电磁阀在指定时间间隔（例如每5秒）精确切换。
        注意：每次实验前均需执行此验证步骤，以确认通信正常及阀门切换正确。（暂停点）验证电磁阀操作后，系统可在培养箱内保持组装状态数小时，再开始实验。
  2. 培养基与材料的准备
    注意：本实验方案涉及在低浓度和高浓度RDM培养基之间交替培养，每个周期为1小时（前30分钟使用高浓度RDM，随后30分钟切换至低浓度RDM）。实验共进行3小时的周期性波动处理，并采集两个时间点的样品：（1）第3小时1分钟（处于高浓度RDM阶段，即刚从低浓度切换至高浓度后立即取样）；（2）第3小时31分钟（处于低浓度RDM阶段，即刚从高浓度切换至低浓度后立即取样）。
    1. 根据实验阶段估算所需的培养基体积。
      1. 首先，计算前3小时（三个完整的波动周期）所需的体积：
        低 RDM 体积 =1.2 × 2[mL/min] × 90[min] × 2[0.45 µm PVDF 滤膜] = 432[mL]
        高 RDM 体积 =1.2 × 2[mL/min] × 90[min] × 2[0.45 µm PVDF 滤膜] = 432[mL]
      2. 计算最终30分钟阶段所需的体积：
        高 RDM 体积 = 1.2 × 2 [mL/min] × 30 [min] × 1 [0.45 µm PVDF 滤膜] = 72 [mL]
      3. 将体积取整至便于操作的数值（例如，低RDM为500 mL，高RDM为600 mL）。
    2. 准备材料以进行高压灭菌（参见 表3) 按照步骤 1.1.4–1.1.5 进行。
      注意：在实验前一天准备好材料并进行灭菌，以确保实验当天的准备工作就绪并尽量减少延误（步骤 2.2.3 和 2.2.4）。与恒定营养实验相比，该装置需要额外的管路将培养基瓶直接连接至电磁阀图1B,D）。这些管子仅需一个“鲁尔接头转公接头”接头，因为电磁阀接头已预装。高压灭菌前用铝箔覆盖这些管子的末端。
    3. 将准备好的蠕动泵管、通气滤器、瓶盖、量筒和瓶子在高压灭菌器中灭菌。
    4. 将4个单向鲁尔接头止回阀浸入70%乙醇溶液中，浸泡过夜以灭菌。
      注意：（暂停点）灭菌后的止回阀可在乙醇中浸泡过夜，并在室温下密封保存最多24小时。使用前，用无菌Milli-Q水冲洗阀门。
    5. 使用70%乙醇冲洗电磁阀3至5次，再用超纯水冲洗3至5次，以清洁并灭菌。
    6. 在实验当天，在预培养准备后约5小时的等待期间（见步骤2.3），通过混合下表所列试剂，配制500 mL低浓度RDM和600 mL高浓度RDM。 表4.
      注意：在实验当天配制培养基可确保其新鲜并最大限度降低污染风险。
  3. 细菌预培养物的制备
    1. 按照步骤1.2中所述的步骤进行操作。
  4. 在MCCD中准备营养条件波动的实验
    注意：在预培养物开始生长后，立即在无菌生物安全柜内执行步骤 2.4.1–2.4.4。
    1. 将每种培养基放入1 L瓶中。
    2. 用预先组装好并配有三个端口及预装硅胶管的瓶盖密封瓶子。拧紧瓶盖以确保密封，防止泄漏。
    3. 将一个0.2 µm通气滤器连接到每个瓶盖端口延伸出的粗硅胶管上。
    4. 连接“进液管”（如图所示 图1D将硅胶管连接至电磁阀之前，先将其连接到瓶盖延伸出的硅胶管上：
      1. 将一端带有单个接头的硅胶管连接到低RDM瓶盖延伸出的管路上。
      2. 在将瓶子送至培养箱前，保持雄性鲁尔锁紧接头上的铝箔盖不打开，以防止污染。
      3. 对中国台湾的说明：根据您的要求，已对相关内容进行处理。 重复步骤2.4.4.1，对高RDM瓶进行相同操作。
    5. 将装有组装好的“进液管路”的瓶子、蠕动泵以及带控制器的电磁阀置于设定为37 °C的培养箱内。
    6. 将步骤 2.4.4 中连接的“进液管”按以下方式连接至电磁阀的进液口：
      1. 将低 RDM 瓶的两根管路连接至每个电磁阀的两个入口之一（用蓝色胶带标记的管路） 图1D).
      2. 将高RDM瓶的两根管路连接到每个电磁阀的两个入口之一（用红色胶带标记的管路） 图1D).
    7. 将一根与蠕动泵兼容的硅胶管（仅带一个接头）连接至每个电磁阀的出口图1D用铝箔覆盖住游离的雄性鲁尔锁接头，直至实验开始，以保持无菌状态。
  5. 实验方案 在MCCD中进行的营养条件波动实验
    1. 通过执行步骤 2.1.7 验证电磁阀与 Matlab 软件之间的连接。
    2. 在Matlab GUI平台中输入所需的波动时间步长值：在高RDM中输入1800 s（30 min），在低RDM中输入1800 s（30 min）。
    3. 选择 低 在……之下 从...开始 菜单以在低 RDM 条件下开始（图3).
    4. 按照步骤1.4所述，将两个0.45 µm PVDF滤膜进行接种。
    5. 开始实验。
      注意： 图2B 展示了本实验的完整流体装置。
  6. 样本 收集
    1. 按照步骤1.5采集样品。在3小时1分钟时收集第一个0.45 µm PVDF滤膜，在3小时31分钟时收集第二个。
      注意：请先拔下任意一个滤器的插头；两个滤器由同一培养基供液。
  7. 下游分析
    1. 按照步骤1.6所述，通过流式细胞术对细胞数量进行计数，并对样本进行处理和储存以用于后续分析（如转录组学）。

