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方法文章

与神经退行性疾病相关的衰老：在啮齿类动物脑组织切片中同时评估 β-半乳糖苷酶活性与尼氏染色

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⸱

DOI：

10.3791/70676

⸱

2026年7月17日

 ,  , 
1Laboratorio de Neuroinmunología, Unidad de Investigación en Medicina Experimental, Facultad de Medicina-UNAM, Hospital General de Mexico "Dr. Eduardo Liceaga"

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案旨在检测衰老相关β-半乳糖苷酶活性，进行尼氏染色以同时评估细胞衰老和神经元完整性，并研究衰老负荷与神经退行性变之间的关联。

摘要

细胞衰老是一种生理过程，其特征是不可逆的细胞周期停滞，会损害组织再生和功能。这一现象已成为神经退行性疾病的关键驱动因素，其原因是中枢神经系统（CNS）内衰老细胞的不断积累。衰老细胞获得一种促炎性的衰老相关分泌表型（SASP），从而维持慢性神经炎症并破坏神经元微环境。因此，神经发生、突触可塑性和神经元存活等关键过程受到损害。大量文献表明，细胞衰老与多种神经退行性疾病相关，例如帕金森病、阿尔茨海默病或多发性硬化症，也与急性神经损伤相关，例如脑缺血或创伤性脑损伤。

在组织切片中联合检测衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性与尼氏染色，可在同一组织背景下同步评估细胞衰老与神经元完整性，提供一种综合性分析方法。该策略能够精确揭示特定易损区域（如海马或皮层）中衰老细胞积聚与神经元丢失或组织损伤之间的空间关联性。通过将衰老的功能性标志物与神经元形态及密度的经典指标相结合，该方法增强了分析结果的解释可靠性。此外，该方法还能更准确地表征衰老负荷与神经退行性变化之间的关系，从而最大限度地从有限的组织样本中获取信息。

此外，该方案可用于确定在神经退行性疾病啮齿类动物模型中，衰老细胞的积累如何响应各种干预措施（如药物干预、基因操作等），从而为分析衰老细胞在疾病病理生理过程中的作用提供一种强有力的工具。

引言

细胞衰老的特征是细胞周期发生基本不可逆的停滞，并伴随广泛的生物大分子改变1。此外，衰老细胞获得一种高分泌表型（SASP），其特征是大量分泌多种促炎性细胞因子、生长因子和蛋白酶2。这些因子共同作用，促进形成一种促炎性微环境，从而强化衰老状态并影响组织稳态。在中枢神经系统（CNS）中，衰老细胞随年龄增长而逐渐积累，尤其在易受年龄相关病变影响的脑区更为显著3。细胞衰老在与衰老及神经退行性疾病相关的功能改变中发挥重要作用，且在正常衰老过程中，衰老细胞的负荷持续增加。中枢神经系统中的多种细胞类型均易发生衰老，包括星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞、神经元以及神经干细胞4。越来越多的证据表明，这些中枢神经系统细胞群体的衰老参与了多种神经退行性疾病的发病机制，包括阿尔茨海默病、帕金森病、额颞叶痴呆、肌萎缩侧索硬化症和多发性硬化症5。神经退行性疾病已被证实与细胞衰老相关6，且研究发现衰老细胞在淀粉样β斑块和神经原纤维缠结附近聚集。在啮齿类动物大脑中已观察到与年龄相关的SA-β-gal活性升高（例如在3、8、17和24月龄时），其中在最老龄组（24月龄）中升高最为显著，具有统计学意义7。 

不同的研究为组织学改变与功能结局（如认知障碍和代谢失调）之间的关系提供了重要见解，这些研究基于病理动物模型，探讨了脑损伤的功能或行为相关性8,9。

尽管已有大量研究，目前仍缺乏一种能够可靠识别衰老细胞并将其与其他非增殖状态区分开来的单一通用标志物；然而，最广泛使用的细胞衰老标志物是溶酶体酶衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal），该酶在pH 6条件下被检测到，是一种催化β-半乳糖苷水解为单糖的水解酶。一个关键的区分因素是pH值。SA-β-gal在pH 6时表现出最佳活性，而细菌性β-半乳糖苷酶的作用pH为7.4，内源性溶酶体β-半乳糖苷酶则在pH 3至5的酸性范围内发挥作用7,10。

