计算机辅助活性成分筛选与验证DONG药物用于发烧和咳嗽的探索

摘要

我们构建了一个多维的“成分-靶向-通路-疾病”网络，整合了网络药理学筛选、分子对接和LPS诱导的小鼠模型验证。通过明确关键参数的建立，能够高效识别通族民药——冷玉箫唐的活性成分，并验证可重复的工艺。

摘要

系统筛选和验证董族药物冷玉小唐（LYXT; 该方案建立了一套结合网络药理预测与实验验证的方法论流程，用于治疗发烧和咳嗽。首先，利用中医药理学数据库与分析平台（TCMSP），以口服生物利用度（OB）≥30%和药物相似度（DL≥）0.18为标准，筛查了LYXT的关键活性成分，并从多个疾病数据库中收集了相关的发热和咳嗽靶点。随后，构建了“成分-靶向-疾病”相互作用网络，并通过拓扑分析和基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）途径富集，确定了核心作用靶点（CYP3A4、POR）和关键信号通路（MAPK途径）。分子对接技术用于验证关键组分与核心靶标的结合能力。最后，通过鼻腔输注脂多糖（LPS）建立了慢性支气管炎小鼠模型，并验证了预测主要活性成分的体内抗炎疗效。结果显示，通过网络药理学筛选的成分如 β-胡萝卜素和萨帕诺尔在动物实验中表现出不同程度的抗炎效果，其机制可能涉及抑制 MAPK/p38 信号通路。该方案为传统民族药物活性成分的筛选和机制研究提供了可重复的范例。

引言

董医是传统中医（TCM）框架下的一种民族医学体系，由贵州、湖南和广西的董族人实践。它代表了他们几代人积累的经验知识。该体系融合了草药、针灸、骨骼定型、按摩、饮食疗法和灵修修行。其独特特征源于该群体历史上的地理隔离和口述传统，形成了一套独特且以实践为基础的药典，适应当地环境和文化信仰。

持续性发烧是一种当身体无法控制体温时产生的状况，是身体功能失调的信号，也是^{人体细胞自我}保护的重要功能。东族热药治疗方法多种多样。其中，发烧分为内热和外热。内热是指由内部疾病引起的热，外热则指由寒冷或创伤产生的^热量。外源性发热通常影响胃肠道功能³.东国医生使用冷退烧治疗发烧。在各种东药方中，冷玉小汤（LYXT）是一种用于发烧和止痛的标准煎剂，由精液（精液）、 马鞭草（Verbena officinalis L.）和黄油（ Zingiber officinale Roscoe）组成，这些药剂需持续捣碎并^与水混合。它主要用于感冒引起的发烧和头痛。

然而，LYXT的活性成分及其潜在分子机制仍不充分。为弥补这一空白，本研究采用网络药理学方法预测潜在活性成分和靶点。为验证这些预测，选定了一个成熟的脂多糖（LPS）诱导肺部炎症小鼠模型，因其模拟了与发热和咳嗽相关的关键炎症反应，包括白细胞浸润和促炎细胞因子的产生。

在药物发现过程中，多项研究显示化合物可以与多个蛋白质靶点相互作用。因此，“一种药物，一种生物靶点”的范式正在转向系统性药理学范式。与多种病毒或细菌生物靶蛋白相互作用的化合物可以提供有用的药^理效应5.网络药理分析是一种可行且有效的方法，可以减轻昂贵且漫长的药物发现过程。它可以帮助我们更好地理解药物间的相互作用，预测疾病的成因机制，建议替代药物以实现预期的药理效果且无副作用，并预测传统医学的生物活性。化学信息学方法、分子对接和数据建模已被成功应用于预测生物活性和分析机制。这些方法有助于快速发现具有临床潜力的抗病毒和抗菌化合物，同时也被用来解释药物的疗效和不良反应。例如，伊马替尼甲基酸盐是一种小分子，是慢性骨髓性白血病中导致因子Bcr-Abl的抑制剂，但它同时阻断多种酪氨酸激酶如Abl、Kit和PDGFR⁷的活性。因此，识别药物及其靶点的研究对于潜在治疗疾病仍然至关重要，这有助于我们理解药物化合物在分子层面治疗疾病的机制。计算建模和网络分析方法能够准确筛选潜在药物和靶点，乘法相互作用分析则为实验验证提供理论基础和实践指导。本文利用交互基因/蛋白质检索工具（STRING）、注释、可视化与整合发现数据库（DAVID）及其他数据库，结合动态基因本体（GO）分析和通路分析，收集了Dong medicine LYXT用于发烧和咳嗽的活性成分及相关作用蛋白数据，并探讨了活性成分联合处理的机制， 这为东药LYXT的进一步研究提供了具体的理论参考，提供了探索民族药物配方药理机制的可重复策略，并为新型抗炎药物的开发提供了见解。

