大鼠尾侧椎体间融合模型的建立：一项初步可行性研究

摘要

本研究证实了采用后路椎间融合 Cage 与钢板固定的 pilot 大鼠尾椎椎间融合模型的技术可行性。术后 12 周的组织形态计量学分析确认了连续的骨性桥接以及 Cage 内明确的骨组织成熟模式。该技术模型为未来的大规模研究提供了初步基础。

摘要

大鼠尾椎广泛用于骨再生和脊柱融合研究，是测试骨移植材料和植入物的便捷部位。以往的大鼠尾椎融合模型通过椎间盘切除联合骨移植，或借助外固定装置实现椎体间融合。然而，目前尚未建立一种使用类似于临床应用的椎间融合 cage 的小型动物模型。本研究假设，在大鼠尾椎实施模拟临床手术的后路 cage 植入并辅以钢板固定，可在不引起神经并发症的前提下，建立可评估的骨融合环境。本项初步的探索性研究（n = 1）旨在评估该技术的可行性。研究建立了一种手术方法，将微型钛合金 cage 精确植入相邻尾椎之间的椎间盘切除间隙，高度模拟人类手术操作。选择钛合金制作 cage，因其在临床上广泛应用且具有良好的生物相容性。初步结果证实了该技术方法的可行性。植入的 cage 成功维持了椎间隙高度和脊柱排列。术后观察到新骨逐渐长入 cage 内，至术后12周时，影像学和组织学均证实已形成跨越椎间隙的连续骨桥。影像学和组织学检查确认存在连续的骨小梁结构，且无纤维组织介入。总体而言，这种基于 cage 的大鼠尾椎融合模型为评估新型生物材料及研究椎体间骨融合机制提供了一个有前景的平台。但由于本研究为单例设计，缺乏对照组和统计学分析，研究结果的普适性受限，仍需进一步验证。

引言

椎体间融合术是治疗多种脊柱疾病（包括脊柱不稳、脊椎滑脱和退行性疾病）的一种成熟外科治疗方法；值得注意的是，该技术作为标准术式已发展了约70年^1,2。该手术包括切除椎间盘，并植入融合 Cage 或骨移植物，以促进相邻椎体之间形成坚固的骨性融合^3,4。此外，在 Cage 植入基础上联合后路内固定可降低假关节形成率，并拓展其临床适应证⁵。然而，假关节形成和 Cage 下沉等并发症仍是重要的临床挑战，因此有必要建立可靠的临床前模型，用于评估新型材料及促进融合的因素^6,7。

大鼠因其经济可行、繁殖迅速、愈合快且易于操作，已被广泛应用于脊柱融合研究^8,9。然而，现有的大鼠椎体间融合模型存在显著局限性。具体而言，大鼠的前路腰椎椎体间融合（ALIF）术式需要对腹腔主要血管和器官进行广泛操作，导致手术侵入性高，并伴随较大的并发症风险^10,11。而后路腰椎椎体间融合（PLIF）术式则由于脊髓管和神经结构极为细小，不可避免地存在神经损伤风险，使得神经组织牵拉几乎无法实现¹²。因此，大多数大鼠研究仅局限于后外侧融合（PLF），而该术式在结构上无法模拟临床中椎间融合器内骨融合机制的研究，而这一机制在临床实践中至关重要¹³。此外，尽管已有尾椎融合模型，但尚缺乏将类似临床的椎间融合器与后路钢板固定相结合的评估体系。

大鼠尾椎为椎体间融合研究提供了独特的研究优势。尾椎间盘在几何结构、成分和力学性能方面均与人体腰椎间盘具有高度相似性，因此在椎间盘研究中日益受到关注^14,15。此外，与腰椎手术入路相比，尾椎手术具有操作简便、成本低廉以及术后恢复迅速等优点¹⁶。然而，迄今为止，尚无研究报道在大鼠尾椎中成功实施后路椎间融合 cage 植入，并对 cage 内及周围骨组织形成的组织学情况进行详细评估。

