利用LysoTracker进行溶酶体示踪分析以定量评估人成纤维细胞的细胞衰老

摘要

本文介绍了一种活细胞LysoTracker实验方案，用于检测IMR-90人成纤维细胞衰老过程中溶酶体的重塑变化。

摘要

细胞衰老是一种稳定的细胞周期阻滞状态，伴随一系列特征性表型，包括细胞形态增大、分泌信号改变以及显著的溶酶体重塑。衰老细胞通常表现出酸性内体-溶酶体区室的扩张，并伴有腔内酸度和降解能力的变化，这为简单地通过活细胞成像检测与衰老相关的细胞器重塑提供了机会。本研究描述了一种活细胞成像方案，利用酸性示踪荧光染料LysoTracker Deep Red，以酸性细胞器区室的pH依赖性信号作为衰老负荷的间接指标。该方法在经历复制性衰老的IMR-90人肺成纤维细胞中进行了验证，通过连续传代进行观察。本方案详细说明了细胞培养与传代追踪、LysoTracker染色、荧光成像，以及基于图像的溶酶体信号强度和每个细胞中信号阳性区域的定量分析。平行培养物中的衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色作为可选的验证性标志物被纳入，而非作为参考标准。代表性结果表明，与早期传代对照组相比，晚期传代细胞中酸性示踪荧光染料信号更强，lyso阳性区域更大，这与衰老过程中酸性细胞器区室的扩张一致。由于检测信号依赖于区室体积、质子梯度及染料可及性，因此应将其解释为溶酶体重塑的间接相关指标，而非溶酶体数量或生物生成的直接测量。该方案易于实施，可适用于其他细胞类型或诱导衰老的应激条件，为传统的终点检测方法提供了一种实用且定量的补充手段。

引言

细胞衰老是一种由多种应激和衰老相关刺激因素激活的持久性细胞周期阻滞程序^1,2,3,4。由于没有单一标志物具有完全特异性，衰老细胞通常通过一组标志物的组合来鉴定。其典型特征包括细胞形态增大、扁平化，衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性增强，DNA损伤灶的形成，以及促炎性分泌表型（SASP）^2,4,5。在这些特征中，溶酶体重塑已被认为是衰老过程中一个显著且具有重要功能意义的特征^6,7。衰老细胞表现出显著的溶酶体改变，包括溶酶体大小和数量的显著增加，以及功能的改变（通常涉及溶酶体pH的部分中和及未降解物质的积累）^6,7,8,9。这种溶酶体扩张有助于增强SA-β-Gal活性，后者是一种公认的衰老标志物，反映了衰老细胞中溶酶体β-半乳糖苷酶活性的升高^10,11,12。事实上，SA-β-Gal染色正是利用这一现象，通过在次优pH值（6.0）条件下孵育，使染料在衰老细胞的溶酶体中选择性沉淀，因为这些溶酶体积累了该酶且pH值高于年轻细胞^10,12,13。

溶酶体在蛋白质 turnover 和信号传导中发挥核心作用，其功能失调现已被认为是衰老和细胞衰老的标志之一^1,2,4,6。衰老细胞常表现出溶酶体功能障碍，表现为腔内 pH 值升高、酶活性改变以及脂褐素（一种氧化大分子形成的自发荧光色素）的积累^6,14。溶酶体的生物合成通常通过转录因子 EB（TFEB）及相关因子调控的协调性溶酶体表达与调控（CLEAR）网络而上调或发生改变^6,7,15。这一过程可使衰老细胞在应对压力时通过扩大降解区室而增加溶酶体数量^6,7,10。相反，衰老细胞也可能出现溶酶体功能下降（例如酸性减弱），这可能影响自噬等过程，并赋予细胞对某些应激（包括铁死亡）的抵抗能力^6,8。因此，检测溶酶体含量与功能对于理解与识别细胞衰老至关重要^6,16。