方案

动物实验项目已由兰州大学实验动物伦理委员会（D2024-292）审查。它符合动物保护、动物福利和伦理原则，以及国家实验动物福利伦理的相关规定。

1. 数据库和软件的准备

1. 活性成分筛选与目标基因采集
   1. 访问中医药理学数据库和分析平台（TCMSP）（https://tcmsp-e.com/），并使用LYXT配方中每种草药的拉丁名称分别检索，即Semen Pharbitidis、 Verbena officinalis L.和 Zingiber officinale Roscoe，作为关键词检索与每种草药相关的所有化学化合物。
   2. 应用筛查标准过滤每种草药的化合物：对于 Verbena officinalis，口服生物利用度（OB）≥30.1%，药物相似度（DL）≥0.12;对于 辛吉伯官员 罗斯科，外≥60%，防守线≥0.13;对于精液法比蒂迪斯，产≥为16.93%，腹泻为0.50≥。然后，将三种草药的筛选化合物列表合并，并根据唯一的TCMSP标识去除重复条目，生成LYXT中的最终活性化合物列表。
   3. 将TCMSP数据库中与这些活性化合物相关的所有目标蛋白导出为包含化合物标识符和目标蛋白名称的表，然后将该目标蛋白列表导入UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）。
   4. 使用UniProtKB的ID映射工具，将所有目标蛋白名称转换为官方人类基因符号，并将映射方向从蛋白质名称映射到基因名称，并移除所有缺乏有效基因符号的条目，生成与LYXT活性组分相关的最终目标基因列表。
2. 疾病目标基因收集与重叠分析
   1. 通过分别使用“fever”和“cough”这两个关键词搜索，从GeneCards数据库（www.genecards.org）下载与发烧和咳嗽相关的基因，保留相关性评分≥为5的基因，并将两次搜索的结果合并到数据库中。
   2. 通过分别使用“发热”和“咳嗽”这两个关键词搜索，下载治疗目标数据库（TTD）（db.idrblab.net/ttd）中的发烧和咳嗽相关基因，下载所有相关目标基因，并将两次搜索结果合并在数据库中。
   3. 通过分别使用“fever”和“cough”这两个关键词搜索，下载PharmGkb数据库（www.pharmgkb.org）中与发烧和咳嗽相关的基因，下载所有相关基因，并在数据库中合并两次搜索的结果。
   4. 通过分别使用“发热”和“咳嗽”这两个关键词搜索，下载与发烧和咳嗽相关的 www.omim.org 基因，下载所有相关基因，并在数据库中合并两次搜索的结果。
   5. 通过分别使用“fever”和“cough”这两个关键词搜索，从DrugBank数据库^{（go.drugbank.com）} 8下载与发烧和咳嗽相关的基因，下载所有相关基因，并在数据库中合并两种搜索的结果。
   6. 将从五个数据库获得的基因列表合并为一个全面的列表，并去除重复的基因符号，生成最终的发烧和咳嗽相关疾病目标基因列表。
   7. 将步骤1.2.6的疾病目标列表与步骤1.1.4中的LYXT活性成分目标基因列表进行比较，选择两个列表共有的重叠基因，并将该重叠基因列表导出为CSV文件。
3. ID转换与截面分析
   1. 将步骤1.2.7中重叠的基因列表加载到R环境，访问DAVID网站（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）。
   2. 将重叠的基因列表上传到DAVID，将物种设置为 智人 ，列表类型设置为基因符号，然后执行功能注释工具进行横切面分析。
   3. 使用DAVID中的基因ID转换函数，将交叉蛋白的符号ID转换为集合ID，并将转换方向从基因符号映射到集合ID设定。
   4. 将转换后的集合ID列表及原始基因符号导出为CSV文件，用于下游富集分析。

2. 筛选关键活性成分和目标蛋白

1. 复合靶点网络构建
   1. 将步骤1.2.7的交叉基因列表和步骤1.1.4的LYXT活性成分目标基因列表加载到R环境中，然后进行比较分析，以识别与目标基因和交叉基因相关的化合物。
   2. 将化合物-靶点关系数据导入Cytoscape 3.8.1版本，生成“LYXT-Fever与咳嗽靶点”网络图，以可视化活性成分与其相关靶点之间的相互作用。
2. 蛋白质-蛋白质相互作用数据采集
   1. 将步骤2.1.1中获得的LYXT活性成分靶点与发热及咳嗽靶点交汇的基因ID文件导入https：//stringdb.org/STRING数据库，选择智 人 作为物种，选择多种蛋白作为数据处理方法。
   2. 通过将置信阈值设为≥ 0.90，并分离相关性极低的蛋白质，对蛋白质-蛋白质相互作用进行过滤，然后生成包含过滤后相互作用数据的TSV文件以供后续分析。
3. 交点分析确认
   1. 利用R语言分析活性成分的目标蛋白与发热和咳嗽的目标蛋白的交集，确认步骤1.2.7中识别的重叠基因集。
   2. 准备这套已确认的重叠基因集，用于后续的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析。

3. 关键靶蛋白的筛选

1. PPI网络可视化
   1. 将步骤2.2.2的过滤交互数据导入Cytoscape 3.8.1版本，使用网络可视化工具绘制PPI网络图。
   2. 在 Cytoscape 中安装并打开 CytoNCA 插件，然后使用该插件对网络中每个节点计算以下参数进行拓扑分析：度中心性（DC）、介于中心性（BC）、接近中心性（CC）、特征向量中心性（EC）、网络中心性（NC）和局部平均连通性（LAC）。
2. 利用基于中位数筛选的关键目标蛋白识别
   1. 将从 CytoNCA 导出计算出的拓扑参数表，作为包含所有节点标识符及其对应 DC、BC、CC、EC、NC 和 LAC 值的 CSV 文件。
   2. 计算网络中所有节点的度中心性（DC）中位数，并识别所有DC大于中位数两倍的节点。
   3. 计算网络中所有节点的接近中心性（CC）和中间中心性（BC）的中位数，然后从步骤3.2.2中识别的节点中，只保留同时满足CC大于中位数和BC大于中位数的节点，遵循Kibble等人9所述的筛选^方法。
3. 最终密钥目标编译
   1. 将步骤3.2.3中保留节点的标识符汇编成关键目标蛋白列表，并导出为CSV文件。
   2. 将基于中位数的筛选规则（DC大于中位数的两倍，CC大于中位数，BC大于中位数）作为全稿关键目标识别的唯一标准，确保与协议中统一筛查方法保持一致。

