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方法文章

实时成像宿主诱导应激反应 铜绿假单胞菌 聚集体

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DOI：

10.3791/70682

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2026年5月15日

 , 
1Department of Molecular Medicine, University of South Florida

本文内容

摘要

Pseudomonas aeruginosa 聚集体表现出对抗生素和免疫细胞更强的耐受性。目前关于膜完整性在聚集体存活中的作用尚缺乏深入研究。本研究展示了一种定量分析P. aeruginosa聚集体内细胞膜动态变化的方法，以阐明细胞完整性如何影响聚集体的整体存活性。

摘要

囊性纤维化（CF）等慢性感染由微小但高度耐受的Pseudomonas aeruginosa聚集体维持，这些聚集体在免疫和治疗压力下仍能持续存在。与经典生物膜不同，这些聚集体代表了一种独特的致病单位——即在宿主诱导的应激条件下仍能保持结构完整性和生理稳态的微尺度、空间有序的群体。然而，目前尚不清楚这些聚集体在上述条件下维持完整性的机制，也不明确这些稳态过程是否可被选择性破坏。解决这一空白的主要障碍在于缺乏能够实时捕捉将生理应激与结构稳定性及崩解过程关联起来的动态、空间分辨的工具。本研究提出了一种整合成像与分析的工作流程，用于量化聚集体对宿主相关应激因子的响应。利用电压敏感性染料DiBAC4(5)，监测在合成囊性纤维化痰液培养基（SCFM2）中形成的聚集体内部膜去极化现象，作为生理紊乱的早期指标。高分辨率时间序列共聚焦显微镜可实现对稳定状态及应激诱导状态下聚集体的可视化，而图像分割与基于体素的分析则可在单细胞分辨率下对膜完整性及聚集体解体过程中的空间异质性进行定量绘图。该工作流程建立了一个可重复且可灵活调整的平台，用于关联多细胞细菌聚集体中的生理应激与结构变化结果。通过实现对维持或破坏聚集体完整性的过程进行定量解析，该方法为识别和靶向调控聚集体弹性的稳态机制奠定了关键基础，推动了针对这种具有重要临床意义的细菌持续存在模式的新型干预策略的发展。

引言

慢性细菌感染通常并非由附着在表面的大块生物膜维持，而是由在宿主相关环境中形成的微小多细胞聚集体所导致。在囊性纤维化（CF）及其他慢性气道疾病中，Pseudomonas aeruginosa 通常以悬浮状态存在于黏液或痰液中的聚集体形式存在，而非附着于上皮表面的经典生物膜形式。这些聚集体代表了一种独特的生长模式，其特征是具有微尺度的空间组织结构、显著的生理异质性，以及对免疫攻击和抗菌压力因子极强的耐受性1,2,3,4。尽管这些聚集体具有重要的临床意义，但调控其稳定性的机制仍不清楚；在此方案中，聚集体稳定性被定义为在上述压力条件下维持膜完整性和空间结构的能力。此前的研究更多关注支持表面附着型生物膜形成的基质成分，而对悬浮聚集体稳定机制的研究较为有限5,6。

研究导致聚集体失稳的事件（如膜去极化和聚集体结构的变化）面临的主要障碍在于缺乏能够实时捕捉动态生理和结构变化的实验流程7,8。传统的整体检测方法和终点成像技术无法解析应激反应如何在聚集体内部产生、这些反应在空间上如何分布，以及生理功能减弱（如膜去极化和离子稳态丧失）如何转化为细胞应激的早期迹象并最终导致物理性崩解。尽管共聚焦显微镜已广泛应用于表面附着的生物膜，但能够将时间分辨成像与定量分析相结合、从而直接关联细胞生理状态与聚集体结构及膜活性的研究方法仍较少。

细菌膜电位的变化是细胞应激和稳态失衡的早期且敏感的指标。电压敏感性染料（如双(1,3-二丁基巴比妥酸)戊甲川花青染料（DiBAC4(5)））会在去极化的细胞中积累，从而提供一种非破坏性的、基于荧光的膜完整性检测方法。尽管DiBAC染料已被用于评估浮游培养物和表面附着生物膜中的膜去极化9,10，但其在多细胞聚集体中的应用，特别是在生理相关生长条件下进行延时成像时，仍较为有限。