LysoTracker Deep Red 是一种可穿透膜的荧光探针，通过溶酶体膜上的质子化驱动捕获作用选择性地在酸性细胞器中积累^16,17。所产生的信号反映的是酸性区室体积、质子梯度强度以及局部染料可用性的综合情况，而非溶酶体质量；该信号可能随着溶酶体pH值或膜状态的变化而改变，而这些变化可独立于总溶酶体数量发生^6,16。在细胞衰老背景下，与前衰老细胞相比，衰老细胞表现出更大且染色更强的LysoTracker阳性区室⁹，这与生化和超微结构研究所报道的酸性细胞器区室扩张及溶酶体生物合成增加一致^6,7,10。这种活细胞检测方法相较于传统的终点法SA-β-Gal染色具有多项优势：可实现对单个细胞进行定量和空间分辨分析，可与其他荧光报告分子联用，无需固定步骤，并通过报告连续性特征而非二元终点来捕捉细胞异质性^6,16。在本实验方案中，LysoTracker信号被用作活细胞中酸性细胞器区室的读出指标，相应地解释依赖于实验条件的变化，而不将其视为溶酶体数量的绝对衡量标准^6,16。

本方案详细描述了使用LysoTracker Deep Red对经历复制性衰老的IMR-90成纤维细胞中的溶酶体变化进行分析的方法。IMR-90是一种正常的人类二倍体成纤维细胞系（女性，胎儿肺来源），广泛应用于衰老研究；与其他类原代成纤维细胞（如WI-38）类似，IMR-90细胞在约50–60次群体倍增（海弗利克极限）后因端粒缩短和DNA损伤信号通路激活而进入衰老状态^18,19。本方案介绍了如何通过连续传代培养诱导IMR-90细胞衰老，利用形态学特征和SA-β-Gal染色验证衰老状态，并对活细胞使用LysoTracker Deep Red进行染色以进行荧光成像^5,10,12,13。方案包含图像采集与分析步骤，提供每细胞溶酶体数量、每细胞总溶酶体面积及平均荧光强度等定量读数。同时强调了实验对照和安全注意事项，包括染料和固定剂的谨慎操作、成像过程中光毒性的最小化，以及对衰老细胞中自发荧光的校正。本方法以复制性衰老模型为例进行演示，但也可适用于其他模型，包括药物诱导的衰老（如阿霉素或依托泊苷处理）或氧化剂引起的应激诱导早衰（SIPS）^2,3,4,19,20。在每种情况下，基于LysoTracker的检测结果均应与适当的对照（增殖或静息细胞）进行比较，并尽可能通过至少一种传统衰老标志物（如SA-β-Gal或p16INK4a表达）进行交叉验证^3,5,12,13。

活细胞溶酶体分析通过提供一种可重复、单细胞分辨率的关键细胞器表型——溶酶体扩张——的测量方法，填补了细胞衰老检测中的实际空白，该表型直接与衰老细胞的功能相关（例如增强的降解能力和分泌活性）^2,3,4,6。由于LysoTracker染色适用于高通量成像和流式细胞术，该实验方案可扩展应用于药物筛选等场景（例如测试清除衰老细胞的药物或溶酶体功能调节剂）^2,3,6。未来发展方向之一是，本方案生成的单细胞溶酶体特征可用于下游分类分析，包括机器学习模型；此类分类器的训练与验证不在本实验方案的范围之内。总体而言，该方法（图1）能够实现对衰老生物学中溶酶体维度的可视化与定量分析，有助于揭示溶酶体生物发生和形态在衰老或应激过程中如何变化，并为针对衰老细胞中溶酶体的干预措施提供测试平台。用于分割细胞核、生成细胞关联区域、设定阈值并定量分析LysoTracker特征，以及重现本文中每孔和每细胞分析结果的图像分析工作流程，已作为开源配套软件包（SenTrackLite v0.5.0）实现，随文提供为补充文件1，并以持久DOI归档，可供引用和重复使用²¹。

图1：活细胞溶酶体衰老检测的总体流程。（A）实验流程。活细胞使用LysoTracker Deep Red和细胞核染料进行染色，通过标准荧光显微镜成像，并可平行进行SA-β-Gal染色以用于验证。（B）基于图像的单细胞测量。利用细胞核通道识别单个细胞，以细胞核为锚定点进行区域扩展，定义每个细胞的区域，用于从LysoTracker通道中提取与溶酶体相关的测量参数。代表性的单细胞测量参数包括溶酶体面积、LysoTracker平均荧光强度和溶酶体数量。在生成或确认参考数据集时，SA-β-Gal染色可作为可选的验证标记。（C）定量分析与输出结果。通过简单的评分方法，将单细胞的溶酶体测量参数整合为单个细胞的衰老评分或衰老概率。输出结果包括单细胞数值，以及孔水平或条件水平的衰老负荷汇总，可用于不同衰老诱导条件或衰老细胞清除治疗条件之间的比较。图示使用BioRender.com制作。
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方案

