实时成像宿主诱导应激反应 铜绿假单胞菌 聚集体

摘要

Pseudomonas aeruginosa 聚集体表现出对抗生素和免疫细胞更强的耐受性。目前关于膜完整性在聚集体存活中的作用尚缺乏深入研究。本研究展示了一种定量分析P. aeruginosa聚集体内细胞膜动态变化的方法，以阐明细胞完整性如何影响聚集体的整体存活性。

摘要

囊性纤维化（CF）等慢性感染由微小但高度耐受的Pseudomonas aeruginosa聚集体维持，这些聚集体在免疫和治疗压力下仍能持续存在。与经典生物膜不同，这些聚集体代表了一种独特的致病单位——即在宿主诱导的应激条件下仍能保持结构完整性和生理稳态的微尺度、空间有序的群体。然而，目前尚不清楚这些聚集体在上述条件下维持完整性的机制，也不明确这些稳态过程是否可被选择性破坏。解决这一空白的主要障碍在于缺乏能够实时捕捉将生理应激与结构稳定性及崩解过程关联起来的动态、空间分辨的工具。本研究提出了一种整合成像与分析的工作流程，用于量化聚集体对宿主相关应激因子的响应。利用电压敏感性染料DiBAC₄(5)，监测在合成囊性纤维化痰液培养基（SCFM2）中形成的聚集体内部膜去极化现象，作为生理紊乱的早期指标。高分辨率时间序列共聚焦显微镜可实现对稳定状态及应激诱导状态下聚集体的可视化，而图像分割与基于体素的分析则可在单细胞分辨率下对膜完整性及聚集体解体过程中的空间异质性进行定量绘图。该工作流程建立了一个可重复且可灵活调整的平台，用于关联多细胞细菌聚集体中的生理应激与结构变化结果。通过实现对维持或破坏聚集体完整性的过程进行定量解析，该方法为识别和靶向调控聚集体弹性的稳态机制奠定了关键基础，推动了针对这种具有重要临床意义的细菌持续存在模式的新型干预策略的发展。

引言

慢性细菌感染通常并非由附着在表面的大块生物膜维持，而是由在宿主相关环境中形成的微小多细胞聚集体所导致。在囊性纤维化（CF）及其他慢性气道疾病中，Pseudomonas aeruginosa 通常以悬浮状态存在于黏液或痰液中的聚集体形式存在，而非附着于上皮表面的经典生物膜形式。这些聚集体代表了一种独特的生长模式，其特征是具有微尺度的空间组织结构、显著的生理异质性，以及对免疫攻击和抗菌压力因子极强的耐受性^1,2,3,4。尽管这些聚集体具有重要的临床意义，但调控其稳定性的机制仍不清楚；在此方案中，聚集体稳定性被定义为在上述压力条件下维持膜完整性和空间结构的能力。此前的研究更多关注支持表面附着型生物膜形成的基质成分，而对悬浮聚集体稳定机制的研究较为有限^5,6。

研究导致聚集体失稳的事件（如膜去极化和聚集体结构的变化）面临的主要障碍在于缺乏能够实时捕捉动态生理和结构变化的实验流程^7,8

方案

所有关于P. aeruginosa的操作必须在适当的BSL-2生物安全防护条件下进行，并获得机构生物安全审批。本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。

1. 生成 铜绿假单胞菌 在合成囊性纤维化痰液培养基（SCFM2）中的聚集体

注意：此步骤描述了在模拟囊性纤维化气道环境的生理相关条件下，铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）培养物的制备以及悬浮多细胞聚集体的形成。

1. 细菌培养物的制备
   1. 实验前一天，将携带质粒 pMRP9-1 (GFP) 的野生型 Pseudomonas aeruginosa PAO1 从冻存的甘油菌种接种至 5 mL 赖氨酸肉汤（LB）中¹⁴。
   2. 加入羧苄西林（300 µg/mL）以维持质粒筛选。
   3. 在 37 °C、200 rpm 振荡条件下过夜培养。
2. 回稀释及聚集体形成前准备
   1. 实验当天，将过夜培养物按 1:5 比例回稀释（1 mL 过夜培养物加入 4 mL LB）。此阶段不再添加抗生素；残留的抗生素量极少，不影响细菌生长。
   2. 在 37 °C....

结果

上述方案中提供了一种用于追踪聚集体膜动力学变化的方法 P. aeruginosa 在囊性纤维化肺部环境中建模 (图1）。使用携带 pMRP9-1（GFP）质粒的野生型 PAO1 菌株（图1A），HNE 用于模拟免疫应激，以及 DiBAC₄(5) 膜染料图1C），通过量化膜去极化的变化来反映膜电位的破坏及细胞稳态的紊乱（图2M）。最初，将培养物静置孵育4小时，以确保形成游离的聚集体（图1B）。随后， P. aeruginosa 经HNE处理的培养物使用DiBAC通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像₄（5）染色6小时（图1D）。通过优化采集参数（低激光功率、缩短曝光时间、.......