组织学评估，特别是未脱钙骨组织形态计量学，仍然是评估骨整合和骨融合的金标准^17,18。具体而言，它能够对关键的骨形成参数进行定量分析，包括骨体积/组织体积（BV/TV）、小梁数量和小梁厚度，同时通过区分编织骨与板层骨来实现对骨成熟度的定性评估^19,20。这种详细的组织形态计量学评估可揭示 cages 内部及 cage-椎体界面处的骨传导空间与时间模式^21,22。然而，目前尚缺乏对大鼠模型中 cage 骨传导作用的全面组织形态计量学评估。

本研究旨在通过后路椎间 cage 植入并辅以钢板固定，建立一种初步的大鼠尾椎椎间融合模型，以验证其技术可行性。本研究详细描述了一种手术技术，并对 cage 内及椎体终板界面处的骨形成进行了全面的组织学评估。研究假设，在大鼠尾椎实施模拟临床操作的后路 cage 植入并辅以钢板固定，可在不引起神经并发症的情况下，建立可评估的骨融合环境。该模型为评估椎间融合材料提供了一个高效的平台，在现有文献中，也代表了在大鼠模型中首次通过组织形态计量学进行骨传导评估，成功实现后路 cage 置入的技术探索。

方案

所有动物实验均按照经济医科大学动物护理与使用委员会批准的方案进行（批准编号：2023–034C1）。本研究设计为一项初步可行性研究。为在大规模验证之前评估这种高度精细且新颖的后路椎间笼植入技术在大鼠尾椎中的技术可行性，根据伦理指南，初始技术评估阶段仅使用一只动物（n = 1），以最大限度减少动物使用。选用雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠作为脊柱融合研究的标准品系。纳入标准为健康雄性，年龄8–10周，体重200–250 g，以确保椎间盘高度（1.8–2.2 mm）与2 mm椎间笼相匹配。排除表现出 > 在适应期出现体重减轻10%、活动减少或尾部明显畸形的动物被排除。本研究使用一只雄性Sprague–Dawley大鼠（8周龄，体重221.8 g；Japan SLC，日本静冈）进行实验。该动物饲养于温度控制在25℃的环境中°C，相对湿度50%（允许范围30–70%），12小时光照/12小时黑暗循环，并提供 随意摄取 可自由获取水和标准啮齿类动物饮食。大鼠饲养在实底笼具中，笼内提供筑巢材料和咀嚼棒以丰富环境。在手术前实施为期3天的适应性饲养。为防止同笼动物啃咬尾部植入物，该实验期间大鼠始终采用单只单独饲养，这是本实验设计中的关键因素。

螺钉和接骨板的制备

手术前准备了内固定材料。将市售的不锈钢螺钉（原始直径：1.2 mm，长度：14 mm）使用钢丝钳精确截断至6 mm长度（图1A）。这些螺钉通过标准蒸汽高压灭菌法在121 °C下灭菌20分钟。在聚甲醛（POM）内固定板（长度18 mm，宽度3 mm，厚度1 mm）上，使用手动钻头以12 mm间距钻出直径为1.2 mm的螺钉孔（图1B–D）。随后，使用钢丝钳将POM板的角部修圆，以尽量减少对周围软组织的刺激（图1E）。由于该聚合物具有热敏感性，因此采用环氧乙烷（EtO）气体或过氧化氢气体等离子体对固定板进行灭菌。钛合金 Cage 具有相互连通的晶格结构，其纵向通道直径为300–500 µm。其表面采用层状3D钛技术处理，实现3–5 µm的微观表面粗糙度，以促进骨组织直接长入。

