计算机辅助活性成分筛选与验证DONG药物用于发烧和咳嗽的探索

摘要

我们构建了一个多维的“成分-靶向-通路-疾病”网络，整合了网络药理学筛选、分子对接和LPS诱导的小鼠模型验证。通过明确关键参数的建立，能够高效识别通族民药——冷玉箫唐的活性成分，并验证可重复的工艺。

摘要

系统筛选和验证董族药物冷玉小唐（LYXT; 该方案建立了一套结合网络药理预测与实验验证的方法论流程，用于治疗发烧和咳嗽。首先，利用中医药理学数据库与分析平台（TCMSP），以口服生物利用度（OB）≥30%和药物相似度（DL≥）0.18为标准，筛查了LYXT的关键活性成分，并从多个疾病数据库中收集了相关的发热和咳嗽靶点。随后，构建了“成分-靶向-疾病”相互作用网络，并通过拓扑分析和基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）途径富集，确定了核心作用靶点（CYP3A4、POR）和关键信号通路（MAPK途径）。分子对接技术用于验证关键组分与核心靶标的结合能力。最后，通过鼻腔输注脂多糖（LPS）建立了慢性支气管炎小鼠模型，并验证了预测主要活性成分的体内抗炎疗效。结果显示，通过网络药理学筛选的成分如 β-胡萝卜素和萨帕诺尔在动物实验中表现出不同程度的抗炎效果，其机制可能涉及抑制 MAPK/p38 信号通路。该方案为传统民族药物活性成分的筛选和机制研究提供了可重复的范例。

引言

董医是传统中医（TCM）框架下的一种民族医学体系，由贵州、湖南和广西的董族人实践。它代表了他们几代人积累的经验知识。该体系融合了草药、针灸、骨骼定型、按摩、饮食疗法和灵修修行。其独特特征源于该群体历史上的地理隔离和口述传统，形成了一套独特且以实践为基础的药典，适应当地环境和文化信仰。

持续性发烧是一种当身体无法控制体温时产生的状况，是身体功能失调的信号，也是^{人体细胞自我}保护的重要功能。东族热药治疗方法多种多样。其中，发烧分为内热和外热。内热是指由内部疾病引起的热，外热则指由寒冷或创伤产生的^热量。外源性发热通常影响胃肠道功能³.东国医生使用冷退烧治疗发烧。在各种东药方中，冷玉小汤（LYXT）是一种用于发烧和止痛的标准煎剂，由精液（精液）、 马鞭草（Verbena officinalis L.）和黄油（ Zingiber officinale Roscoe）组成，这些药剂需持续捣碎并^与水混合。它主要用于感冒引起的发烧和头痛。

然而，LYXT的活性成分及其潜在分子机制仍不充分。为弥补这一空白，本研究采用网络药理学方法预测潜在活性成分和靶点。为验证这些预测，选定了一个成熟的脂多糖（LPS）诱导肺部炎症小鼠模型，因其模拟了与发热和咳嗽相关的关键炎症反应，包括白细胞浸润和促炎细胞因子的产生。

在药物发现过程中，多项研究显示化合物可以与多个蛋白质靶点相互作用。因此，“一种药物，一种生物靶点”的范式正在转向系统性药理学范式。与多种病毒或细菌生物靶蛋白相互作用的化合物可以提供有用的药^理效应5.网络药理分析是一种可行且有效的方法，可以减轻昂贵且漫长的药物发现过程。它可以帮助我们更好地理解药物间的相互作用，预测疾病的成因机制，建议替代药物以实现预期的药理效果且无副作用，并预测传统医学的生物活性。化学信息学方法、分子对接和数据建模已被成功应用于预测生物活性和分析机制。这些方法有助于快速发现具有临床潜力的抗病毒和抗菌化合物，同时也被用来解释药物的疗效和不良反应。例如，伊马替尼甲基酸盐是一种小分子，是慢性骨髓性白血病中导致因子Bcr-Abl的抑制剂，但它同时阻断多种酪氨酸激酶如Abl、Kit和PDGFR⁷的活性。因此，识别药物及其靶点的研究对于潜在治疗疾病仍然至关重要，这有助于我们理解药物化合物在分子层面治疗疾病的机制。计算建模和网络分析方法能够准确筛选潜在药物和靶点，乘法相互作用分析则为实验验证提供理论基础和实践指导。本文利用交互基因/蛋白质检索工具（STRING）、注释、可视化与整合发现数据库（DAVID）及其他数据库，结合动态基因本体（GO）分析和通路分析，收集了Dong medicine LYXT用于发烧和咳嗽的活性成分及相关作用蛋白数据，并探讨了活性成分联合处理的机制， 这为东药LYXT的进一步研究提供了具体的理论参考，提供了探索民族药物配方药理机制的可重复策略，并为新型抗炎药物的开发提供了见解。