本文介绍了一种整合的成像与分析工作流程，可实现对铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）聚集体中膜去极化及结构破坏的实时可视化与定量分析。聚集体在合成囊性纤维化痰液培养基（SCFM2）中形成，该培养基为化学成分明确的培养基，能够模拟囊性纤维化（CF）气道的关键营养和离子特征，并支持细菌在无外加表面或流动条件下自发形成聚集体11,12。在此条件下，P. aeruginosa 形成的悬浮聚集体在大小和结构异质性方面与在CF痰液及气道样本中观察到的聚集体相似，为研究聚集体行为提供了具有生理相关性的实验平台13 。

在受控的温度和湿度条件下，利用延时共聚焦激光扫描显微镜观察，该实验流程可捕捉稳定的聚集体状态以及由应激诱导的状态，后者表现为膜去极化增强和细胞稳态丧失，并可在长时间成像过程中持续监测。通过结合基于DiBAC的膜电位报告技术与高分辨率z轴层扫成像，该方法能够在单细胞水平上定量分析DiBAC₄(5)荧光强度，并将数值映射并结合各个聚集体的空间位置进行分析。后续的图像分割及基于体素的表面分析可同时对聚集体结构变化和膜去极化程度进行定量评估。

重要的是，尽管本实验方案以在SCFM2培养基中形成的铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）聚集体为例进行演示，但该工作流程具有广泛的通用性。成像策略、基于染料的生理响应读数以及分析框架均可轻松适用于其他细菌种类、促进聚集体形成的培养基以及各类应激因素，包括抗菌剂、免疫效应分子或环境扰动。因此，该方法为在多种实验条件下研究细菌群落稳定性的探究提供了一个可转移且可重复的实验平台。

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方案

所有关于P. aeruginosa的操作必须在适当的BSL-2生物安全防护条件下进行，并获得机构生物安全审批。本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。

1. 生成 铜绿假单胞菌 在合成囊性纤维化痰液培养基（SCFM2）中的聚集体

注意：此步骤描述了在模拟囊性纤维化气道环境的生理相关条件下，铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）培养物的制备以及悬浮多细胞聚集体的形成。

  1. 细菌培养物的制备
    1. 实验前一天，将携带质粒 pMRP9-1 (GFP) 的野生型 Pseudomonas aeruginosa PAO1 从冻存的甘油菌种接种至 5 mL 赖氨酸肉汤（LB）中14。
    2. 加入羧苄西林（300 µg/mL）以维持质粒筛选。
    3. 在 37 °C、200 rpm 振荡条件下过夜培养。
  2. 回稀释及聚集体形成前准备
    1. 实验当天，将过夜培养物按 1:5 比例回稀释（1 mL 过夜培养物加入 4 mL LB）。此阶段不再添加抗生素；残留的抗生素量极少，不影响细菌生长。
    2. 在 37 °C、200 rpm 振荡条件下继续培养约 2 小时，使培养物进入对数生长期。
      注：在此条件下培养约 2 小时后，细胞通常处于指数早期阶段。此外，在接种至 SCFM2 前会对细胞进行洗涤，以最大限度减少残留抗生素的影响。
  3. SCFM2 培养基的准备与平衡
    1. 在回稀释阶段结束前约 30 分钟，将预先配制的 SCFM2 分装至无菌离心管中，并预热至 37 °C。
    2. 若使用 4 孔玻璃底成像培养皿，每孔加入 500 µL SCFM2。需额外准备一定体积以补偿移液误差。
      注：SCFM2 储存于 4 °C。预热可减少温度冲击，提高聚集体形成的可重复性。
  4. 接种物的洗涤与标准化
    1. 在室温下以 4200 × g 离心 4 分钟，收集菌体。
      注： 如需将离心力换算为 rpm，摆桶转子的半径为 172 mm。
    2. 弃去上清液，将菌体沉淀用 3 mL 无菌 PBS（pH 7.0）重悬。
    3. 重复洗涤步骤两次（共洗涤三次）。
    4. 测定 OD₆₀₀，并计算使 SCFM2 初始 OD₆₀₀ 达到 0.05 所需的菌液体积。
    5. 短暂涡旋混匀细胞，接种至各含 500 µL SCFM2 的孔中。
  5. 静态条件下聚集体的形成
    1. 将接种后的 SCFM2 在 37 °C 静置培养 4 小时，以诱导聚集体形成。
      注：4 小时的培养可稳定产生悬浮聚集体，其大小和异质性与在囊性纤维化（CF）痰液及气道样本中观察到的聚集体相似，同时可避免后期生物膜成熟1,15。