4. 去攴烯浓缩分析与KEGG途径分析

1. 使用DAVID数据库的功能丰富分析
   1. 按照田边等人¹⁰所描述的方法，将第1.3.4步的交集基因列表以基因符号格式上传到DAVID数据库，https://david.ncifcrf.gov/ 时将物种设置为智 人，列表类型设置为基因符号。
   2. 通过选择生物过程的 GOTERM_BP_DIRECT ，细胞组分的 GOTERM_CC_DIRECT ，分子功能的 GOTERM_MF_DIRECT ，进行 GO 富集分析，选择 KEGG_PATHWAY 进行 KEGG 途径富集分析。
   3. 将显著性阈值设为p < 0.05，并对多次检测应用Benjamini-Hochberg假发现率（FDR）修正，然后下载富含结果的CSV文件，包含术语名、基因计数、p值、FDR调整后的p值及相关基因。
2. 利用OmicShare云平台生成气泡图
   1. 将步骤4.1.3的GO浓缩结果导入OmicShare云平台，https://www.omicshare.com/tools 选择GO浓缩气泡图工具。
   2. 上传包含术语名称、基因计数和p值的结果文件，然后配置工具显示p值最低的前20个术语。
   3. 将横轴设为富集比，纵轴表示 GO 术语，气泡大小表示基因计数，气泡颜色表示 p 值。
   4. 生成气泡图并下载为高分辨率图像文件。
3. 使用KEGG映射器的KEGG通路可视化
   1. 按p值从高到低排序KEGG通路富集结果，并选择p值最小的前20条通路。
   2. 对于每条选定通路，访问 https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html 的KEGG数据库以获取通路图。
   3. 通过交叉比对富集结果中的通路基因集，识别出在各通路中存在的交叉基因列表中的目标蛋白。
   4. https://www.kegg.jp/kegg/mapper/ 访问 KEGG 映射工具，选择 颜色通路 功能，输入交叉基因符号列表和 KEGG 通路标识符，生成一个颜色编码的通路图，并以红色高亮标出已识别的目标蛋白。
   5. 汇总所有富集分析输出，包括三类的GO富集CSV文件、KEGG通路富集CSV文件、气泡图图像以及前20条通路的彩色通路图，然后导出这些文件供后续分析。

5. 分子对接验证

1. https://www.rcsb.org/ 年从RCSB PDB数据库下载重要蛋白的三维结构（如CYP3A4和POR，这些被识别为网络分析的关键靶点），选择智 人 中分辨率≤为2.5 Å、含有共结晶配体的结构以定义活性位点，并下载活性化合物（包括β-胡萝卜素， 来自PubChem数据库中的SDF格式的spathulenol和β-sitosterol。
2. 利用AutoDockTools去除水分子和共结晶配体，添加极性氢并赋予Gasteiger电荷，制备蛋白质后保存PDBQT格式，使用 Open Babel将化合物SDF文件转换为PDB格式，在AutoDockTools中检测每个配体的可旋转键，并将配体保存为PDBQT格式。
3. 定义尺寸为60×60×60 Å的对接网格框，中心为共结配体结合位点坐标，然后使用AutoDock Vina进行分子对接，穷尽性设为8，num_modes设为10，为每对配体-蛋白质生成10个结合姿态。
4. 将生成的对接文件及其对应的目标文件导入PyMOL，识别并保存结合能最低（负值最高）的对接模型作为代表姿态。
5. 然后将该模型提交到 https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/ 的PLIP数据库，分析小分子与蛋白质之间的相互作用，包括氢键、疏水相互作用、π堆叠和盐桥。
6. 计算并汇总LYXT中所有活性成分与发烧和咳嗽相关的目标蛋白的结合能，然后生成包含化合物名称、目标蛋白、结合能（kcal/mol）及关键相互作用类型的汇总表，供结果部分展示。
   注意：用于网络药理学分析的R脚本可在 补充文件1中找到。