IMR-90 细胞是一种公认的人成纤维细胞系，不涉及人类受试者研究，因此无需伦理审批或知情同意。所有操作均按照纽约州立大学奥尔巴尼分校的生物安全指南进行，适用于生物安全二级（BSL-2）条件下的人源细胞系实验。

1. 一般准备和工作流程概述

1. 将实验目标定义为利用LysoTracker Deep Red染色和活细胞核染料对IMR-90细胞进行活细胞溶酶体谱型分析，以量化溶酶体重塑，作为细胞衰老负荷的连续性读数。将主要生物学比较定义为以下设计之一：
   1. 衰老诱导与匹配的非诱导对照
   2. 高衰老与低衰老条件在剂量或时间序列中的比较
   3. 衰老细胞富集条件下经衰老细胞清除剂处理 与溶剂处理的衰老高水平对照
   4. 包括低衰老基线组和高衰老组的抗衰老治疗系列。
2. 为所有实验建立最低限度的对照结构。
   1. 包括一个与铺板密度、染色时间和成像设置相匹配的衰老水平低的对照组。
   2. 包括由明确的衰老诱导因素或晚期传代复制性衰老所生成的高衰老水平组。
   3. 每种条件下均应设置生物学重复，并在各条件下以相同的时序进行染色和成像。
3. 将检测读数定义为基于图像的溶酶体重塑直接测量指标：
   1. 使用一致的强度阈值，在溶酶体阳性掩膜内测量单个细胞的平均 LysoTracker 强度，作为主要的检测读数。在单细胞水平上，该指标能够以最大的效应量区分低衰老与高衰老状态，且对视野水平的细胞核密度不敏感。补充图1).
   2. 记录以下次要读数，这些指标可反映区室扩张，但对分割选择或视野层面的细胞核密度更为敏感：每个细胞的溶酶体富集区域以及每个视野中每个细胞核的LysoTracker总强度。每个细胞核的总强度在细胞密度较高的视野中具有参考价值，但当视野中细胞核数量较少时，该指标会变得不稳定，因为此时单个细胞对基于每个细胞核的归一化结果影响过大。
   3. 在成像分辨率支持对溶酶体斑点进行区分时，记录可选的溶酶体斑点数量及大小参数。
4. 使用衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色作为可选的验证步骤，可在平行孔或匹配样本上进行，具体取决于实验条件。通过该验证确认高代次培养细胞相较于低代次培养细胞表现出更高的SA-β-Gal阳性率。
5. 通过在数据采集前固定以下变量，使不同条件下的检测标准化：
   1. LysoTracker 工作浓度（75 nM）及染色时间（30 分钟）。
   2. 细胞核染料名称及工作浓度范围（例如，Hoechst 33342，1 µg/mL 至 2 µg/mL）。
   3. 成像参数，包括物镜放大倍数、曝光时间、光照强度、像素合并（binning）和聚焦策略。
   4. 培养板格式和成像配置（透明底成像板或玻璃底培养皿），包括重复孔的布局。
   5. 阈值选择与强度归一化
      1. 在实验的所有孔中，对LysoTracker通道应用单一的固定强度阈值，以定义溶酶体阳性掩膜。
      2. 在实验设置期间，使用涵盖预期强度范围的校准样本区域（例如，两个衰老程度低和两个衰老程度高的区域）选择阈值，并在该次实验的所有孔中保持该阈值恒定；若允许每孔的阈值单独变化，将导致测量结果与结论之间产生循环依赖。
      3. 为进行跨实验比较，应在同一实验批次中以相同的激光功率、曝光时间和增益设置采集所有条件下的数据，并在图注中注明这些参数设置。
      4. 如果需要在不同实验批次间进行绝对荧光强度比较，应包含荧光参考标准品（例如参考微球板或固定的参考孔），并据此对测得的荧光强度进行归一化处理。
         注意： 切勿在没有相同采集设置或基于参考归一化的情况下跨实验会话比较原始强度值。
   6. 细胞核密度归一化
      注意： 由于衰老细胞在相同接种时间下通常表现出增殖能力降低和核密度下降7,10，因此基于绝对像素计数的视野级指标（如溶酶体阳性总面积）可能受到每视野细胞数量的影响。
      1. 同时报告原始值和按细胞核归一化的值（原始值除以Hoechst分割的细胞核数量）。
         注意： 基于单个细胞核的归一化可控制与密度相关的混杂因素，适用于以单个细胞为单位的解释和比较。对于基于面积的读数，归一化值作为主要的度量指标，而未归一化的总量则予以保留以确保数据完整性。
6. 在保持活细胞信号质量和最小化技术变异性的条件下获取图像。染色和运输过程中，需将早期和晚期传代的培养板避光保护，并在成像期间尽量减少其脱离受控培养环境的时间。
7. 将荧光图像保存为单平面、单通道、无损的TIFF文件。采用一致的命名方案，确保细胞核图像与LysoTracker图像的配对关系，并保留与培养板、孔位、实验条件及重复次数的可追溯性。使用统一的主文件名并添加通道后缀（例如，_Hoechst.tif 和 _Lyso.tif）。将图像按实验分门别类存储于专用文件夹中，必要时设立子文件夹。
   注意： 一个实用的暂停节点是在建立早期和晚期传代细胞群后，确认晚期传代细胞培养物表现出生长减缓及类似衰老的形态特征。
8. (可选将氧浓度作为实验变量，通过在常氧和低氧条件下培养匹配的 IMR-90 细胞群。所有组别均进行相同处理。