2. 免疫相关应激原（人中性粒细胞弹性蛋白酶）的制备

注意：此步骤描述了用于诱导细胞应激及破坏细菌聚集体的宿主来源应激因子的制备过程。

  1. 人中性粒细胞弹性蛋白酶（HNE）的重悬与保存
    1. 根据制造商建议，使用 50 mM 醋酸钠、200 mM NaCl 和无菌水重悬人中性粒细胞弹性蛋白酶。
    2. 配制 50 µg/L 的储存液，并使用 0.2 µm 滤器过滤除菌。
    3. 分装为 50 mL 体积，于 −20 °C 保存。
    4. 使用前夜，在 4 °C 条件下解冻一份分装样品。
      ​注意：分装可最大限度减少冻融循环，从而避免酶活性降低和实验变异性增加。分装后的酶液在 4 °C 下可稳定保存约 1 个月。

3. 使用DiBAC4(5)检测膜去极化的制备与应用

注意：此步骤描述了电压敏感性染料的制备及其在可视化聚集体内膜去极化中的应用。

  1. DiBAC4(5) 的制备与保存
    1. 首先制备 DiBAC4(5) 储存液。将 DiBAC4(5) 粉末溶于无水 DMSO，配制成 1 mg/mL 的溶液。
      注意： DiBAC4(5) 在 DMSO 中的重悬遵循制造商的标准建议。
    2. 分装为每份 100 µL，于 −20 °C 避光保存。
    3. 每份分装液使用不超过两次。
      注意：DiBAC4(5) 在功能上与 DiBAC4(3) 等效，但本实验选择前者以匹配 GFP 的激发/发射光谱。在本方案中，DiBAC4(3) 仅用于结果部分讨论的额外染色。本方案中主要使用的染料为 DiBAC4(5)。

4. 膜去极化的时间推移共聚焦成像 P. aeruginosa 聚集体

注意：此步骤描述了如何获取高分辨率、时间分辨的共聚焦图像，以捕捉聚集体中的动态生理和结构变化。

  1. 显微镜与环境培养室的准备
    1. 在共聚焦显微镜载物台上安装加热微孔板插件或环境培养室。
    2. 在成像前至少1小时开启温度和湿度控制，并设置为37 °C。
    3. 在 采集 标签，找到 激光 选项卡，并在使用前约1小时打开所需激光器以充分预热（GFP使用氩离子激光器；DiBAC使用DPSS 561-10激光器）4(5)) (补充图 1A).
      注意：在长时间延时实验中，稳定的环境控制可减少焦点漂移并维持聚集体的完整性。
  2. 免疫应激原的应用
    1. 聚集形成4小时后，向实验孔中加入HNE，使其终浓度为20 µg/L16.
    2. 对照孔不做任何处理。
    3. 将4孔培养皿转移至显微镜载物台。
      注意：HNE 以生理学相关浓度（µg/L）配制，该浓度基于文献报道的诱导痰中水平，而非以浓缩原液形式制备。本研究中使用的具体浓度可参见 McGarvey 等人的研究。16 在……下方 IS （诱导痰） NE-AAT（NE/α1-抗胰蛋白酶复合物） HV （健康志愿者）
  3. 鉴定感兴趣的聚集区域
    1. 使用 定位 选项卡和20倍物镜，打开 透射光 通过明场成像鉴定富含聚集体的区域（补充图1B).
    2. 尽管仍在使用明场成像，导航至 采集 标签，并使用以下方法保存 x、y 和 z 坐标 职位 模块（补充图1C).
    3. 每个孔进行多次技术重复。
  4. 高分辨率Z轴层扫与时间序列采集
    1. 移动到已保存的位置，切换至63×油镜物镜。
    2. 放置培养皿前，先滴加镜油。
    3. 在 采集 标签，使用以下方法配置通道 智能设置 (补充图1D）：GFP（488/509 nm）——绿色，DiBAC4(5) (591/615 nm) – 标记为红色。
    4. 导航至 活体 查看，然后使用 Z轴扫描 模块，通过调节细准焦螺旋确定盖玻片底部位置，然后单击将其设为第一个 z 轴位置 设置初始值 (补充图1E).
    5. 向上移动，直到 范围 表示 60 µm，并通过点击设置最终的 z 位置 设置为最后 (补充图1E).
    6. 关闭 活体 查看并激活 确定焦点选择 寻找表面，随后选择 储存焦点 仅当状态显示时 反射发现 (补充图1F).
    7. 对每个保存的位置，使用以下方法重复进行焦点校准 Z轴扫描 和 确定焦点 模块
    8. 配置 时间序列 每3分钟采集一次各位置的图像，持续6小时（补充图1G).
      注意： 此处可暂停实验方案，以融化、添加并孵育 DiBAC4(5) 染料，孵育期结束后可继续进行。
    9. 选择 开始实验.
      注意：三分钟的时间间隔在时间分辨率与光毒性和光漂白的考量之间达到平衡。
  5. DiBAC4(5) 加样与孵育
    1. 加入DiBAC4(5) 加入每个孔，使其终浓度为 5 µg/mL9.
    2. 避光孵育30分钟，然后开始延时成像。
      注意：此孵育步骤可使染料充分平衡，同时尽量减少背景荧光。