Microcontroller solenoid valve control system with transistor and diode; nutrient monitor graph.
图3：用于施加营养波动的电磁阀控制器。 (A) 控制电磁阀的电子电路接线图。该电路由一块微控制器板、一个用作开关元件的晶体管、一个连接至晶体管基极的电阻，以及一个并联在电磁阀两端的续流二极管组成，该二极管用于保护电路免受电磁阀开关过程中产生的电压尖峰影响。微控制器控制晶体管的通断，从而控制供给电磁阀的电源。经参考文献许可改编自原文。 20 . (B) 将微控制器板连接至运行图形用户界面的计算机以及电磁阀所需电压的电源后，通过点击 连接 按钮。阀门可通过手动方式操作使用 手动操作 面板，用户在此选择要流过的培养基（例如，“High”或“Low”）。或者， 自动化操作 面板允许用户设定初始培养基以及每个阶段（高浓度和低浓度）的时间步长（单位：秒），并通过点击按钮启动操作 开始 按钮。该 实时监测 随时间显示一个阶跃函数（0 = 低，1 = 高），指示在过去几秒内流经电磁阀进入滤器的培养基种类。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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结果

在本研究中，我们使用MCCD来量化生长速率 E. coli NCM3722 在三种 RDM 浓度下的恒定低营养条件下培养。这些浓度源自 Neidhardt 描述的丰富定义培养基（RDM）配方。19，其中氨基酸和碱基补充剂分别稀释至原始配方的0.5%、0.25%和0.01%。

在每种培养基中进行了重复的生长实验，以量化生长速率。对于0.5% RDM和0.25% RDM条件，我们各进行了三次重复实验，每次使用四个Sterivex滤器，分别在2 h、3 h、4 h和5 h取样。由于细胞在0.01% RDM条件下的生长较慢，实验持续时间延长至12 h，使用六个0.45 µm PVDF滤器，每2 h取样一次。我们在0.1% RDM条件下进行了两次重复实验。

通过离心法从0.45 µm PVDF滤膜上收集细胞，用荧光DNA染料染色后，采用流式细胞术分析样品，从而定量各时间点的细胞数量。根据前向散射、侧向散射和荧光信号确定细胞浓度，并乘以测得的样品体积，得到总细胞数。

...