6. 动物实验

1. 实验时间线
   1. 动物适应一周，第0天进行LPS或生理盐水注射，第7天至第20天每日用药治疗2周，第21天进行安乐死并采集样本。
2. 动物获取与分组
   1. 购买60只成年雄性C57BL/6只体重25±±4克的小鼠，喂食1周，然后随机分为正常盐水组（6只）和LPS受伤组（54只）。
   2. 在治疗开始前第7天，将LPS损伤组进一步随机分为七个亚组，每组6只小鼠：模型组、阳性组（地塞米松，50 mg·kg·¹·^d-1）、LYXT治疗组（200 mg·^kg-1·^d-1）、β-胡萝卜素组（50 mg·kg-1·^d-1）、spathulenol组（50 mg·^kg-1·^d-1）， 以及β-植物甾醇组（50 mg·^kg-1·^d-1）。
      注：治疗施用和结局评估均采用盲法进行。
3. LPS诱导肺炎症模型
   1. 麻醉时通过腹腔注射2%戊巴比妥钠，剂量为60 mg/kg。通过无尾部夹紧反应确认麻醉深度适中。最后，根据记录的体重计算LPS所需的注射量，浓度为10 mg/mL。
   2. 准备鼻用，方法是将精确计算的LPS溶液抽入移液器。用右手抓住老鼠尾巴根部，左手用拇指和食指轻轻固定其耳朵的头部。
   3. 缓慢排出液体，直到移液器尖端形成一个小液滴（约2微升）。小心地将水滴靠近老鼠的右鼻孔，直到接触到。立即且迅速地将左手向上抬起30–40厘米，然后轻轻将左手和鼠标一同回到起始位置。
      注意：保持鼠标上方状态需要注意老鼠的鼻孔。
   4. 同样的方法将小液体滴入小鼠的左鼻孔，然后依次加入左右鼻孔，直到液体输注完成。
   5. 然后松开鼠标，用胶带固定鼠标在鼠标板上，保持腹部抬起、头部抬起的姿势超过4小时。老鼠醒来后，按照Lorenz等人描述的方法将其放回笼中^观察。
4. 支气管肺泡洗液收集
   1. 将LPS受损组小鼠随机分为七组：阴性对照组、模型组、阳性组（地塞米松，50只 ^mg.kg-1.d-1）、LYXT治疗组（200只 ^mg.kg-1.d-1）、β-胡萝卜素组（50 ^mg.kg-1.d-1）、巴硅烯组（50 mg.kg-1.d-1）和β-西托甾醇组（50 mg.kg-1.d-1），每组6只。
      注意：调制LYXT时，按以下方式：混合Pharbitis nil （L.） Choisy、Verbena officinalis L.和Zingiber officinale Roscoe粉末，质量比为5：3：2。 将粉末与水混合，比例为1：30（克/毫升），并以80°C回流2小时。过滤并浓缩溶液（30°C，0.01–0.08兆帕），溶解于水中制成2克/毫升溶液。β-胡萝卜素、β-植物甾醇和斯帕舍烯醇作为实验验证的参考标准。每组每天给各组注射药物，持续2周，从LPS治疗后1周开始。根据Jin等人的观点，动物被安乐死，使用过量硫喷妥钠（100毫克/公斤）。
   2. 用23号导管插管心室。然后，在25厘米H₂O压力下缓慢注射10毫升PBS到肺组织，重复约6次灌洗，以获得支气管肺泡灌洗液（BALF），方法由Pinheiro等人描述。
5. BALF和血清中的白细胞和细胞因子分析
   1. 将收集的BALF以500× 克 离心，4°C离心10分钟。 将细胞沉淀重新悬浮于1毫升PBS中，1：10稀释于锥蓝，并用400×倍率在光学显微镜下用血细胞计计数总白细胞。
   2. 采集心脏穿刺时的BALF上清液和血清样本。
   3. 按照制造商说明，使用商业ELISA试剂盒测量TNF-α、IL-1β和IL-18浓度，使用微板读取器读取450纳米的吸收度，并根据标准曲线计算浓度。利用BCA检测法确定BALF中的蛋白质浓度。
6. 通过HE和WB分析验证活性成分
   1. 为识别促进LYXT疗效的活性成分，请根据第6.3节重新建立LPS诱导的肺炎症模型。
   2. 购买60只小鼠，适应一周，并随机分为五组（每组n = 12）：模型组、LYXT组（200 mg·kg^·1·^d-1）、β-胡萝卜素组（50 mg·^kg-1·^d-1）、spathulenol组（50 mg·^kg-1·^d-1）和组合组（各25 mg·kg·¹·^d-1 ）。
   3. 在第0天施打LPS，第7天至第20天进行治疗，按照第6.3步描述。第21天采集肺组织¹⁴。
7. 组织学分析
   1. 将左肺上叶固定在4%对甲醛中24小时，嵌入石蜡中，切开5微米切片，并进行血液素和伊红（HE）染色。
   2. 在200×和400×放大率下观察切片，以评估炎症细胞浸润和肺泡壁增厚。拍摄具有代表性的图像。
8. 西部墨迹分析
   1. 在放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液中均质化肺组织，并使用蛋白酶和磷酸酶抑制剂。在12,000克×离心机下，温度为 4°C，持续15分钟，并利用双碳酸（BCA）测定蛋白浓度。
   2. 将每孔30微克蛋白质加载到十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶上，转移至聚氟乙烯（PVDF）膜，并用5%脱脂牛奶封闭。
   3. 在4°C下与针对p-p38、p38、TNF-α、IL-1β、IL-18和β-肌动蛋白的初级抗体一起孵育，然后用HRP结合的二级抗体孵育。
      注意：抗体稀释量详见 材料表。
   4. 使用ECL基底可视化条带，捕捉图像，并使用ImageJ量化强度。将目标蛋白表达归一化为β-肌动蛋白或总p38。

结果

TCMSP数据库被用来收集409种活性LYXT成分。其中，58种成分来自Verbena officinalis L.，86种来自Semen Pharbitidis，265种活性成分来自 Zingiber officinale Roscoe。根据指数筛查了26种关键活性成分， Verbena officinalis L.≥30.1%，DL≥为0.12，O≥B为60%，D≥为0.13，OB为16.93%，≥DL为0.50，适用于Verbena officinalis L.，OB≥为0.50，适用于Pharbitidis（表1）。