5. 聚集体结构与DiBAC4(5) 共定位的定量图像分析

注意：此步骤描述了一种将膜去极化与聚集体结构及其去稳定化相关联的定量工作流程。

  1. 图像导入与通道分离
    1. 将图像文件（.czi 格式或等效格式）上传至 Imaris x64 软件版本 10.2.0 或更高版本。
    2. 通过检查图像元数据中的x、y和z像素尺寸（体素大小）是否准确反映共聚焦显微镜的采集参数（物镜、缩放倍数、z步进大小），来验证体素校准的准确性。校准错误将导致空间和体积测量出现误差。
  2. 细菌聚集体和DiBAC的表面渲染4(5) 信号
    1. 使用 表面 模块渲染 P. aeruginosa 聚集体
      1. 下 分割设置，选择 GFP 通道（补充图 2A).
      2. 选择启用 分离接触的物体（区域生长） 并调节强度 阈值 以完全捕获聚集体（补充图 2B).
      3. 在……之下 过滤种子 点 模块，将滤器类型更改为 图像体素数量 Img = 1 并设定为90%（补充图2C).
      4. 渲染处理完成后，将表面设置为 100%补充图 2D).
    2. 完成渲染并将细菌表面赋为绿色补充图2E).
    3. DiBAC 的重复染色4(5) 通道并指定红色着色。
  3. 共定位与基于体积的定量分析
    1. 选择 DiBAC4(5) 表面渲染补充图3A）并确定将在哪些时间点进行共定位分析。
    2. 导航至 统计学 > 详细标签 > 特定值 (补充图 3B).
    3. 通过选择具有共定位的对象来定义共定位 细菌表面的最短距离 0.00 的补充图 3B).
    4. 定位 编辑， 然后 重复 这些物体以生成与细胞重叠的DiBAC表面（补充图 3C）。务必重命名此表面以表明其重叠特性。
    5. 在 详细 标签下方 平均值，记录每个选定时间点的总体积值，包括：（1）总DiBAC4(5) 信号补充图3D）；（2）共定位的 DiBAC4(5) 信号补充图3E).
    6. 计算重叠百分比公式为：
      Percent overlap formula; relevant for cell volume analysis; includes DiBAC volume equation.
      注：重叠百分比反映了聚集物内与细胞相关的DiBAC₄(5)信号所占比例，代表在特定时间点的膜去极化程度。
      注意：尽管本示例使用了 P. aeruginosa 在SCFM2中形成聚集体并经HNE处理后，该实验流程可广泛适用于其他细菌种类、促进聚集体形成的培养基、荧光报告系统以及包括抗菌剂或环境扰动在内的各种应激因素。

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结果

上述方案中提供了一种用于追踪聚集体膜动力学变化的方法 P. aeruginosa 在囊性纤维化肺部环境中建模 (图1）。使用携带 pMRP9-1（GFP）质粒的野生型 PAO1 菌株（图1A），HNE 用于模拟免疫应激，以及 DiBAC4(5) 膜染料图1C），通过量化膜去极化的变化来反映膜电位的破坏及细胞稳态的紊乱（图2M）。最初，将培养物静置孵育4小时，以确保形成游离的聚集体（图1B）。随后， P. aeruginosa 经HNE处理的培养物使用DiBAC通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像4（5）染色6小时（图1D）。通过优化采集参数（低激光功率、缩短曝光时间、...