麻醉与手术操作

未进行术前禁食，以避免不必要的代谢应激。麻醉通过皮下注射给药，采用由美托咪定（0.15 mg/kg）、咪达唑仑（2 mg/kg）和布托啡诺（2.5 mg/kg）组成的三联麻醉混合剂，注射部位为背部，使用25号针头²³. 每15分钟通过确认足底退缩反射消失（足趾夹捏试验）、维持黏膜呈粉红色以及监测呼吸频率（70–110次/分钟）来评估麻醉的适当外科平面。随后进行尾椎椎体间融合手术。将动物置于俯卧位（图2A），并采用三轮交替擦拭消毒法（70% 乙醇、聚维酮碘擦拭、70% 乙醇）对整个尾部进行消毒，以确保无菌操作区域。为确定目标椎体，从骶骨远端开始进行手动触诊。第一个可活动的关节被确认为骶骨-尾1（sacrum-Co1）连接处，其紧邻的远端节段被确定为尾2（Co2），从而界定 Co2–Co3 为操作目标区域。在背侧做一长约 2 cm 的纵向切口，范围自第二尾椎至第三尾椎（Co2–Co3）图2B)，以暴露每个椎骨的后表面。在暴露过程中，需注意识别并避免损伤尾部背侧静脉；使用钝性分离和双极电凝处理少量出血点。为准备融合部位，使用手术刀切开第二尾椎（Co2）与第三尾椎（Co3）之间的纤维环。图2C）。随后使用刮匙和小镊子通过刮除术仔细去除纤维环和髓核图 2D）。此步骤在高倍外科放大镜下（≥3.5倍）进行。切除是否完全通过直观确认点状出血（即 "出血的终板" sign）以及完全没有残留的软组织。不可接受的终板损伤定义为累及深层的侵蚀性病变 > 总面积的25%或侵入松质骨 > 0.5 mm。钛笼（2 × 2 mm 横截面，2 mm 高度）（图2E随后将其深入插入椎间隙，直至遇到物理性阻挡，并通过视觉确认与上下终板完全接触，形成牢固的过盈配合（图2F，2G).

固定与伤口闭合

为便于固定钢板，使用转速为7,800 RPM、配备2.0 mm球形锉刀钻头的电动手持磨骨器，将Co2和Co3椎骨预定钻孔位置周围的骨面磨平（图2H）。随后，使用配备直径1.2 mm钻头的手动钻，在与塑料内固定钢板螺钉孔相对应的间隔位置逐个钻取骨孔（图2I）。接着，将两枚6 mm的不锈钢螺钉预先装入塑料钢板的螺孔中（图2J）。螺钉以90°角插入，深度标准化为5 mm，螺钉中心间距为12 mm（图2K）。最后，用4-0尼龙缝线缝合皮肤切口，并再次用70%乙醇对尾部进行消毒，完成手术操作。

术后管理和安乐死

在术后即刻恢复期（第0天），每15分钟监测动物一次，维持直肠温度，直至动物能够完全恢复胸卧位并实现有目的的活动。对于长期评估（第1–12周），采用基于体况评分（BCS）、理毛状况和总体活动水平的每日评分系统，同时每日监测手术部位是否存在感染或切口裂开。术后前48小时内，在笼底提供湿润饲料。每周测量体重一次。安乐死的 humane 终点严格定义为：体重减轻≥20%、体况评分≤2.0、持续无法接触食物或饮水。 > 12小时、出现严重疼痛或呼吸困难症状，或手术部位出现严重并发症（如坏死）时，动物将在24小时内实施人道安乐死。术后护理包括手术后立即肌内注射头孢氨苄（15 mg/kg），并在术后24小时再次给药，以预防感染。镇痛处理采用术后立即皮下注射卡洛芬（2 mg/kg），并在术后12、24和48小时各给药一次，共给药四次。植入后12周，通过过量异氟烷使大鼠安乐死，随后取第二至第三尾椎节段组织 整块 并用70%乙醇固定。

培训建议、故障排除及样本量。为了成功实施这一具有挑战性的方案，新操作者必须在大鼠尸体上进行3–5次练习操作，连续三次植入均无X线显示的定位错误时，方可视为达到熟练水平。常见的故障排除措施包括：通过X线预先测量椎间盘高度以优化 Cage 尺寸选择，以及重新确认椎体后方骨面的平整性以防止 Cage 移位。若螺钉固定效果不足，建议采用较低的钻孔速度。对于未来的验证性研究，建议每组至少包含 n = 6 至 10 的样本量（并额外增加10–20%以应对可能的损耗），以确保足够的统计效能。此外，未来的研究必须设置对照组（如空 Cage 或自体骨移植组），以验证生物材料的性能。