讨论

膜电位可作为细胞应激和内稳态失衡的敏感早期指标。在多细胞细菌聚集体中，这些生理变化发生在结构失稳之前，并可能驱动后续的结构破坏。本文介绍了一种基于成像的工作流程，利用慢响应、电位敏感性染料双(1,3-二丁基巴比妥酸)戊甲川花青（DiBAC₄(5)）来追踪铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）聚集体在受到宿主来源应激因素作用时的去极化过程。监测去极化状态有助于深入了解聚集体内细胞的生理特性，从而更全面地理解那些影响离子稳态或破坏膜电位的外界应激因素如何导致这些多细胞群体的失稳。通过该方法，可在生理相关条件下培养的聚集体中实现对膜活性的直接可视化与定量分析。

虽然DiBAC染料此前已被用于检测铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的膜去极化^20,21，但本研究将其应用扩展至在合成囊性纤维化痰液培养基（SCFM2）中形成的悬浮聚集体。SCFM2可重现囊性纤维化气道的关键生化与生物物理特征，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,3-二丁基巴比妥酸戊甲川双氧杂环化合物（DiBAC）4(3))	AAT Bioquest	21411	亲脂性阴离子分子
1,3-二丁基巴比妥酸戊甲川双恶唑啉（DiBAC）4(5))	AAT Bioquest	21410	亲脂性阴离子分子
羧苄青霉素	国际研究产品	C46000-5.0	用于筛选表达GFP的PAO1菌株
Cellvis 4孔35 mm玻璃底培养皿	Fisher	NC0600518	玻璃底培养皿可在成像过程中维持悬浮聚集体在生长培养基中的培养
离心	贝克曼库尔特生命科学	B06320	配以贝克曼库尔特生命科学公司SX4400水平转子（货号：B01425）
共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）	蔡司	LSM 880	本方案中所述实验所使用的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）型号已不再供应，但LSM 900是其更新的等效替代型号
培养管	杰内西	21-130	无菌；聚丙烯
DAPI	赛默飞世尔科技	62248	用于中性粒细胞DiBAC染色的潜在未来应用4(5)
一次性比色皿	Brand Tech	759086D	1.5 mL，半微量
DMSO	Millipore-Sigma	276855-100ML	用于DiBAC的重悬4(3,5)
DRAQ5	赛默飞世尔科技	65-0880-92	用于中性粒细胞DiBAC染色的潜在未来应用4(3)
用于共聚焦激光扫描显微镜的环境培养箱	PECON	LSM 880	该系统专为蔡司产品设计，通常被称为 "孵育系统 S" 所有组件均可通过蔡司订购，作为 LSM 880（或类似）系统的附加部件
硫酸庆大霉素	Fisher	BP918-1	用于筛选表达RFP的PA1633菌株
甘油	杰内西	18-205	用于在 -80 ℃ 长期保存菌株的冷冻 °C
人中性粒细胞弹性蛋白酶（HNE）	Millipore-Sigma	324681-50UG	重悬后，在4℃下可稳定保存1个月 °C 或 20 摄氏度下保存 1 年 °C
Imaris x64 软件	Oxford Instruments		版本 10.2.0
浸油	电子显微镜科学公司	16919-12	不干燥；在37℃下标准化 °C
培养箱	Benchmark Scientific	H1001-M	能够振荡
LB肉汤（Lysogeny Broth）	杰内西	11-118	米勒混合液
mCherry 质粒			由合作者提供
PA1633 转座子突变菌株			由合作者提供
磷酸盐缓冲液（PBS）	赛默飞世尔科技	3002	pH 7.0
乙酸钠	赛默飞世尔科技	AM9740	3M；pH 5.5；无RN酶
氯化钠	Fisher	S271-500	用于HNE的重建
分光光度计	VWR	634-0882	用于测量细胞密度，以接种PAO1/PA1633至SCFM2
无菌 0.22µm 滤光片	杰内西	25-244	用于纯化重建的 HNE
无菌微量离心管	杰内西	24-272LR	0.6 mL
无菌注射器	Fisher	14955459	用于纯化重组HNE
SX4400 摇摆桶转子	贝克曼库尔特生命科学	B01425	与贝克曼库尔特生命科学离心机（货号 B06320）配对使用
合成囊性纤维化痰液培养基（SCFM2）	SyntheBiome	10002-500	批次编号：001-CF2-0724
超纯水	杰内西	18-195	用于HNE的复性
野生型铜绿假单胞菌PAO1携带pMRP9-1质粒			该 pMRP9-1 质粒含有 GFP，并表达羧苄青霉素抗性
ZEN 黑色版 2.3 蔡司成像软件	Zeiss		与 LSM 880 兼容