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讨论

膜电位可作为细胞应激和内稳态失衡的敏感早期指标。在多细胞细菌聚集体中，这些生理变化发生在结构失稳之前，并可能驱动后续的结构破坏。本文介绍了一种基于成像的工作流程，利用慢响应、电位敏感性染料双(1,3-二丁基巴比妥酸)戊甲川花青（DiBAC4(5)）来追踪铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）聚集体在受到宿主来源应激因素作用时的去极化过程。监测去极化状态有助于深入了解聚集体内细胞的生理特性，从而更全面地理解那些影响离子稳态或破坏膜电位的外界应激因素如何导致这些多细胞群体的失稳。通过该方法，可在生理相关条件下培养的聚集体中实现对膜活性的直接可视化与定量分析。

虽然DiBAC染料此前已被用于检测铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的膜去极化20,21，但本研究将其应用扩展至在合成囊性纤维化痰液培养基（SCFM2）中形成的悬浮聚集体。SCFM2可重现囊性纤维化气道的关键生化与生物物理特征，...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

S.E.D 获得了南佛罗里达大学分子医学系启动资金，以及囊性纤维化基金会（CFF）研究资助（CFF）（DARCH19G0、DARCH22P0、DARCH25G0）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,3-二丁基巴比妥酸戊甲川双氧杂环化合物（DiBAC）4(3))AAT Bioquest21411 亲脂性阴离子分子 
1,3-二丁基巴比妥酸戊甲川双恶唑啉（DiBAC）4(5))AAT Bioquest21410 亲脂性阴离子分子 
羧苄青霉素 国际研究产品 C46000-5.0用于筛选表达GFP的PAO1菌株
Cellvis 4孔35 mm玻璃底培养皿FisherNC0600518玻璃底培养皿可在成像过程中维持悬浮聚集体在生长培养基中的培养 
离心贝克曼库尔特生命科学 B06320配以贝克曼库尔特生命科学公司SX4400水平转子（货号：B01425）
共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）蔡司LSM 880本方案中所述实验所使用的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）型号已不再供应，但LSM 900是其更新的等效替代型号 
培养管杰内西21-130无菌；聚丙烯 
DAPI赛默飞世尔科技62248用于中性粒细胞DiBAC染色的潜在未来应用4(5)
一次性比色皿 Brand Tech759086D1.5 mL，半微量
DMSOMillipore-Sigma276855-100ML用于DiBAC的重悬4(3,5)
DRAQ5赛默飞世尔科技65-0880-92用于中性粒细胞DiBAC染色的潜在未来应用4(3)
用于共聚焦激光扫描显微镜的环境培养箱PECONLSM 880该系统专为蔡司产品设计，通常被称为 "孵育系统 S" 所有组件均可通过蔡司订购，作为 LSM 880（或类似）系统的附加部件
硫酸庆大霉素 FisherBP918-1用于筛选表达RFP的PA1633菌株
甘油 杰内西18-205用于在 -80 ℃ 长期保存菌株的冷冻 °C
人中性粒细胞弹性蛋白酶（HNE）Millipore-Sigma324681-50UG重悬后，在4℃下可稳定保存1个月 °C 或 20 摄氏度下保存 1 年 °C
Imaris x64 软件Oxford Instruments 版本 10.2.0
浸油 电子显微镜科学公司 16919-12不干燥；在37℃下标准化 °C
培养箱 Benchmark ScientificH1001-M能够振荡
LB肉汤（Lysogeny Broth）杰内西11-118米勒混合液
mCherry 质粒 由合作者提供 
PA1633 转座子突变菌株 由合作者提供 
磷酸盐缓冲液（PBS）赛默飞世尔科技3002pH 7.0
乙酸钠赛默飞世尔科技AM97403M；pH 5.5；无RN酶
氯化钠Fisher S271-500用于HNE的重建
分光光度计 VWR634-0882用于测量细胞密度，以接种PAO1/PA1633至SCFM2
无菌 0.22µm 滤光片杰内西25-244用于纯化重建的 HNE
无菌微量离心管杰内西24-272LR0.6 mL
无菌注射器Fisher14955459用于纯化重组HNE
SX4400 摇摆桶转子 贝克曼库尔特生命科学 B01425与贝克曼库尔特生命科学离心机（货号 B06320）配对使用
合成囊性纤维化痰液培养基（SCFM2）SyntheBiome10002-500批次编号：001-CF2-0724
超纯水杰内西18-195用于HNE的复性
野生型铜绿假单胞菌PAO1携带pMRP9-1质粒 该 pMRP9-1 质粒含有 GFP，并表达羧苄青霉素抗性 
ZEN 黑色版 2.3 蔡司成像软件 Zeiss与 LSM 880 兼容

参考文献

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