放射学与组织学分析

微型计算机断层扫描（CT）和数字化放射成像采用微型CT扫描系统进行，管电压为80 kV，电流为0.1 mA。采集过程中使用1.0 mm厚的铝滤膜，以减少钛种植体引起的射线硬化伪影。为进行纵向评估，术后1周和4周时进行活体成像，曝光时间为120 µm 体素大小。 离体 术后12周使用24 mm样品架和24 mm µm体素尺寸。采用标准滤波反投影算法重建CT数据和放射影像，并使用DICOM图像查看软件进行分析。设定定量标准以评估骨性融合。在影像学上，当显微CT至少连续三个层面观察到连接头侧与尾侧椎体终板的连续小梁骨结构时，判定为融合成功。图像分割过程中应用700 Hounsfield单位（HU）的全局阈值。在组织形态计量学上， cage内骨体积/总体积（BV/TV）比值达到或超过70%被视为实现充分空间填充及融合的阈值。组织学上，骨性融合定义为从头侧至尾侧完全由骨组织桥接，且无纤维组织介入。为进行组织学分析，于动物处死前2天皮下注射钙黄绿素（8 mg/kg），实施连续荧光标记，以确定在12周终点时活跃矿化的空间分布。切除的尾侧椎骨以70%乙醇固定7天并染色 整块 使用Villanueva骨染色法。标本经梯度乙醇脱水后，包埋于甲基丙烯酸甲酯树脂中，并根据切片前微型计算机断层扫描（Micro-CT）引导确定的笼状结构精确几何中心，用金刚石锯切片机进行正中矢状面切片。未脱钙磨片标本（5 µ在伊藤骨组织形态计量学研究所（日本新潟）制备了骨组织切片（厚度为 m）。使用明场显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行荧光合并成像。进一步在偏振光显微镜下进行观察，并采用计算机图像分析系统进行组织形态计量分析。感兴趣区域（ROI）定义为椎间融合器内部总体积，排除金属支架部分，并进一步划分为颅侧和尾侧融合器内 ROI。在 Villanueva 染色下，骨组织呈现紫色/洋红色而被识别。在偏振光下，板层骨（Lm.V）表现为高度有序的平行板层结构，而编织骨（Wo.V）则显示为无序的纤维排列模式。

结果

体重（表1）

术后12周内测量体重，显示体重稳定增加（从221.8 g增至346.8 g），表明生理稳态良好，并间接支持未发生严重慢性痛苦。这一结论得到每日多模式评估结果的证实，评估显示动物活动正常，伤口愈合无并发症。

伤口（图3）

术后4周实现伤口愈合；缝线自发排出，术后病程顺利，12周内未观察到感染迹象。

微型CT与数字化放射成像

术后1至12周的连续影像学评估（采用显微CT）证实，椎间融合器无松动或移位现象（图4A–4F）。同样，术后12周的数字化X线检查也未发现螺钉松动...

讨论

本研究建立了一种新型的大鼠尾椎椎体间融合模型。该模型通过后路植入钛合金融合 Cage，并结合钢板-螺钉固定方式进行增强。随后，采用详细的组织形态计量学分析评估 Cage 内的骨形成情况。该模型具有三个显著特点：1）通过将椎体间 Cage 与后路内固定相结合， closely 模拟了临床后路腰椎椎体间融合术或经椎间孔腰椎椎体间融合术的操作过程；2）利用解剖上易于操作的尾椎部位，从而确保手术技术及动物福利的标准化；最重要的是，3）该模型可对包括 Cage 内部在内的整个目标区域进行系统的组织形态计量学分析和偏振光显微镜观察，且使用未脱钙切片即可完成。因此，该模型能够评估在传统大鼠模型中难以量化的“Cage 内骨体积”和“骨成熟度”，为椎体间融合 Cage 材料及骨替代物的临床前评价提供了适宜的平台。颅侧区域表现出较高的骨体积、较高的板层骨比例以及较低的荧光标记，提示骨形成已接近完成并进入成熟阶段；而尾侧区域的结果则表明新骨形成仍处于活跃进行中。