细胞密度和脑细胞结构是决定神经组织结构与功能的基本因素。特定细胞群体的空间分布及其丰度对神经回路功能至关重要，准确量化这些参数对于研究涉及选择性细胞易损性或细胞丢失的神经病理状态具有重要意义。尼氏染色是神经科学中一种标准方法，作为一种广泛应用的组织学技术，用于评估神经系统组织中的神经元密度和细胞结构。该方法通过特异性标记神经元胞体内的尼氏体，能够可靠地实现跨脑区神经元群体的可视化与定量分析11。除了具有良好的稳定性外，尼氏染色还具备操作简便、成本低廉和处理时间相对较短的特点，使其成为常规神经解剖学和神经退行性研究中实用且易于获取的技术工具。

在同一组织切片中联合评估尼氏染色和衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性，为同时检测神经元完整性和衰老细胞负荷提供了一个可靠且具有空间分辨能力的分析框架。这种整合方法能够将细胞衰老直接定位至特定脑区的神经退行性特征，包括神经元丢失和细胞结构紊乱。将经典的结构标记物与衰老的功能性指标相结合，不仅增强了数据解读的可靠性，还能揭示衰老细胞积聚与组织功能障碍之间的机制联系，同时最大限度地提高对有限样本的分析产出。

重要的是，该策略特别适用于组织样本有限的研究、纵向或干预性研究设计（例如，清除衰老细胞药物或抗衰老表型药物治疗），以及在复杂的脑结构中进行特定区域分析，其中衰老与神经元易损性的关联至关重要。

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方案

所有动物实验操作均须遵循机构和国家关于实验动物护理与使用的指南，并事先获得相关伦理委员会的批准。本方案符合现行的墨西哥实验动物护理与使用官方标准（NOM-062-ZOO-1999(Muñoz, 2001)），并已通过伦理与研究委员会以及墨西哥国立自治大学医学院实验动物管理和使用委员会（CICUAL）的预先审查与批准（批准编号：FM/DI/039/2023，CICUAL-009-2023）。实验动物由医学院实验医学部动物饲养室提供。

注意：为了同时评估啮齿类动物脑组织中衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性与尼氏染色，本方案采用4%多聚甲醛固定的啮齿类动物脑组织，在-20 ± 1 °C条件下进行冷冻切片。所有切片首先进行SA-β-gal活性检测（步骤1），随后进行尼氏染色（步骤2），再用抗荧光淬灭封片剂封片（步骤3）。处理完成后，将载玻片置于明场光学显微镜下观察，以获取感兴趣区域的高分辨率图像，用于后续分析。