方案

动物实验项目已由兰州大学实验动物伦理委员会（D2024-292）审查。它符合动物保护、动物福利和伦理原则，以及国家实验动物福利伦理的相关规定。

1. 数据库和软件的准备

1. 活性成分筛选与目标基因采集
   1. 访问中医药理学数据库和分析平台（TCMSP）（https://tcmsp-e.com/），并使用LYXT配方中每种草药的拉丁名称分别检索，即Semen Pharbitidis、 Verbena officinalis L.和 Zingiber officinale Roscoe，作为关键词检索与每种草药相关的所有化学化合物。
   2. 应用筛查标准过滤每种草药的化合物：对于 Verbena officinalis，口服生物利用度（OB）≥30.1%，药物相似度（DL）≥0.12;对于 辛吉伯官员 罗斯科，外≥60%，防守线≥0.13;对于精液法比蒂迪斯，产≥为16.93%，腹泻为0.50≥。然后，将三种草药的筛选化合物列表合并，并根据唯一的TCMSP标识去除重复条目，生成LYXT中的最终活性化合物列表。
   3. 将TCMSP数据库中与这些活性化合物相关的所有目标蛋白导出为包含化合物标识符和目标蛋白名称的表，然后将该目标蛋白列表导入UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）。
   4. 使用UniProtKB的ID映射工具，将所有目标蛋白名称转换为官方人类基因符号，并将映射方向从蛋白质名称映射到基因名称，并移除所有缺乏有效基因符号的条目，生成与LYXT活性组分相关的最终目标基因列表。
2. 疾病目标基因收集与重叠分析
   1. 通过分别使用“fever”和“cough”这两个关键词搜索，从GeneCards数据库（www.genecards.org）下载与发烧和咳嗽相关的基因，保留相关性评分≥为5的基因，并将两次搜索的结果合并到数据库中。
   2. 通过分别使用“发热”和“咳嗽”这两个关键词搜索，下载治疗目标数据库（TTD）（db.idrblab.net/ttd）中的发烧和咳嗽相关基因，下载所有相关目标基因，并将两次搜索结果合并在数据库中。
   3. 通过分别使用“fever”和“cough”这两个关键词搜索，下载PharmGkb数据库（www.pharmgkb.org）中与发烧和咳嗽相关的基因，下载所有相关基因，并在数据库中合并两次搜索的结果。
   4. 通过分别使用“发热”和“咳嗽”这两个关键词搜索，下载与发烧和咳嗽相关的 www.omim.org 基因，下载所有相关基因，并在数据库中合并两次搜索的结果。
   5. 通过分别使用“fever”和“cough”这两个关键词搜索，从DrugBank数据库^{（go.drugbank.com）} 8下载与发烧和咳嗽相关的基因，下载所有相关基因，并在数据库中合并两种搜索的结果。
   6. 将从五个数据库获得的基因列表合并为一个全面的列表，并去除重复的基因符号，生成最终的发烧和咳嗽相关疾病目标基因列表。
   7. 将步骤1.2.6的疾病目标列表与步骤1.1.4中的LYXT活性成分目标基因列表进行比较，选择两个列表共有的重叠基因，并将该重叠基因列表导出为CSV文件。
3. ID转换与截面分析
   1. 将步骤1.2.7中重叠的基因列表加载到R环境，访问DAVID网站（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）。
   2. 将重叠的基因列表上传到DAVID，将物种设置为 智人 ，列表类型设置为基因符号，然后执行功能注释工具进行横切面分析。
   3. 使用DAVID中的基因ID转换函数，将交叉蛋白的符号ID转换为集合ID，并将转换方向从基因符号映射到集合ID设定。
   4. 将转换后的集合ID列表及原始基因符号导出为CSV文件，用于下游富集分析。