通过对LYXT活性成分的交叉分析，获得了27个相互作用蛋白。其相关的发烧和咳嗽蛋白从String数据库导入，并获得了蛋白质相互作用图（见图1）。节点代表蛋白质，边代表蛋白质之间的相互作用，较粗的边缘（连接）代表更稳健的关联。 图1 展示了PPI网络。节点代表蛋白质，边代表相互作用，边缘厚度对应STRING数据库中的综合交互分数。CTNNB1、PTGS2、VEGFA、TGFB1、CASP3和AKT1显示多重连接（度中心性更高），而PON1、PLAR、PTGS1、CAV1、CYP1B1、PGR、AKT1、MAP2、GABRA1和DRD1则连接较少。该协议通过使用三种不同方法分析蛋白质-蛋白质相互作用的拓扑结构，分别是介于中间中心性（BC）、接近中心性（CC）和度中心性（DC），基于Cytoscape软件中的CytoNCA插件。关键目标蛋白的筛选标准包括：目标蛋白的中心度（DC）大于75（为中位数的两倍），接近中心性（CC）显著性高于0.67（中位数的1倍），中间中心性（BC）比827.78（中位数的1倍）更为关键，关键蛋白CYP3A4和POR被筛除（见表2）。

通过O功能富集分析和KEGG代谢途径分析，Omicshare数据平台分析了207个交叉蛋白，澄清了相关的生物过程及交叉蛋白与LYXT之间的关系。图2显示了这些靶标中最显著富集的20个KEGG项，且假发现率（FDR）为≤0.01。 图2中，横轴代表基因因子，P值代表富集程度。P值越小，越接近红色;相反，P值越显著，越接近蓝色，如图2所示。最富集的数字与癌症的通路相关。基因数量为60个。第二种与流体剪切应激和动脉粥样硬化有关，涉及33个基因。图3显示了生物过程（红色条）、细胞组分（绿色条）和分子功能（蓝色条）中的富集数值。首先，生理过程主要涉及细胞过程、对刺激的反应、生物调控以及生物过程的调控。其次，分子功能主要参与结合和催化活性。细胞组成部分主要包括细胞、细胞部分和细胞器。表3总结了前20条信号转导通路。富集程度可通过P值和命中次数来判断。研究显示，LYXT治疗发烧和咳嗽主要通过液体剪切应激、癌症、动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路和乙型肝炎。图4展示了经典的MAPK信号通路、MAP通路和p38激酶通路。在MAPK通路中，RTK被GK影响，进而影响c-fos蛋白的活性。在NF-κB通路中，IKK参与激活级联反应，这是一种信号机制，已被发现与多种病理生理过程有关，包括糖尿病心肌病⁸。在MAP和p38激酶通路中，面对血清、热休克、活性氧、细胞毒性药物、辐照、脂多糖及其他应激因子等刺激，TGFB和IL1蛋白接收信号并通过细胞膜传递，作用于CASP、AKT、p38和Elk-1。如图4所示，在LYXT治疗发热期间，PKE及其下游蛋白，包括ERK、IKK、NF-κB、Elk-1、c-Myc和c-fos，是被鉴定的靶蛋白之一。

图5 显示，LYXT的主要成分与207种交集蛋白相互作用，其中具有β-胡萝卜素作用的蛋白数量最多，在治疗发热和咳嗽中起着最关键作用，其次是环丙丙-7-醇、β-西毒素醇和凯姆费罗，这些肽也与多种蛋白有明显相互作用。CYP3A4和POR可与十种成分相互作用，AKT1可与七种成分相互作用，PTGS2和ADRA2A可与六种成分相互作用。

LYXT中的26种活性化合物分别通过AutoDockTools（版本1.5.6）与CYP3A4和POR对接。根据结合能越低表示结合越有利的原则，评估了药用成分与目标蛋白之间的关系。对接得分范围为-6.59至+10.40。阳性对接得分（如5.96和10.40）表示结合不良或无意义，因此排除在进一步分析之外。关键目标蛋白的分数低于-2进行筛选。β-胡萝卜素与CYP3A4的评分最低（-6.59 kcal/mol，表4）。图6表明它们结合良好，进一步表明β-胡萝卜素是LYXT中治疗发烧和咳嗽的重要药物成分。其次，环丙戊-7-醇含CYP3A4和POR，得分分别为-6.07和-5.49。这一结果表明装订过程非常简单。β-植物甾醇也能与CYP3A4对接，得分为-5.02。因此，β-胡萝卜素和环丙戊-7-醇可能作为开发治疗发烧和咳嗽新药的潜在先导分子。相比之下，尽管β-植物甾醇在结合分析中显示出预测的结合亲和力，但在后续的体内实验中并未表现出显著的抗炎效果（如图7、图8和图9所示）。在评估肺部炎症时，BALF中的白细胞数量是一个重要指标。模型组的白细胞计数是阴性对照组的五倍。然而，LYXT处理组白细胞的下降明显（见图7A），表明LYXT防止白细胞过度浸润肺组织。LPS挑战后，测量了BALF和血清中的细胞因子浓度（IL-18和TNF-α）（见图7B–E）。LYXT、β-胡萝卜素和巴丘烯醇治疗对这些细胞因子的降低程度不同（p < 0.05），而β-植物甾醇未显著降低血清中的IL-18或BALF中的TNF-α。

肺组织的组织病理学评估见 图8。与阴性对照 组（图8A）相比，模型组表现出显著的炎症性细胞浸润——包括肺泡腔内的中性粒细胞——同时肺泡壁明显变薄。LYXT治疗有效逆转了这些病理变化。如 图8D–E所示，LYXT组表现出肺泡隔膜增厚和更规律的肺泡结构，与阴性对照组相当。相比之下，仅用β-胡萝卜素或斯巴图烯酚治疗的组在组织病理学上有适度改善，但恢复幅度略低于LYXT组。