2. 细胞培养与复制性衰老的诱导

1. 根据标准细胞培养操作解冻 IMR-90 人肺成纤维细胞，并在添加 10% 胎牛血清的最低必需培养基（MEM）中扩增细胞。若符合实验室常规和实验设计，可加入 1% 的青霉素-链霉素。将细胞维持在 37 °C、5% CO₂ 的环境中。
2. 保持细胞处于对数生长期，并在细胞融合度达到 70% 至 80% 前进行传代。采用一致的培养基操作和换液时间表，以减少不同实验批次间的变异性。每次传代之间每 2 至 3 天更换一次完全培养基。
   注意：培养基更换间隔不得超过 72 小时，否则营养耗竭和分泌因子的积累可能诱发应激相关表型，干扰复制性衰老的判断。
3. 将衰老低水平组定义为在维持正常增殖行为条件下持续活跃增殖的 IMR-90 培养物。铺板密度和操作方式应与其他实验组保持一致。
4. 根据实验目的选择以下一种方法建立衰老高水平组：
   1. 通过连续传代并追踪群体倍增数，诱导复制性衰老，直至增殖减缓和衰老相关形态学特征明显出现。
      注意：群体倍增水平（PDL）与传代次数是两个不同的指标，需分别记录。PDL 指解冻后的累积倍增数，每次传代时按以下公式计算：
      PDL_i = PDL_i-1 + log₂(收获细胞数 / 接种细胞数)¹⁸，
      而传代次数是指自解冻以来的亚培养次数。由于通常在细胞融合度约为 70%–80% 时以 1:4 比例分瓶，每次传代大约对应两个群体倍增，因此传代次数与累积 PDL 不可互换。
      注意：衰老高水平组通常出现在较高的群体倍增水平，此时增殖明显减缓，且衰老相关形态特征清晰可见。具体的阈值应根据每批 IMR-90 细胞的经验确定，因为不同供应商提供的细胞其 PDL 存在差异。
   2. 通过施加明确的衰老诱导刺激，并给予适当的表型发展时间，建立应激诱导的衰老模型。
   3. 当研究目标是验证某种特定条件是否诱导衰老时，可通过将细胞暴露于该条件下建立处理诱导的衰老模型。
5. 使用至少一种在平行孔中进行的正交检测方法，验证所选方法是否成功诱导了衰老高水平表型。可选择性地进行 SA-β-Gal 染色作为验证手段，并在包含该步骤时记录各条件下阳性细胞的比例。
   1. 当在 pH 6.0 条件下孵育 12 至 16 小时后，至少有 50% 的细胞显示出明确的核周蓝色 SA-β-Gal 染色，而对应的衰老低水平对照组在相同染色条件下阳性细胞不超过 10%，则该培养物可被认定为衰老高水平组¹³。
   2. 若结果超出上述范围，表明衰老诱导不完全或背景信号升高，应在进入成像步骤前重新优化实验条件。
      注意：在确定衰老低水平组和衰老高水平组后，暂停实验流程，通过形态学观察及可选的验证性染色确认两者之间存在清晰的表型差异。
6. 可选：衰老细胞清除药物（senolytic）处理方案设计
   1. 将衰老低水平和衰老高水平条件分别接种于多个重复孔中，待细胞贴壁并恢复后再进行处理。
   2. 对衰老高水平孔施加衰老细胞清除化合物，并设置仅使用溶剂处理的衰老高水平对照组。
   3. 设置一个接受相同溶剂处理的衰老低水平组，必要时还包括相同浓度化合物的处理组，以监测非衰老细胞对该处理的敏感性。
   4. 在所有条件下，于处理后相同时间点进行活细胞 LysoTracker 和细胞核染色。
7. 在晚期传代或处理过程中持续监测细胞状态，记录其形态和生长模式。通过增殖减缓、细胞体积增大且扁平化、以及胞质颗粒增多等特征识别衰老细胞。一旦观察到明显的生长停滞，应将该培养物作为衰老高水平组直接用于染色和成像，不再继续传代。
8. 在培养维持过程中尽量减少混杂性应激因素，采用一致的培养基配制方法、固定的换液时间表以及恒定的离箱操作时长。应将温度波动、长时间脱离恒定 CO₂ 环境以及培养基预热不一致视为可避免的技术变异来源。
9. 可选：将配对的细胞培养物分别维持在常氧和低氧环境中。将细胞分别作为独立队列维持在 21% O₂ 和 5% O₂ 条件下，在常规培养操作中尽可能保持各队列处于指定的氧浓度环境中。对于低氧队列，在转移和成像准备过程中应尽量减少暴露于常氧环境的时间。
   注意：一个实用的暂停节点是在定义并稳定早期传代和晚期传代队列后，确认晚期传代细胞表现出持续的增殖减缓和衰老相关形态特征。