2. 筛选关键活性成分和目标蛋白

1. 复合靶点网络构建
   1. 将步骤1.2.7的交叉基因列表和步骤1.1.4的LYXT活性成分目标基因列表加载到R环境中，然后进行比较分析，以识别与目标基因和交叉基因相关的化合物。
   2. 将化合物-靶点关系数据导入Cytoscape 3.8.1版本，生成“LYXT-Fever与咳嗽靶点”网络图，以可视化活性成分与其相关靶点之间的相互作用。
2. 蛋白质-蛋白质相互作用数据采集
   1. 将步骤2.1.1中获得的LYXT活性成分靶点与发热及咳嗽靶点交汇的基因ID文件导入https：//stringdb.org/STRING数据库，选择智 人 作为物种，选择多种蛋白作为数据处理方法。
   2. 通过将置信阈值设为≥ 0.90，并分离相关性极低的蛋白质，对蛋白质-蛋白质相互作用进行过滤，然后生成包含过滤后相互作用数据的TSV文件以供后续分析。
3. 交点分析确认
   1. 利用R语言分析活性成分的目标蛋白与发热和咳嗽的目标蛋白的交集，确认步骤1.2.7中识别的重叠基因集。
   2. 准备这套已确认的重叠基因集，用于后续的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析。

3. 关键靶蛋白的筛选

1. PPI网络可视化
   1. 将步骤2.2.2的过滤交互数据导入Cytoscape 3.8.1版本，使用网络可视化工具绘制PPI网络图。
   2. 在 Cytoscape 中安装并打开 CytoNCA 插件，然后使用该插件对网络中每个节点计算以下参数进行拓扑分析：度中心性（DC）、介于中心性（BC）、接近中心性（CC）、特征向量中心性（EC）、网络中心性（NC）和局部平均连通性（LAC）。
2. 利用基于中位数筛选的关键目标蛋白识别
   1. 将从 CytoNCA 导出计算出的拓扑参数表，作为包含所有节点标识符及其对应 DC、BC、CC、EC、NC 和 LAC 值的 CSV 文件。
   2. 计算网络中所有节点的度中心性（DC）中位数，并识别所有DC大于中位数两倍的节点。
   3. 计算网络中所有节点的接近中心性（CC）和中间中心性（BC）的中位数，然后从步骤3.2.2中识别的节点中，只保留同时满足CC大于中位数和BC大于中位数的节点，遵循Kibble等人9所述的筛选^方法。
3. 最终密钥目标编译
   1. 将步骤3.2.3中保留节点的标识符汇编成关键目标蛋白列表，并导出为CSV文件。
   2. 将基于中位数的筛选规则（DC大于中位数的两倍，CC大于中位数，BC大于中位数）作为全稿关键目标识别的唯一标准，确保与协议中统一筛查方法保持一致。

4. 去攴烯浓缩分析与KEGG途径分析

1. 使用DAVID数据库的功能丰富分析
   1. 按照田边等人¹⁰所描述的方法，将第1.3.4步的交集基因列表以基因符号格式上传到DAVID数据库，https://david.ncifcrf.gov/ 时将物种设置为智 人，列表类型设置为基因符号。
   2. 通过选择生物过程的 GOTERM_BP_DIRECT ，细胞组分的 GOTERM_CC_DIRECT ，分子功能的 GOTERM_MF_DIRECT ，进行 GO 富集分析，选择 KEGG_PATHWAY 进行 KEGG 途径富集分析。
   3. 将显著性阈值设为p < 0.05，并对多次检测应用Benjamini-Hochberg假发现率（FDR）修正，然后下载富含结果的CSV文件，包含术语名、基因计数、p值、FDR调整后的p值及相关基因。
2. 利用OmicShare云平台生成气泡图
   1. 将步骤4.1.3的GO浓缩结果导入OmicShare云平台，https://www.omicshare.com/tools 选择GO浓缩气泡图工具。
   2. 上传包含术语名称、基因计数和p值的结果文件，然后配置工具显示p值最低的前20个术语。
   3. 将横轴设为富集比，纵轴表示 GO 术语，气泡大小表示基因计数，气泡颜色表示 p 值。
   4. 生成气泡图并下载为高分辨率图像文件。
3. 使用KEGG映射器的KEGG通路可视化
   1. 按p值从高到低排序KEGG通路富集结果，并选择p值最小的前20条通路。
   2. 对于每条选定通路，访问 https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html 的KEGG数据库以获取通路图。
   3. 通过交叉比对富集结果中的通路基因集，识别出在各通路中存在的交叉基因列表中的目标蛋白。
   4. https://www.kegg.jp/kegg/mapper/ 访问 KEGG 映射工具，选择 颜色通路 功能，输入交叉基因符号列表和 KEGG 通路标识符，生成一个颜色编码的通路图，并以红色高亮标出已识别的目标蛋白。
   5. 汇总所有富集分析输出，包括三类的GO富集CSV文件、KEGG通路富集CSV文件、气泡图图像以及前20条通路的彩色通路图，然后导出这些文件供后续分析。