对肺组织样本进行了Western blot分析，以检测磷酸化p38（p-p38，MAPK通路激活的关键标志物）及下游炎症细胞因子（包括TNF-α、IL-1β和IL-18）的蛋白表达水平（见图9）。基于上述动物实验，进行了验证实验以进一步研究活性成分。本次验证实验的结果（五组：阴性对照组、模型组、β-胡萝卜素、巴度醇和LYXT）总结如下。与阴性对照组相比，模型组在p-p38、TNF-α、IL-1β和IL-18的表达显著增加（p < 0.05），表明炎症性MAPK/p38通路成功激活，LPS诱导后细胞因子产生升高。LYXT治疗显著降低了这四种蛋白的表达，均低于模型组（p < 0.05）。β-胡萝卜素和粪苯醇治疗也显著降低了表达水平（p < 0.05）。LYXT治疗组在处理组中表现最为显著，表达水平接近阴性对照组。

这些发现表明，虽然单个成分（β-胡萝卜素和斯帕舍烯醇）表现出某些抗炎特性，但LYXT配方在测试条件下对MAPK/p38通路及其下游炎症介质表现出更全面的抑制作用。这些结果表明，LYXT中多种成分的组合可能有助于其观察到的疗效，因此需要进一步研究其活性成分间的潜在相互作用。

图1：发烧和咳嗽LYXT靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。 节点代表目标蛋白，边代表蛋白质之间的相互作用。边粗对应于STRING数据库中的综合交互得分（置信度≥0.90）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：交叉靶蛋白的KEGG通路富集分析。 列出了20条最显著富集的KEGG通路。横轴表示富集比（观察到的基因计数与预期基因计数的比值）。纵轴列出了路径名称。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：交叉靶蛋白的GO富集分析。 条形图显示了三个类别中排名前20的强化GO术语：生物过程（BP，红色）、细胞成分（CC，绿色）和分子功能（MF，蓝色）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：图4。MAPK信号通路中LYXT靶蛋白的KEGG通路定位。请点击此处查看该图的放大版本。

图5：LYXT中活性成分与靶蛋白的相互作用，用于发烧和咳嗽。 Verbena officinalis L.（浅黄色框架）、 Zingiber officinale Roscoe（深黄色框架）、精液（浅红色框架） 请点击此处查看该图的放大版本。

图6：β-胡萝卜素与CYP3A4的分子对接。 请点击此处查看该图的更大版本。

图7：BALF和血清中的白细胞计数及细胞因子浓度。 （A）BALF中的总白细胞计数。（B）BALF中的IL-18浓度。（C） BALF中的TNF α浓度。（D）血清中的TNF-α浓度。（E）血清中的IL-18浓度。数据以SEM平均±±形式呈现（每组n = 6个）。统计显著性通过单向方差分析（ANOVA）及Tukey事后检验确定。不同的小写字母（a， b， c）表示组间统计学上显著的差异（p < 0.05），而使用相同字母的组别无显著差异（p > 0.05）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图8：肺部炎症损伤的血液素-伊松染色。 （A）正常对照组。（B） 模型组（LPS诱导）。（C） β-胡萝卜素治疗组（50 mg·kg⁻¹·d⁻¹）。（D） 巴度烯醇处理组（50 mg·kg⁻¹·d⁻¹）。（E） LYXT治疗组（200 mg·kg⁻¹·d⁻¹）。比例杆=100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图9：西方印迹表达水平及关键通路相关蛋白的统计图表。 数据以SEM平均值±±表示（n>3）。统计显著性通过单向方差分析（ANOVA）及Tukey事后检验确定。 ^*β-胡萝卜素组的p<0.05;# ^{p 4} 0.05 < 对 spathulenol 基; ^LYXT组<0.05。 请点击此处查看该图的放大版本。

表1：东医药LYXT选定的关键活性成分。请点击此处下载此表格。

表2：东药LYXT的必需靶蛋白。请点击此处下载此表格。

表3：交叉蛋白KEGG通路分析结果（前20名）。请点击此处下载此表格。

表4：LYXT主要药物成分与重要靶蛋白的结合结果。请点击此处下载此表格。

补充文件1：用于网络药理学分析的R脚本。请点击这里下载此文件。

讨论

本文成功鉴定了LYXT的26种活性成分和207个潜在靶点，LYXT是一种用于发烧和止咳的传统药剂。主要发现包括通过网络拓扑分析鉴定CYP3A4为关键靶蛋白，以及在LPS诱导肺部炎症模型中实验验证LYXT、β-胡萝卜素和斯帕舍烯醇作为具有显著抗炎效果的活性化合物。这些发现通过结合网络药理学（数据库筛选、PPI网络分析和分子对接）与 体内 实验验证（BALF白细胞计数、细胞因子测量、组织学和西方墨迹）相结合的方法实现。

首先，一个独特的中药系统药理学平台TCMSP，捕捉了疾病、药物和靶点之间的关系。本研究利用TCMSP平台寻找LYXT中发烧和咳嗽的关键成分，并通过分子结合评估活性成分和靶点的结合亲和力。本研究通过以下筛选标准识别了26种LYXT关键活性成分和207种目标蛋白： 对于马鞭草， 口服生物利用度（OB）≥30.1%，药物相似性（DL）≥0.12; Zingiber 官 员 Roscoe，外科医生，≥ 60.0%，防守线≥ 0.13%;精液法比蒂迪斯≥产科医生16.93%，DL为0.50≥。利用Cytoscape软件计算度中心性（DC）、接近中心性（CC）和介于中心性（BC），识别出关键靶蛋白CYP3A4和POR并与LYXT主要药理成分分子对接。这些发现确定了三种药理成分——β-胡萝卜素、环丙-阿祖伦-7-醇和β-西毒素醇——作为发烧和咳嗽治疗中的潜在活性化合物。