与更接近临床生物力学环境（如轴向压缩和剪切力）及手术通路的腰椎大鼠模型（例如类似侧方腰椎椎间融合术XLIF的方法）相比，当前的尾椎模型具有不同...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4-0 尼龙缝线	Natsume	ER-25-30N2
明视野显微镜	Keyence. (大阪, 日本)	BZ-X800
布托尔芬	FUJIFILM	021-19001
钙绿素	FUJIFILM	76082
卡普罗芬	FUJIFILM	037-19761
头孢氨苄	FUJIFILM	036-11051
计算机图像分析器	System Supply Co. (长野, 日本)	Histometry RT CSS-840
用于荧光合并的共聚焦激光扫描显微镜	Carl Zeiss. (耶拿, 德国)	LSM 980
刮刀	Natsume	E-8-00
金刚钻显微切片机	Leica. (韦茨拉尔, 德国)	SP1600
电钻	TAMIYA	N/A	https://www.amazon.co.jp /%E3%82%BF%E3%83% 9F%E3%83%A4-%E3% 82%AF%E3%83%A9% E3%83%95%E3%83% 88%E3%83%84%E3% 83%BC%E3%83%A3% %E3%82%B7%E3%83% AA%E3%83%89%E3% 82%BA-No-42-%E9%9B %BB%E5%8B%95%E3% 83%8F%E3%83%B3%E3 %83%87%E3%82%A3 %E3%83%A5%E3%83% %A4%E3%83%BC%E3% 82%BF%E3%83%8B%E3 %83%95%E3%83%A3%E3 %83%89%E3%83%A9%E3 %83%A5%E3%83%87%E3 %83%AB%E7%94%A8%E5 %B7%A5%E5%85%B7/dp/B 01LZ05WWY/ref=sr_1_2?ad grpid=54785347873&dib=eyJ 2IjoiMSJ9.f61YHQv80N0nxws VOdlrIFtTsQoJICvSb4t4rVt97 FEBWkOo4ilX5O2lZH-5vADU HT9CRXO308QpVFqdBNli0C osd4iBSfSzEcKxP9HMX4DhiI S-Qko5ix33W7FjPQqpgTWbj3 CV_vBytnvfqvSyoGN9IB8445o 5Kc0pjeKPG-SRR3Ixpqr2-FT_ ZgUyWstoyQVFTcv_Rq_K4-E OWnuT41BBYtBh757EOAoBe z2lkCd6Psz99wZxfUuvzRUAH Ecq9QV6EmiT9LAY8dYYq08k aLt7Klqx2k-MdV8XbWRxgKk. 7TWzXBGA1PeNmB4me_Cz4 mMFAKBAv5H3YXAw_HPuLd E&dib_tag=se&hvadid=651687 588880&hvdev=c&hvexpln=0& hvlocphy=1009309&hvnetw=g& hvocijid=5538300633798619650 --&hvqmt=e&hvrand=55383006 33798619650&hvtargid=kwd-33 4267191534&hydadcr=4289_13 319726&jp-ad-ap=0&keywords= %E3%82%BF%E3%83%9F%E3 %83%A4+%E9%9B%BB%E5% 8B%95%E3%83%8F%E3%83% B3%E3%83%87%E3%82%A3% E3%83%89%E3%83%AC%E3% 83%AB&mcid=6b8ff8c984ba3d45 be477b407ef2d1ba&qid=1767395 580&sr=8-2
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美托咪定	FUJIFILM	135-17473
咪达唑仑	FUJIFILM	135-13791
夹具	ANEX	N/A	https://www.amazon.co.jp/%E3%82%