5. 分子对接验证

1. https://www.rcsb.org/ 年从RCSB PDB数据库下载重要蛋白的三维结构（如CYP3A4和POR，这些被识别为网络分析的关键靶点），选择智 人 中分辨率≤为2.5 Å、含有共结晶配体的结构以定义活性位点，并下载活性化合物（包括β-胡萝卜素， 来自PubChem数据库中的SDF格式的spathulenol和β-sitosterol。
2. 利用AutoDockTools去除水分子和共结晶配体，添加极性氢并赋予Gasteiger电荷，制备蛋白质后保存PDBQT格式，使用 Open Babel将化合物SDF文件转换为PDB格式，在AutoDockTools中检测每个配体的可旋转键，并将配体保存为PDBQT格式。
3. 定义尺寸为60×60×60 Å的对接网格框，中心为共结配体结合位点坐标，然后使用AutoDock Vina进行分子对接，穷尽性设为8，num_modes设为10，为每对配体-蛋白质生成10个结合姿态。
4. 将生成的对接文件及其对应的目标文件导入PyMOL，识别并保存结合能最低（负值最高）的对接模型作为代表姿态。
5. 然后将该模型提交到 https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/ 的PLIP数据库，分析小分子与蛋白质之间的相互作用，包括氢键、疏水相互作用、π堆叠和盐桥。
6. 计算并汇总LYXT中所有活性成分与发烧和咳嗽相关的目标蛋白的结合能，然后生成包含化合物名称、目标蛋白、结合能（kcal/mol）及关键相互作用类型的汇总表，供结果部分展示。
   注意：用于网络药理学分析的R脚本可在 补充文件1中找到。