1. 组织切片的制备及衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性检测

  1. 脑切片的制备
    1. 按照 Wu 等人，2021 年先前描述的方案12，通过4%多聚甲醛经心脏灌注获取脑组织。将脑组织转移至含0.01%叠氮化钠的磷酸盐缓冲液（PBS）中，于4 °C长期保存。
    2. 进行后续操作时，将脑组织置于30%蔗糖溶液中，待其沉入底部后，储存于-20至-80 °C。本方案适用于不同啮齿类动物脑组织（例如大鼠、小鼠、豚鼠），并可在2-甲基丁烷中冷冻。
    3. 在-20 ± 1 °C条件下进行冷冻切片，获得厚度均匀的切片，并将其包埋于最佳切割温度（O.C.T.）包埋剂中（厚度为20–40 µm），然后贴附于明胶包被的玻璃载片上。
    4. 将切片贴附于玻璃载片上，并在低温条件下保存，直至使用。
  2. 衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性的检测。
    1. 在使用当天，根据表1所示溶液新鲜配制SA-β-gal染色液。
    2. 将溶液调节至pH 6.0，以确保SA-β-gal活性的特异性。
      注意：染色液应在使用前配制；避免预先在水溶液中混合。
      5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃苷（X-Gal）在水溶液中不稳定。
  3. 平衡组织切片载片的温度。
    1. 从低温保存环境中取出载片。
    2. 将载片放入考普林瓶中，在室温（RT）下平衡5分钟。
    3. 向考普林瓶中加入足量PBS，覆盖载片以水化切片。
    4. 将载片置于低速轨道摇床上，在室温下轻柔振荡5分钟。
    5. 重复洗涤一次。
  4. 染色前载片的准备。
    1. 用吸水纸轻轻吸除载片边缘多余的PBS。
    2. 使用疏水屏障笔在每个切片周围画出疏水屏障，注意避免接触组织。
  5. 进行SA-β-gal染色
    1. 将载片放入湿盒中。
    2. 使用微量移液器，每张切片加入约200 µL染色液，确保组织完全覆盖。
    3. 在37 °C孵育48小时。
    4. 孵育结束后，用吸水纸吸除染色液。
    5. 将载片放入考普林瓶中，加入PBS覆盖载片，并在低速轨道摇床上于室温轻柔振荡5分钟。
      注意：请勿使用CO₂孵箱。染色后应立即进行尼氏染色。

2. 尼氏染色

  1. 配制尼氏染色工作液。
    1. 按照表2所述方法配制储备液。
    2. 取15 mL焦油紫溶液与85 mL醋酸盐缓冲液混合，配制成尼氏染色工作液。
    3. 用滤纸（4号，20–25 µm孔径）过滤溶液，以去除沉淀物。
    4. 过滤后，将溶液在37 °C预热至少30分钟（或在40–43 °C水浴中预热）。
    5. 使用前立即向尼氏染色工作液中加入10滴0.1 M醋酸。
      注意：同一天内尼氏染色工作液最多可使用四次；不可过夜保存。
    6. 在容量瓶中加入95 mL无水乙醇，再加入15滴0.1 M醋酸配制酸化乙醇，用蒸馏水定容至100 mL，并充分混匀。
  2. 预处理载玻片。
    1. 将载玻片放入考普林瓶中，加入适量PBS完全浸没载玻片，在37 °C孵育5分钟。
  3. 染色切片。
    1. 将载玻片逐张小心浸入预热的尼氏染色液中。
    2. 在尼氏染色液中孵育5–20分钟。
      注意：染色时间取决于组织厚度。每5分钟观察一次染色情况，直至呈现深紫色为止。
  4. 洗涤切片。
    1. 用蒸馏水轻轻冲洗载玻片1分钟，然后转移至盛有新鲜蒸馏水的考普林瓶中继续洗涤1分钟。
    2. 评估染色质量。在明场显微镜下（10×物镜）观察载玻片。
    3. 在明场显微镜下确认呈现强烈的紫色点状染色，背景染色尽可能低。
      注意：若背景过深，将载玻片浸入酸化95%乙醇中10秒。
    4. 立即转移至无水乙醇中10秒，以终止分化。
      注意：如染色较浅，可重复染色步骤（8.1–9.3）进行复染。
  5. 脱水并透明化载玻片。
    1. 将载玻片浸入二甲苯中至少5分钟（必要时可延长至2小时）
      注意：操作应迅速，因为组织约在2分钟内即开始脱水。

3. 装载

  1. 准备封片介质
    1. 将 8 mL 封片介质与 2 mL 二甲苯混合。
      注意：仅配制所需体积；封片介质会迅速硬化。
    2. 从二甲苯中取出载玻片，轻轻吸去边缘液体。将载玻片放置于平坦表面。
    3. 在组织上滴加约 120 µL 封片介质。
    4. 从一侧缓慢放置盖玻片，以避免产生气泡。
  2. 干燥载玻片并采集图像。
    1. 室温下静置载玻片至少 5 分钟使其干燥。
    2. 在明场显微镜下观察，并采集目标区域的图像。
    3. 封片后，封片介质完全干燥需要较长时间（24 小时）。
  3. 储存载玻片。
    1. 将载玻片于室温下储存，以实现长期保存（可保存数月）。

