本方案描述了一种稳定且可重复的制备各向异性聚乙烯醇（PVA）仿组织体的方法，这类仿组织体是验证针对力学各向异性软组织（如骨骼肌）的超声弹性成像技术的关键工具。
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摘要
摘要
聚乙烯醇（PVA）仿体通常为各向同性，广泛用于验证用于软组织评估的超声弹性成像技术。然而，某些生物软组织（例如骨骼肌）表现出明显的力学各向异性，因此在针对这些组织的弹性成像方法的严格测试中，需要使用各向异性的PVA仿体。尽管先前的研究指出，可通过结合拉伸的冻融循环（FTC）在实验室制备各向异性的PVA仿体，但关键的技术细节（如制备工艺、质量控制）仍缺乏充分记录。本研究提供了一种视觉化、可重复的制备各向异性PVA仿体的实验方案，重点介绍关键材料、分步操作流程及质量控制方法，以实现稳定且均匀的各向异性。关键材料包括：PVA作为仿体基质，山梨酸钾作为防腐剂，石墨颗粒作为声散射体，纯水（或去离子水）作为溶剂。制备过程包括三个核心阶段：1）在可控热条件下制备均匀的PVA基溶液，确保PVA完全溶解；2）通过冻融循环（FTC）固化：将冷却后的溶液倒入3D打印模具中，随后进行无拉伸的冻融循环，形成初步结构；3）通过拉伸状态下的冻融循环诱导各向异性：在可控拉伸条件下进行额外的冻融循环，以产生方向性各向异性。文中详细描述了质量控制措施（例如，在PVA溶解过程中避免气泡产生）。制备完成后，采用超声剪切波成像（SWI）和单轴拉伸测试来验证仿体的力学各向异性。本文提供了一种标准化的各向异性组织模拟仿体制备方法，以更准确、一致地验证超声弹性成像技术。
引言
某些生物软组织（例如骨骼肌）表现出宏观力学各向异性，这种特性源于其有序排列的微观结构1。具体而言，结缔组织将肌纤维组织成一种层级结构：肌内膜包绕单个肌纤维，肌束膜将肌纤维聚集成肌束，而肌外膜则包裹整块肌肉，支持力量传递和营养供应2。基于超声的弹性成像技术（如剪切波成像（SWI））已广泛用于肌肉评估3,4。然而，肌肉的力学各向异性理论上会导致剪切波传播具有方向依赖性5，这使得肌肉刚度的量化变得复杂6。用于模拟机械各向异性组织的仿体对于推动超声弹性成像在肌肉评估中的应用至关重要。
聚乙烯醇（PVA）是此类仿组织材料的理想选择，因为在冻融循环（FTCs）过程中维持机械拉伸可使PVA分子链排列对齐，从而诱导产生力学各向异性7,8。传统方法通常在拉伸条件下使用简单的PVA立方体，但由于表面滑移常导致应变不均匀，从而影响实验的可重复性。通过采用带有末端固定环的优化仿组织几何结构，可有效解决这一局限性，确保可靠的拉伸效果和均匀的应变分布9，显著提升各向异性PVA仿组织的质量。在本研究中，我们通过可视化演示详细展示了此类各向异性PVA仿组织的制备过程，并利用剪切波成像（SWI）和单轴拉伸试验对其力学各向异性进行了验证。
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方案
注意：以下步骤在图1中进行了图示说明。
1. 模体模具的3D打印
- 使用3D建模软件设计模体几何结构，使其两端各包含一个用于维持拉伸的固定环，中央有效区域长度为35 mm × 60 mm × 5 mm（长度 × 宽度 × 高度）以确保各向异性诱导的均匀性。
- 使用3D打印机打印模具。
注意：固定环可防止拉伸过程中发生滑动，确保应变分布均匀。所有3D打印文件（.stl）均提供于 补充文件 1.
2. 聚乙烯醇溶液的制备
- 称取聚乙烯醇（PVA）粉末（10 wt%）、山梨酸钾（1 wt%）和石墨颗粒（1 wt%，粒径约 6.5 µm），并量取相应体积的纯水（建议使用去离子水），以配制总体积约为 200 mL 的溶液。
- 将 PVA 粉末与纯水加入烧杯中，将烧杯置于带有搅拌子的磁力搅拌器上，用铝箔覆盖烧杯，在室温下以约 600 rpm 的速度搅拌 10 分钟，直至 PVA 完全分散。
- 将烧杯转移至 80 °C 水浴中，继续加热直至 PVA 完全溶解（以溶液澄清、无颗粒为标志）。
注意：加热过程中应佩戴耐热手套和护目设备，以防烫伤。确保无未溶解的 PVA 颗粒残留，否则会影响仿组织模型的均匀性。
3. 添加添加剂并浇铸
- 在磁力搅拌器上以约 600 rpm 持续搅拌的同时，将溶液冷却至约 40 °C。
- 移去铝箔，加入山梨酸钾和石墨颗粒，重新用铝箔覆盖，并以约 600 rpm 搅拌至添加剂均匀分散（通过视觉确认分布均匀）。
- （可选）对 PVA 溶液进行脱气以去除残留的气泡。将盛有混合溶液的烧杯放入真空室中，抽真空约 30 分钟，以除去 PVA 溶液中的气泡。
- 将溶液浇铸至 3D 打印模具中，并用螺丝组装模具。
注意：浇铸过程中避免引入气泡。如有必要，可轻轻敲击模具以消除溶液内部滞留的气泡。
4. PVA 固化的初始 FTC
- 将模具置于 −20 °C 冰箱中冷冻 12 小时。
- 从冰箱中取出模具，在室温（20 °C）下解冻 12 小时。
- 小心脱模，以防损坏。
注意：此步骤形成各向同性基础模体，为后续各向异性诱导提供稳定基础。
5. 通过拉伸 FTC 诱导各向异性
- 将模型放置于自制拉伸装置上，逐渐拉伸至其有效长度的180%（80%拉伸应变），手动测量拉伸距离，并锁定装置以防止回缩。
- 将整个拉伸装置（含固定好的模型）转移至−20 °C冰箱中冷冻12小时，随后在室温（20 °C）下解冻12小时。
- 在持续拉伸条件下重复此冻融循环一次。