3. 使用 LysoTracker Deep Red 和细胞核染料对活细胞的溶酶体和细胞核进行染色

1. 将 IMR-90 细胞以所有实验条件接种于透明底成像板或玻璃底培养皿中。需包含一个衰老水平较低的对照条件，以及至少一个通过所选诱导方式建立的高衰老状态条件，并为每种条件设置生物学重复。
2. 接种细胞，使其在染色当天达到亚融合的单层状态。记录每次实验的接种密度以及接种至染色之间的时间，以确保实验间结果具有可比性。
3. 将完全培养基预热至 37 °C。用预热的培养基配制 75 nM 的 LysoTracker Deep Red 工作液，并避光保存。工作液的配制方法为：将 1 mM 的 LysoTracker Deep Red 原液（厂家提供于 DMSO 中）按 1:13,333 的比例稀释于预热的完全培养基中（例如，每 10 mL 预热培养基中加入 0.75 µL 的 1 mM 原液）。
   注意： 高代次或应激诱导的衰老细胞会积累脂褐素及其他非特异性自发荧光物质，这些物质可在宽波长范围内发射荧光，可能导致未染色对照组中出现明显的 LysoTracker 信号¹⁴。为评估特定实验中自发荧光的贡献，每种条件至少设置一个未染色孔，并在相同的成像参数下采集图像。从染色孔的测量值中减去未染色孔的平均信号，或同时报告原始值和背景扣除后的数值。
   注意： 实际操作中，IMR-90 培养体系中未染色孔在 LysoTracker 通道的信号相对于染色后的衰老细胞信号较小（在本数据集中约为染色衰老信号均值的 5% 至 10%），但该背景信号随传代次数增加而上升，在深度衰老或癌基因诱导的衰老培养物中可能变得显著（超过 20%）^6,14。当将本方案应用于新的细胞类型或衰老诱导模型时，务必验证自发荧光的强度。
4. 为本次实验中所有待染色孔准备足量的 LysoTracker 工作液。通过轻柔倒置混匀工作液，并在使用前始终避光保存。
5. 吸除各孔中的旧培养基。沿孔壁缓慢加入 LysoTracker 工作液，避免扰动单层细胞，并确保各孔染色体积一致。
6. 将细胞在 37 °C、5% CO₂ 条件下与 LysoTracker 共孵育 30 分钟。所有实验组应保持相同的孵育时长和温度。
7. 在 LysoTracker 孵育的最后 10 分钟内加入活细胞核染料。将 Hoechst 33342 直接加入含 LysoTracker 的培养基中，终浓度为厂家推荐的工作浓度（例如 1 µg/mL 至 2 µg/mL），并通过轻轻摇动培养板进行混匀。
8. 孵育结束后移除染色液。用预热的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞一次，以降低背景荧光。
9. 清洗后立即加入预热的无酚红培养基或成像缓冲液。随后直接进行活细胞成像，并在实验中保持所有孔从缓冲液更换到图像采集之间的时间一致。
10. 在转移和成像设置过程中，避免成像板暴露于光照下。操作和图像采集期间，尽量减少样本离开恒温及 CO₂ 控制环境的时间。
    注意： 操作荧光染料时应佩戴手套和护目镜。含染料液体及被污染耗材的处理应遵循机构化学安全规程。
    注意： 若成像需分批进行，可在 步骤 3.9 后设置暂停点。暂停期间将培养板避光保存于 37 °C 环境中，并尽快恢复成像，以减少染色信号漂移。
    注意： 若实验设计中氧气浓度为变量，则在染色和孵育过程中应使各组始终处于指定的氧浓度条件下，并记录样本离开指定条件的处理时间。