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讨论

能够模拟自然环境中营养成分复杂性的细菌培养方法，对于超越简化实验室条件的微生物生理学研究至关重要。自然生态系统中含有多种营养物质，其浓度范围广泛，通常无法支持细菌的最大生长速率1,3,4,21,22,23。此外，营养物质的可利用性会随时间波动，有时波动的时间尺度与细菌的世代时间相当，甚至更短24。因此，细菌经常面临在营养组成和时间动态上均具有异质性的环境。MCCD 提供了一个研究细菌在这些条件下响应的平台，而传统培养方法或大多数微流控系统难以重现此类条件。在本研究中，E. coli 在三种低营养条件下均呈指数生长，每种条件支持不同的生长速率，扫描电镜（SEM）成像显示细胞大小存在相...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们衷心感谢戈登与贝蒂·摩尔基金会水生系统共生计划研究员奖（GBMF9197；https://doi.org/10.37807/GBMF9197）、西蒙斯基金会微生物生态系统原理（PriME）合作项目（资助编号 542395FY22）以及瑞士国家科学基金会资助项目 205321_207488（授予 R.S.）提供的资金支持。K.S.L. 感谢韩国基础科学研究所（国家研究设施与设备中心；资助编号 RS2025-00554860）和韩国国家研究基金会（NRF；资助编号 RS2025-23523643）的支持，两项资助均由韩国政府（MSIT）资助，同时感谢联合国大学釜山分校（UNIST）2025 年研究基金（1.260002.01）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1K 欧姆电阻器BC RoboticsELC-021额定功率：1/6 W
1N4001 二极管BC RoboticsELC-001直流反向电压：50 V；平均整流电流：1 A
3段铂金硫化硅胶蠕动泵管InnofluidSE-TUB-SIL-SSS-2.4*0.8内径 0.8 mm；外径 2.4 mm；可与所用蠕动泵兼容
三通电磁阀Emerson Electric Co. 0055A301L0T00F312 V 直流，1 W
铝箔适用于高压灭菌
Arduino Uno Rev4Arduino货号 ABX00173
高压灭菌SystecD-200或其他公司
三端口帽盖封闭 – 适用于1和2升瓶Nalgene2162-0531或其他公司（需确保其适用于所选的瓶子）
三端口帽盖封闭 – 4 L 瓶Nalgene2162-0830或其他公司（需确保其与所选瓶子匹配）
细胞密度计 CO8000WPA 生物波光密度计
离心Eppendorf5804R可容纳50 mL Falcon管的离心机
离心Eppendorf5424R可容纳 1.5 和 2 mL 离心管的离心机
50 mL 锥形离心管Fischer Scientific10788561Falcon管
培养管（14 mL，无菌）Greiner bio-one培养管
乙醇Sigma Aldrich493511稀释至70%
流式细胞仪贝克曼C09756CYTOFlex
25% 戊二醛Sigma AldrichG5882或其他公司
量筒 - 500 mLNalgene3662-0500 或其他公司
培养箱定制培养箱 – 请联系通讯作者以获取构建细节
LabV1 智能低流速蠕动泵InnofluidSE-LABV1-AMC12(10)达尔文微流控公司有售
雄性鲁尔转接至鲁尔接头AldrichZ277142与内径为0.8 mm管路兼容的雄性鲁尔转接头（见图1C）
雄性鲁尔转螺纹接头AldrichZ277142用于连接电磁阀与 "进样管" （见图1D）
MatlabMathworksR2022b 或更高版本运行电磁阀定制软件的软件
MOPS EZ Rich 培养基试剂盒TeknovaM2105用于肠杆菌的 MOPS 培养基
单向鲁尔单向阀Masterflex30505-92防止倒流至培养基储液槽
管道切割器 - 0-37 mmKS Tools2222051或其他公司
移液器套装Fisher Scientific05-403-151或其他公司
铂固化硅胶管 - 1/16 英寸Nalgene8060-0020内径 1/16 英寸（1.6 mm）；用于营养物质波动实验
铂固化硅胶管 - 1/8 英寸Nalgene8060-0030内径 1/8 英寸（3.2 mm）；用于营养波动实验
聚丙烯共聚物瓶 - 1 L Nalgene2126-1000或其他公司
聚丙烯共聚物瓶 - 2 LNalgene2126-2000或其他公司
聚丙烯共聚物瓶 - 4 LNalgene2126-4000或其他公司
5 mL 血清移液管康宁CLS4487或其他公司
无焊面包板BC机器人技术PROTO-001
Sterivex-HV 滤器 - 0.45 µm PVDFMilliporeSVHV01015
SYBR Green I 核酸凝胶染料InvitrogenS7563用于流式细胞仪细胞计数的核酸染色剂
TIP120 达林顿晶体管BC机器人技术TRN-005
1.5 mL 离心管Eppendorf3810X用于离心细胞培养物和储存沉淀物的离心管
通气滤器MillexSLFG050000.2 µm 疏水性通气滤器
废液容器体积容量应至少为实验中要使用的总培养基体积

参考文献

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