在β-植物甾醇的计算预测与 体内 结果之间观察到显著差异。尽管β-植物甾醇在分子连接中预测对CYP3A4具有结合亲和力（结合能-5.02 kcal/mol），但在LPS诱导的肺部炎症模型中并未表现出显著的抗炎效果，这一点从白细胞计数、细胞因子水平和炎症介质蛋白表达的减少可见一斑。这种不一致凸显了当前计算筛选方法的一个重要局限：预测的结合亲和力并不总是转化为 体内的生物活性。生物利用度差、代谢不稳定或靶外效应等因素可能导致疗效不足。这一发现强调了计算预测实验验证的必要性，并建议网络药理学和对接分析应被视为假设生成工具，而非确认性证据。

我们的结果展示了LYXT及其关键预测成分的治疗效果，与现有机制文献相符并加以扩展。β-胡萝卜素和巴度二醇基于其与肺损伤相关的已知生物学活性被优先考虑。β-胡萝卜素因其抗氧化能力和免疫调节作用而广为人知，缺乏与呼吸预后恶化相关¹⁵。在实验模型中，斯帕舍宁醇被持续报道具有显著的抗炎特性，有效减少细胞因子的产生和细胞浸润¹⁶。本研究在LPS诱导肺损伤的背景下，提供了实证支持这些机制，更重要的是，在实验验证中，我们观察到LYXT显著抑制LPS诱导的肺部炎症，表现为白细胞浸润减少、促炎细胞因子（TNF-α、IL-18）水平下降，以及有效缓解肺组织病理损伤。值得注意的是，尽管预测的主要成分β-胡萝卜素和斯帕舍烯醇单独应用时均表现出一定的抗炎效果，但完整的LYXT配方显示出更强的综合疗效。这表明LYXT的作用可能超越单一成分的简单加成贡献，可能通过作用于不同靶点和通路（如MAPK/p38信号通路）的多种活性成分之间的协同或互补相互作用实现。

传统中医用于各种治疗的历史已有四千多年历史¹⁷.总体而言，中药在治疗复杂疾病方面具有巨大潜力。LYXT的东药是由 Verbena officinalis L., Zingiber officinale 罗斯科和精液。 Verbena officinalis L.属于马鞭草科，这是一种在民间医学中非常受欢迎的草药，用于治疗支气管炎和风湿病。药理学研究表明，这种植物具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤活性¹⁸.V. Officinalis L. 的主要成分包括苯丙烷类、铧糖、黄酮、类黄酮和萜类。水溶液和水醇提取物 V. officinalis 是矿物质和抗氧化化合物的极佳组合¹⁹. Verbena officinalis L. 提取物具有强效的抗菌活性，但其抗菌作用背后的机制仍需进一步研究。Pharbitidis精液由Pharbitis nil（L. Choisy）的种子组成，被归类为著名的中医药，用于治疗癫痫。多项临床研究已验证其治疗癫痫的有效性。Maoxuan 等人。²⁰ 通过生物测定引导分馏，从法氏精液中分离出一组树脂葡萄糖苷作为抗癫痫化合物。然而，直到现在，尚未确定在仙子病中识别其他具有药理活性成分的化合物。 Zingiber officinale 罗斯科（生姜）在印度和中国的替代医学应用历史可追溯到2500年，原产于热带亚洲，常见于包括墨西哥在内的美国热带国家。胃肠道感染、头痛、恶心、呕吐、头晕和风湿病通常因其抗炎和镇痛特性而用姜治疗²⁰.然而，由于该物种仅为栽培，支持其使用的证据相对有限。药物的疗效直接与其活性物质和单一成分的成分和成分相关。LYXT药用成分的复杂性、新药研发的漫长过程、药品质量控制和产品优化带来了新的挑战。本研究基于现有数据，调查了LYXT的各种活性成分。鉴于中医特有的疗效，本研究筛选了与炎症相关生物活性显著的化合物及相关蛋白。这种传统中医研究方法有助于从复杂的天然活性成分中发现与药理活性相关的成分，同时也能预测单个成分的生物活性。尽管关键目标蛋白与生物活性之间的相关性不一定意味着直接因果关系，但它们可能为发现潜在新药成分提供宝贵信息。网络药理学方法常用于确定药物的作用机制及可能的不良反应。多个研究团队利用网络药理学进行不同应用，例如探索已知用途的生物活性民族植物化合物，并将其重新用于其他药理用途^21,22.另一个例子是二甲双胍，它已被重新用作化疗预防药物，并已进入临床试验阶段²³.因此，这些方法有助于揭示可能的新作用机制，并将其与网络药理学分析结合起来。 In vitro 活性检测可以识别特定的药用成分，并评估具有相同药理特性的不同来源的药品质量。