4. SA-β-Gal 染色验证（可选）

1. 可选用SA-β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色作为验证步骤，以确认高衰老条件下SA-β-Gal活性较衰老低对照组有所增加。验证实验应在与成像孔相同板型和相同操作时间线的平行孔中进行。
2. 在固定前完成验证孔的活细胞成像。若需对同一视野进行固定前后的匹配比较（图2），应在成像时记录显微镜载物台坐标，固定和染色后手动重新定位每个视野，并通过目视检查核位置和细胞形态，确认匹配视野一致后，再将其纳入后续分析。
3. 使用SA-β-Gal染色试剂盒中提供的固定液，按推荐的1x工作浓度（含2%甲醛和0.2%戊二醛）进行细胞固定。室温孵育10至15分钟。作为参考，该固定液成分为含2%（w/v）甲醛和0.2%（w/v）戊二醛的磷酸盐缓冲液。pH 6.0的SA-β-Gal染色液包含：使用前用二甲基甲酰胺溶解的1 mg/mL X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃苷）、40 mM柠檬酸钠/磷酸钠缓冲液（pH 6.0）、5 mM亚铁氰化钾、5 mM铁氰化钾、150 mM NaCl和2 mM MgCl₂^12,13。只要确认染色缓冲液pH为6.0，符合上述规格的商业试剂盒可互换使用。
4. 去除固定液，用磷酸盐缓冲液清洗孔板两次。向每孔加入含X-gal底物、pH为6.0的SA-β-Gal染色液。
5. 密封板以减少孵育过程中的蒸发。将板置于37 °C、无CO₂的培养箱中孵育12–16小时。
6. 通过明场显微镜检查各孔并记录染色模式。为每种条件采集代表性图像，并在验证结果时报告每孔SA-β-Gal阳性细胞的比例。
   注意：甲醛和戊二醛具有毒性和挥发性，应在化学通风橱中配制和使用固定液，并佩戴适当个人防护装备，包括手套、护目镜和实验服。
   备注：若SA-β-Gal染色在衰老低对照组中出现高背景，或在衰老高条件下染色较弱，可在保持缓冲液pH为6.0的前提下，调整接种密度、固定时间、孵育时间及温度一致性后重复验证实验。

结果

将该方案应用于IMR-90成纤维细胞，在低衰老和高衰老条件下可获得定量的溶酶体读数，这些数据可在单细胞水平上进行总结，必要时也可在全视野水平上进行分析。

图中和表中所示的代表性数据来自一次单独的生物学实验，该实验比较了第13代（P13；衰老水平低，约PDL 26）和第23代（P23；衰老水平高，约PDL 46）的IMR-90细胞培养物。每种条件下成像了两个孔，每个孔采集44个视野（共176个视野；每种条件88个视野）。图2D中的每孔相关性是基于每个孔44个视野的平均值计算得出，总计n = 4个数据点（每种条件2个）。表 1 和 补充表 1 各报告了每种条件下的一个代表性20×视野；结合两个表格，覆盖了每种条件下的两个孔（P13为B01和A01；P23为C01和D01），可直接检查孔间一致性。补充图 1 报告了来自全部四个孔的单细胞分布数据，包含4,065个P13细胞和568个P23细...