4. 衰老负荷的定量分析

注意：该方法用于定性评估；然而，当研究设计需要时，可扩展为包括定量分析。

  1. 将衰老负荷定义为在特定感兴趣区域（ROI）内衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）阳性细胞的相对丰度。该指标可表示为阳性细胞占总细胞数的百分比，或表示为每单位面积（cells/mm2）的阳性细胞密度。
  2. 选择感兴趣区域（ROI）。根据标准化的神经解剖学标志，使用适用于该物种和年龄的脑图谱确定ROI。推荐区域包括海马亚区（CA1、CA3、齿状回）以及具有明确层状结构的皮层区域。
    1. 每张切片每个ROI选取3–5个无重叠的视野。
    2. 每只动物至少分析2–3张切片，切片之间保持一致的解剖间隔。
    3. 在所有样本中保持ROI大小和形状一致。
    4. 在选择ROI时对操作者设盲，以尽量减少偏倚。
  3. 采集图像。
    1. 在标准化条件下，使用配备数字相机的明场显微镜采集图像：
      1. 使用一致的放大倍数（例如，10×用于区域概览，20×或40×用于定量分析）。
      2. 在所有样本中保持恒定的照明强度、曝光时间和白平衡。
      3. 避免SA-β-gal信号（蓝色）饱和，并确保尼氏染色（紫色）清晰可见。
      4. 将图像保存为无损格式（例如TIFF），以便后续分析。
  4. 预处理图像。
    1. 使用图像分析软件（例如ImageJ/Fiji）13进行预处理：
      1. 如有需要，将图像转换为RGB格式。
      2. 应用背景扣除以校正照明不均。
      3. 在不改变相对信号强度的前提下，对所有图像进行统一的对比度归一化。
      4. 避免过度处理，以防扭曲信号边界。
  5. 识别SA-β-gal阳性细胞。
    1. 根据细胞质内是否存在明显的蓝色沉淀物来定义阳性细胞。使用颜色阈值法分离蓝色信号（例如，通过经验确定的色调/饱和度/强度范围）。
    2. 使用阴性对照（年轻或未经处理的组织）验证阈值，以排除背景染色。
  6. 确认其形态学特征与尼氏染色中观察到的细胞轮廓一致。
  7. 定量分析方法
    1. 基于细胞的定量：手动或使用半自动工具计数SA-β-gal阳性细胞。在同一ROI内利用尼氏染色确定总细胞数。
    2. 结果表示为：
      衰老负荷（%）=（SA-β-gal阳性细胞数 / 总细胞数）× 100
    3. 基于密度的定量：计算每单位面积的SA-β-gal阳性细胞数量：
      细胞密度 = 阳性细胞数 / ROI面积（mm²）
    4. 阈值定义与对照：通过实验经验建立检测阈值：
    5. 使用阴性对照定义背景信号水平。
    6. 包括阳性对照（例如老年脑组织或应激诱导模型）以验证检测灵敏度。
    7. 在同一次实验的所有样本中应用相同的阈值设置。记录所有阈值参数以确保可重复性。

5. 数据标准化与统计分析

  1. 标准化衰老负荷以校正细胞密度的区域差异；使用尼氏染色法估算每个感兴趣区域（ROI）的总细胞数——对不同感兴趣区域、切片和动物的测量值取平均。根据实验设计，采用适当的统计学方法（如 t 检验、ANOVA）进行统计分析。
  2. 以均值 ± 标准误（SEM）或标准差（SD）报告数据，并注明生物学重复次数（n）。
  3. 盲法与可重复性：所有定量分析均应在盲法条件下进行。通过以下方式验证可重复性：(a) 至少由两名观察者独立分析，或 (b) 对部分图像进行重复分析以评估观察者内部变异性。
  4. 定量策略的局限性：在可能的情况下，应结合其他互补性标志物共同解读定量结果。此外，不同切片间染色强度的差异可能影响基于阈值的定量分析，需严格控制该因素。