6. 动物实验

1. 实验时间线
   1. 动物适应一周，第0天进行LPS或生理盐水注射，第7天至第20天每日用药治疗2周，第21天进行安乐死并采集样本。
2. 动物获取与分组
   1. 购买60只成年雄性C57BL/6只体重25±±4克的小鼠，喂食1周，然后随机分为正常盐水组（6只）和LPS受伤组（54只）。
   2. 在治疗开始前第7天，将LPS损伤组进一步随机分为七个亚组，每组6只小鼠：模型组、阳性组（地塞米松，50 mg·kg·¹·^d-1）、LYXT治疗组（200 mg·^kg-1·^d-1）、β-胡萝卜素组（50 mg·kg-1·^d-1）、spathulenol组（50 mg·^kg-1·^d-1）， 以及β-植物甾醇组（50 mg·^kg-1·^d-1）。
      注：治疗施用和结局评估均采用盲法进行。
3. LPS诱导肺炎症模型
   1. 麻醉时通过腹腔注射2%戊巴比妥钠，剂量为60 mg/kg。通过无尾部夹紧反应确认麻醉深度适中。最后，根据记录的体重计算LPS所需的注射量，浓度为10 mg/mL。
   2. 准备鼻用，方法是将精确计算的LPS溶液抽入移液器。用右手抓住老鼠尾巴根部，左手用拇指和食指轻轻固定其耳朵的头部。
   3. 缓慢排出液体，直到移液器尖端形成一个小液滴（约2微升）。小心地将水滴靠近老鼠的右鼻孔，直到接触到。立即且迅速地将左手向上抬起30–40厘米，然后轻轻将左手和鼠标一同回到起始位置。
      注意：保持鼠标上方状态需要注意老鼠的鼻孔。
   4. 同样的方法将小液体滴入小鼠的左鼻孔，然后依次加入左右鼻孔，直到液体输注完成。
   5. 然后松开鼠标，用胶带固定鼠标在鼠标板上，保持腹部抬起、头部抬起的姿势超过4小时。老鼠醒来后，按照Lorenz等人描述的方法将其放回笼中^观察。
4. 支气管肺泡洗液收集
   1. 将LPS受损组小鼠随机分为七组：阴性对照组、模型组、阳性组（地塞米松，50只 ^mg.kg-1.d-1）、LYXT治疗组（200只 ^mg.kg-1.d-1）、β-胡萝卜素组（50 ^mg.kg-1.d-1）、巴硅烯组（50 mg.kg-1.d-1）和β-西托甾醇组（50 mg.kg-1.d-1），每组6只。
      注意：调制LYXT时，按以下方式：混合Pharbitis nil （L.） Choisy、Verbena officinalis L.和Zingiber officinale Roscoe粉末，质量比为5：3：2。 将粉末与水混合，比例为1：30（克/毫升），并以80°C回流2小时。过滤并浓缩溶液（30°C，0.01–0.08兆帕），溶解于水中制成2克/毫升溶液。β-胡萝卜素、β-植物甾醇和斯帕舍烯醇作为实验验证的参考标准。每组每天给各组注射药物，持续2周，从LPS治疗后1周开始。根据Jin等人的观点，动物被安乐死，使用过量硫喷妥钠（100毫克/公斤）。
   2. 用23号导管插管心室。然后，在25厘米H₂O压力下缓慢注射10毫升PBS到肺组织，重复约6次灌洗，以获得支气管肺泡灌洗液（BALF），方法由Pinheiro等人描述。
5. BALF和血清中的白细胞和细胞因子分析
   1. 将收集的BALF以500× 克 离心，4°C离心10分钟。 将细胞沉淀重新悬浮于1毫升PBS中，1：10稀释于锥蓝，并用400×倍率在光学显微镜下用血细胞计计数总白细胞。
   2. 采集心脏穿刺时的BALF上清液和血清样本。
   3. 按照制造商说明，使用商业ELISA试剂盒测量TNF-α、IL-1β和IL-18浓度，使用微板读取器读取450纳米的吸收度，并根据标准曲线计算浓度。利用BCA检测法确定BALF中的蛋白质浓度。
6. 通过HE和WB分析验证活性成分
   1. 为识别促进LYXT疗效的活性成分，请根据第6.3节重新建立LPS诱导的肺炎症模型。
   2. 购买60只小鼠，适应一周，并随机分为五组（每组n = 12）：模型组、LYXT组（200 mg·kg^·1·^d-1）、β-胡萝卜素组（50 mg·^kg-1·^d-1）、spathulenol组（50 mg·^kg-1·^d-1）和组合组（各25 mg·kg·¹·^d-1 ）。
   3. 在第0天施打LPS，第7天至第20天进行治疗，按照第6.3步描述。第21天采集肺组织¹⁴。
7. 组织学分析
   1. 将左肺上叶固定在4%对甲醛中24小时，嵌入石蜡中，切开5微米切片，并进行血液素和伊红（HE）染色。
   2. 在200×和400×放大率下观察切片，以评估炎症细胞浸润和肺泡壁增厚。拍摄具有代表性的图像。
8. 西部墨迹分析
   1. 在放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液中均质化肺组织，并使用蛋白酶和磷酸酶抑制剂。在12,000克×离心机下，温度为 4°C，持续15分钟，并利用双碳酸（BCA）测定蛋白浓度。
   2. 将每孔30微克蛋白质加载到十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶上，转移至聚氟乙烯（PVDF）膜，并用5%脱脂牛奶封闭。
   3. 在4°C下与针对p-p38、p38、TNF-α、IL-1β、IL-18和β-肌动蛋白的初级抗体一起孵育，然后用HRP结合的二级抗体孵育。
      注意：抗体稀释量详见 材料表。
   4. 使用ECL基底可视化条带，捕捉图像，并使用ImageJ量化强度。将目标蛋白表达归一化为β-肌动蛋白或总p38。

结果

TCMSP数据库被用来收集409种活性LYXT成分。其中，58种成分来自Verbena officinalis L.，86种来自Semen Pharbitidis，265种活性成分来自 Zingiber officinale Roscoe。根据指数筛查了26种关键活性成分， Verbena officinalis L.≥30.1%，DL≥为0.12，O≥B为60%，D≥为0.13，OB为16.93%，≥DL为0.50，适用于Verbena officinalis L.，OB≥为0.50，适用于Pharbitidis（表1）。

通过对LYXT活性成分的交叉分析，获得了27个相互作用蛋白。其相关的发烧和咳嗽蛋白从String数据库导入，并获得了蛋白质相互作用图（见图1）。节点代表蛋白质，边代表蛋白质之间的相互作用，较粗的边缘（连接）代表更稳健的关联。

讨论

本文成功鉴定了LYXT的26种活性成分和207个潜在靶点，LYXT是一种用于发烧和止咳的传统药剂。主要发现包括通过网络拓扑分析鉴定CYP3A4为关键靶蛋白，以及在LPS诱导肺部炎症模型中实验验证LYXT、β-胡萝卜素和斯帕舍烯醇作为具有显著抗炎效果的活性化合物。这些发现通过结合网络药理学（数据库筛选、PPI网络分析和分子对接）与 体内 实验验证（BALF白细胞计数、细胞因子测量、组织学和西方墨迹）相结合的方法实现。