本研究存在若干局限性。首先，网络药理学方法本质上依赖于所用数据库（TCMSP、STRING、DAVID等）的质量和完整性，筛选阈值（OB≥ 30%，DL ≥ 0.18）可能引入选择偏倚，可能排除生物利用度低但药理活性高的化合物。其次，计算预测依赖于人类目标注释，而 体内 验证则是在小鼠中完成的;尽管MAPK/p38通路在各物种间是保守的，但药物代谢和靶点结合可能存在物种特异性差异。第三，动物实验仅限于单一模型（LPS诱导肺部炎症）和相对较短的治疗时间，这可能无法完全反映临床环境中发烧和咳嗽的复杂性。第四，分子结合分析提供了潜在结合亲和力的见解，但未考虑蛋白质的柔韧性、溶剂效应或蛋白质-配体相互作用的动态特性。第五，尽管β-植物甾醇的结合预测良好，但其无积极效果凸显了实验验证的必要性，并建议计算筛选应被视为假设生成而非确认性。未来研究应纳入药物动力学评估，采用更多 体内 模型，并利用表面等离子体共振或等温滴定量热等技术，直接验证化合物与靶点的相互作用。

发烧和咳嗽是多种疾病常见的炎症反应。然而，西医主要关注预防和治疗病毒病原^体。中医用于病毒性发热和咳嗽的处方已被古代医学书籍和^{现代研究报道}。这些处方药含有多种矿物质、动物化合物和药用植物，通常以口服液体、粉末和颗粒形式服用。有报道指出，中药通过调节免疫反应，增强了人体对病毒的抵抗力²⁶。作为系统生物学在医学中的新应用，代谢组学可以帮助寻找功能性小分子，并评估中医药理学^效应。系统生物学带来的组学技术是中医研究的重要工具。本研究筛选的许多目标基因与免疫调节功能相关，多种蛋白质参与增强T细胞增殖、抗体产生和抗原特异性反应。这些蛋白质可能被纳入病毒与宿主免疫系统的相互作用中。代谢组学不仅能预测治疗效果，还能预测对治疗的代谢反应。药物的代谢特性可作为研究药物靶点²⁷的参考。因此，代谢组学对于实现精准医疗目标至关重要。虽然大多数关于中医病毒性发热和咳嗽的研究集中在非靶向代谢组学，但靶向代谢组学结合分子生物学技术，有望为未来中医发烧和咳嗽的研究提供参考。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
反伊尔-18	Proteintech，中国武汉	27095-1-AP	兔子多克隆，1：500
抗 IL-1 和 β;	Proteintech，中国武汉	66737-1-Ig	小鼠单克隆，1：500
反p38	Proteintech，中国武汉	14064-1-AP	兔子多克隆，1：1000
反p-p38	Proteintech，中国武汉	28796-1-AP	兔子多克隆，1：1000
抗TNF和α;	Proteintech，中国武汉	80258-6-RR	兔子单克隆，1：500
抗β-肌动蛋白	Proteintech，中国武汉	66009-1-Ig	小鼠单克隆，1：2000
AutoDock Vina	https://vina.scripps.edu/	版本 1.5.6	分子对接软件
AutoDockTools	https://autodock.scripps.edu/	版本 1.5.6	分子对接制备工具
BCA蛋白质检测套件	美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的Thermo Fisher Scientific公司	23225	用于蛋白质浓度测定
β-胡萝卜素	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	83-46-5	高纯度标准，>95%
β-西桃甾醇	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	83-46-5	高纯度标准，>95%
C57BL/6鼠标	兰州大学医用动物中心及NBSP;	-	成年男性，25岁及以上;4克
细胞景象	https://cytoscape.org/	版本 3.8.1	网络可视化与分析软件
地塞米松	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	D4902	正向对照
ECL基底	美国马萨诸塞州伯灵顿MilliporeSigma	WBKLS0500	用于西方墨迹检测
ELISA套件
GraphPad 棱镜	https://www.graphpad.com/	版本8.0及以上	统计分析与绘图软件
血液素和嗜青（H&E）染色套件	北京太阳生物科学与科技有限公司，中国北京	G1120	用于肺组织染色
组织学
HRP共轭反鼠	Proteintech，中国武汉	SA00001-7G	二级抗体，1：5000
HRP结合的反兔子	Proteintech，中国武汉	SA00001-7H	二级抗体，1：5000
IL-18 ELISA套件	北京太阳生物科学与科技有限公司，中国北京	SEKH-0016	用于测量BALF中的IL-18和血清
IL-1&β;ELISA套件	北京太阳生物科学与科技有限公司，中国北京	SEKM-0004	用于测量IL-1和β;在BALF和血清中
图片J	https://imagej.nih.gov/ij/	版本 1.53	图像分析软件
脂多糖（LPS）	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	L2630	摘自nbsp;大肠杆菌 O111：B4
LYXT原材料	淮华大学	-	粉末混合物;法比提斯无;（左）乔伊西，nbsp;官方马鞭草 L.，  官员Zingiber  罗斯科（5：3：2，双/白/白）
其他材料
戊巴比妥钠	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	P3761	2%溶液用于麻醉
PLIP	https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/	-	蛋白质-配体相互作用剖析仪
PVDF膜	美国马萨诸塞州伯灵顿MilliporeSigma	IPVH00010	用于西方印迹转移
PyMOL	https://pymol.org/	版本 2.5	分子可视化软件
R	https://www.r-project.org/	版本4.0及以上	统计计算与图形软件
斯帕图勒诺尔	MedChemExpress，美国新泽西州蒙茅斯交汇处	HY-N1205	高纯度标准，>95%
弦	https://stringdb.org/	-	检索相互作用基因/蛋白质的工具
TCMSP	https://tcmsp-e.com/	-	中医系统药理学数据库
硫喷妥钠	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	T102	为了安乐死
TNF和α;ELISA套件	北京太阳生物科学与科技有限公司，中国北京	SEKM-0034	用于测量TNF和α;在BALF和血清中
UniProt	https://www.uniprot.org/	-	蛋白质序列与注释数据库