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结果

联合使用衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色与尼氏染色，可在同一脑切片中同时显示衰老细胞负荷与神经元的细胞结构。

完成SA-β-半乳糖苷酶染色步骤（步骤1）后，在明场显微镜下观察切片。成功的染色表现为具有β-半乳糖苷酶活性的细胞内出现明显的蓝色沉淀物（图1）。在低倍镜下，识别主要脑区，如海马体和大脑皮层（图1A）。在高倍镜下，观察显示胞内蓝色染色的单个细胞，尤其是在CA3亚区等区域（图1B）。该信号源于5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷（X-gal）的酶促水解，生成不溶性蓝色产物（5,59-二溴-4,49-二氯靛蓝），并在酶活性位点处积累。

单独进行尼氏染色时（步骤2），应评估神经元形态和组织结构。成功的染色表现为神经元胞体呈现明显的紫色着色，与周围神经网状组织形成清晰对比（图2

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讨论

目前，可用于在中枢神经系统（CNS）中识别、分离和选择性清除衰老细胞的可靠且特异性的工具仍然十分有限，这构成了机制研究的主要障碍。这一方法学上的空白限制了我们将细胞衰老对神经病理的因果作用与疾病进展的单纯相关性区分开来的能力。本文所介绍的工作流程结合了SA-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）酶活性检测与尼氏染色复染，以在特定的神经解剖学背景下绘制潜在的细胞衰老负担图谱，从而将酶学检测结果与神经退行性区域典型的细胞结构改变联系起来3。在区域细胞结构背景下识别SA-β-gal阳性细胞，有助于阐明衰老细胞的积聚部位及其对病理生理过程的可能贡献。

除了此处所述的结构和与衰老相关的改变外，越来越多的证据表明免疫失调和炎症信号在脑部病理中的重要作用。近期研究表明，免疫稳态的改变以及炎症通路的持续激活在神经系统疾病的发展过程中发挥核心作用，进一步支持了慢性神经炎症微环境是组织功能障碍关键驱动因素的观点14,15。在此背景下，衰老相关...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由墨西哥国立自治大学学术人员事务总局（Dirección General de Asuntos del Personal Académico, UNAM，项目编号 PAPIIT IN224624）以及科学、人文、技术与创新秘书处（Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación，SECIHTI）的前沿科学项目（Ciencia de Frontera CBF-2025-I-1337）和墨西哥国立自治大学博士后项目（UNAM Posdoctoral Program，POSDOC）资助。RJRC 获得了墨西哥国家科学技术委员会（CONAHCyT）提供的编号为 1020262 的博士后奖学金。VSV 获得了墨西哥国立自治大学学术人员事务总局（Dirección General de Asuntos del Personal Académico, DGAPA, UNAM）博士后奖学金项目（Programa de Becas Postdoctorales）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-甲基丁烷SIGMAM32631-500ML
5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷（X-Gal）PROMEGAV394A储存于 -30 至 -10 °C
柠檬酸 MERCK251275-5G
乙酸焦宁SIGMAC5042-10G
组织学用DPX封片剂SIGMA06522-500ML
滤纸WhatmanWHA1001929
冰乙酸SIGMA695092-500ML
疏水笔 MERCKZ672548
组织学级二甲苯SIGMA534056-500ML
湿盒STAINTRAY25501
无水氯化镁SIGMAM8266-100G若使用水合氯化镁，需调整摩尔浓度。
OCT包埋剂SAKURA FINE TEK4583
磷酸盐缓冲液（PBS）SIGMAP4417-50TAB使用市售片剂。
铁氰化钾（三水合六氰合铁酸钾(III)）SIGMAP8131-100G
亚铁氰化钾（六氰合铁酸钾(II)三水合物）SIGMAP9387-100G
无水乙酸钠SIGMAS2889-250G若使用水合乙酸钠，需调整摩尔浓度。
氯化钠SIGMAS9888-2.5KG
磷酸钠（磷酸氢二钠十二水合物）SIGMA71649-500G

参考文献

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