首先，一个独特的中药系统药理学平台TCMSP，捕捉了疾病、药物和靶点之间的关系。本研究利用TCMSP平台寻找LYXT中发烧和咳嗽的关键成分，并通过分子结合评估活性成分和靶点的结合亲和力。本研究通过以下筛选标准识别了26种LYXT关键活性成分和207种目标蛋白： 对于马鞭草， 口服生物利用度（OB）≥30.1%，药物相似性（DL）≥0.12; Zingiber 官 员 Roscoe，外科医生，≥ 60.0%，防守线≥ 0.13%;精液法比蒂迪斯≥产科医...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
反伊尔-18	Proteintech，中国武汉	27095-1-AP	兔子多克隆，1：500
抗 IL-1 和 β;	Proteintech，中国武汉	66737-1-Ig	小鼠单克隆，1：500
反p38	Proteintech，中国武汉	14064-1-AP	兔子多克隆，1：1000
反p-p38	Proteintech，中国武汉	28796-1-AP	兔子多克隆，1：1000
抗TNF和α;	Proteintech，中国武汉	80258-6-RR	兔子单克隆，1：500
抗β-肌动蛋白	Proteintech，中国武汉	66009-1-Ig	小鼠单克隆，1：2000
AutoDock Vina	https://vina.scripps.edu/	版本 1.5.6	分子对接软件
AutoDockTools	https://autodock.scripps.edu/	版本 1.5.6	分子对接制备工具
BCA蛋白质检测套件	美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的Thermo Fisher Scientific公司	23225	用于蛋白质浓度测定
β-胡萝卜素	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	83-46-5	高纯度标准，>95%
β-西桃甾醇	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	83-46-5	高纯度标准，>95%
C57BL/6鼠标	兰州大学医用动物中心及NBSP;	-	成年男性，25岁及以上;4克
细胞景象	https://cytoscape.org/	版本 3.8.1	网络可视化与分析软件
地塞米松	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	D4902	正向对照
ECL基底	美国马萨诸塞州伯灵顿MilliporeSigma	WBKLS0500	用于西方墨迹检测
ELISA套件
GraphPad 棱镜	https://www.graphpad.com/	版本8.0及以上	统计分析与绘图软件
血液素和嗜青（H&E）染色套件	北京太阳生物科学与科技有限公司，中国北京	G1120	用于肺组织染色
组织学
HRP共轭反鼠	Proteintech，中国武汉	SA00001-7G	二级抗体，1：5000
HRP结合的反兔子	Proteintech，中国武汉	SA00001-7H	二级抗体，1：5000
IL-18 ELISA套件	北京太阳生物科学与科技有限公司，中国北京	SEKH-0016	用于测量BALF中的IL-18和血清
IL-1&β;ELISA套件	北京太阳生物科学与科技有限公司，中国北京	SEKM-0004	用于测量IL-1和β;在BALF和血清中
图片J	https://imagej.nih.gov/ij/	版本 1.53	图像分析软件
脂多糖（LPS）	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	L2630	摘自nbsp;大肠杆菌 O111：B4
LYXT原材料	淮华大学	-	粉末混合物;法比提斯无;（左）乔伊西，nbsp;官方马鞭草 L.，  官员Zingiber  罗斯科（5：3：2，双/白/白）
其他材料
戊巴比妥钠	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	P3761	2%溶液用于麻醉
PLIP	https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/	-	蛋白质-配体相互作用剖析仪
PVDF膜	美国马萨诸塞州伯灵顿MilliporeSigma	IPVH00010	用于西方印迹转移
PyMOL	https://pymol.org/	版本 2.5	分子可视化软件
R	https://www.r-project.org/	版本4.0及以上	统计计算与图形软件
斯帕图勒诺尔	MedChemExpress，美国新泽西州蒙茅斯交汇处	HY-N1205	高纯度标准，>95%
弦	https://stringdb.org/	-	检索相互作用基因/蛋白质的工具
TCMSP	https://tcmsp-e.com/	-	中医系统药理学数据库
硫喷妥钠	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	T102	为了安乐死
TNF和α;ELISA套件	北京太阳生物科学与科技有限公司，中国北京	SEKM-0034	用于测量TNF和α;在BALF和血清中
UniProt	https://www.uniprot.org/	-	蛋白质序列与注释数据库