注意：自制拉伸装置由市售双向对向螺纹线性平台组装而成，配有两件3D打印的模型固定夹具，STL文件详见补充文件1。从−20 °C冰箱中取出拉伸装置时，请佩戴隔热防冻手套以避免冻伤。冻融循环期间的持续拉伸可使PVA分子链单向排列。本研究中采用的总冻融循环次数为：1次无拉伸循环 + 2次拉伸循环（80%拉伸应变）。
6. 最终释放与储存
- 在完成最终的 FTC 解冻步骤后，轻柔地释放拉伸装置，以防止因回缩导致的损伤。
- 从拉伸装置上取下模体。各向异性 PVA 模体现已制备完成。
- 将模体浸没于水中，置于密封的塑料容器内，在 4 °C 下保存。
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结果
图2A展示了完整的制备流程示意图，包括PVA溶液配制、 molding（成型）、初始无拉伸FTC、脱模以及后续的拉伸FTC。根据所提出的方案，我们分别制备了两种各向异性的PVA仿组织体，用于剪切波成像（SWI）和单轴拉伸测试。SWI实验使用配备L7-4探头（中心频率：5.2 MHz）的研究型超声系统，采用超声模式（3个焦点，100 µs推动）4和相干平面波复合技术（CPWC）10，在−2°、0°、2°角度下以6 kHz帧率进行。为了捕捉多个角度下的剪切波传播情况，使用旋转平台将超声探头从0°旋转至90°，步长为2°。SWI结果显示出椭球形的剪切波传播轮廓，表明材料具有横向各向同性——即在垂直于拉伸方向的方向上（即图2B中的90°方向）波速较慢。如图2C所示，第二个样品使用万能试验机（应变率：1%/s）进行了单轴拉伸测试。结果显示，沿拉伸方向的杨氏模量（E
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讨论
该方案的成功依赖于实现PVA的完全且均匀溶解，并在冻融循环（FTC）过程中维持持续拉伸——这是诱导稳定且均匀力学各向异性的两个关键步骤。本文所采用的制备参数（即PVA浓度、冻融循环次数和施加的拉伸应变）旨在制备出刚度处于肌肉组织生理范围内的各向异性PVA模体。值得注意的是，通过调节这些制备参数，可方便地调控PVA模体的刚度和各向异性比。
沿深度方向相似的剪切波速度分布模式（即图2B中的椭圆）证实了该模体的均匀性。此外，轮廓略呈非椭圆形，可能是由于模体中存在轻微的边界效应。进一步地，根据我们的实验经验，采用所提出的方案可重复地制备各向异性的PVA模体。尽管剪切波成像（SWI）和单轴拉伸测试使用了不同的样本，但当假设各个方向满足 E = 3μ = 3ρVg2（E ：杨氏模量；μ ：剪切模量；ρ ：密度，1000 kg/m3；...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由北京自然科学基金（编号：1254038）资助。作者感谢香港大学的 Wei-Ning Lee 教授在超声剪切波成像测试中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 分析天平 | OHAUS | AX224 | 带内部校准功能的分析天平，量程 220 g，可读性 0.1 mg |
| 双向对向螺纹线性平台 | Taobao | N/A | 每根螺纹行程范围 250 mm，用于构建自制拉伸装置 |
| FDM 3D 打印机 | Bambu Lab | X1 Carbon | 用于打印模体模具以及自制拉伸装置中的模体固定夹具 |
| FreeCAD | FreeCAD 开源社区 | N/A | 版本 0.22.0，用于设计模体模具及自制拉伸装置的模体固定夹具 |
| 石墨颗粒 | MREDA | M151649 | 石墨颗粒，纯度 99.95%，2000 目（约 6.5 μm），用作声学散射体，质量分数 1% |
| 磁力搅拌子 | Corning | 401435 | PTFE 涂层磁力搅拌子，1 × 3/8 英寸，用于搅拌 PVA 溶液 |
| 磁力搅拌器 | IKA | 25005927 | RCT basic safety control 型磁力搅拌器，带加热功能 |
| 聚乙烯醇 | MACKLIN | P81584 | 聚乙烯醇，分子量 89000–98000，水解度 95%，用作模体基质，质量分数 10% |
| 山梨酸钾 | Sigma-Aldrich | 85520 | 山梨酸钾，≥99.0% 纯度，用作防腐剂，质量分数 1% |
| 旋转平台 | Newport | URS50BPP | 用于剪切波成像测试中旋转超声探头，实现多个探头角度（0°:2°:90°） |
| 单立柱万能试验机 | Instron | Model 5944 | 用于单轴拉伸测试，配备 50 N 力传感器 |
| 科研用超声系统 | Verasonics | Vantage 256 | 用于进行剪切波成像测试，L7-4 探头（中心频率：5.2 MHz） |
| 水浴锅 | LICHEN | HH-2 | 数显恒温水浴锅，双孔单排，用于加热并溶解 PVA 溶液 |
参考文献
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- Sherwood, L. . Fundamentals of human physiology. , (2011).
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