讨论

本方案描述了一种通过溶酶体重塑来检测细胞衰老的活细胞成像工作流程，可提供单细胞和单孔水平上衰老负荷的定量读数。多个步骤对于获得可靠的检测结果尤为关键。首先，生物模型本身必须得到良好控制。在IMR-90成纤维细胞中诱导复制性衰老时，需精确追踪群体倍增次数，并平行维持早期传代培养物作为非衰老对照^2,3,18。传代历史或汇合度的微小偏差均可能改变衰老细胞的比例，从而影响检测的动态范围。其次，溶酶体和细胞核染色条件必须严格标准化。LysoTracker的浓度、孵育时间与温度，以及细胞核染料的暴露条件，均会影响信号强度和分割质量。最后，成像参数和培养板操作应在不同实验批次间保持一致，以确保荧光差异反映的是生物学变化，而非焦距漂移或采集不一致所致。当这些步骤保持一致时，溶酶体测量结果能够清晰区分低衰老与高衰老状态，其结果与SA-β-Gal等传统衰老标志物一致，后者反映了复制性老化过程中溶酶体数量的增加^10,...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔组织培养板（平底，TC处理）	CellTreat Scientific Products	229124	任何适用于活细胞荧光成像的透明底多孔培养板（例如6、12或24孔TC处理聚苯乙烯板；对于更高分辨率成像，可优先选用玻璃底成像板）。
β-半乳糖苷酶染色试剂盒（衰老检测）	Cell Signaling Technology	9860	任何经验证、在pH 6.0染色缓冲液中可用的商用SA-β-半乳糖苷酶检测试剂盒。作为参考，固定液含有2%甲醛和0.2%戊二醛的PBS溶液，染色液含有1 mg/mL X-gal的DMF溶液、40 mM柠檬酸/磷酸盐缓冲液（pH 6.0）、5 mM亚铁氰化钾、5 mM铁氰化钾、150 mM NaCl和2 mM MgCl2。
BioRender（科学绘图软件）	BioRender	N/A — 网络应用程序	用于创建示意图（图1–3）。https://www.biorender.com
二氧化碳气体（CO2），压缩气瓶	Airgas（或类似供应商）	N/A	医用级CO2，用于维持细胞培养箱和显微镜载物台成像室中5%的气体环境。
胎牛血清（FBS），热灭活	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	10082147	任何细胞培养级FBS，在56 °C热灭活；在完全培养基中以10% v/v浓度使用。
具备活细胞成像功能的荧光显微镜	Thermo Fisher Scientific	AMF7000	任何具备活细胞温度和CO2控制功能的宽场或共聚焦荧光显微镜，配备远红光（激发~647 nm / 发射~670 nm）和DAPI/Hoechst（激发~405 nm / 发射~460 nm）滤光片组，以及20×-40×物镜，数值孔径（NA）足以分辨溶酶体结构。本研究使用了EVOS M7000成像系统。
Hoechst 33342细胞核染料	Thermo Fisher Scientific	H3570	一种可穿透细胞膜的DNA染料，用于活细胞核染色（蓝色荧光，激发~405 nm）。不可与DAPI互换，因DAPI在生理条件下不具备细胞膜通透性。
图像分析软件	Python Software Foundation	N/A	任何支持细胞核分割、由核向外扩展定义细胞区域、强度阈值设定及基础图像统计分析的科学计算环境（例如Python配合scikit-image、MATLAB、ImageJ/Fiji或CellProfiler）。本研究开发了SenTrack分析流程（见补充文件S1）。
IMR-90人肺成纤维细胞（细胞系）	ATCC	CCL-186	用于模拟复制性衰老的正常人胎儿肺二倍体成纤维细胞系；任何特征相似的人成纤维细胞系均可替代使用。
LysoTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	L12492	一种嗜酸性荧光染料，用于活细胞中酸性细胞器的染色；以1 mM DMSO储备液形式提供。工作浓度为75 nM，溶于配制好的细胞培养基中。  其远红光发射（激发647 nm / 发射668 nm）可最大程度减少与脂褐素自发荧光的重叠，但无法完全消除。
最低必需培养基（MEM）	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	11-095-080	IMR-90成纤维细胞的基础培养基；添加10% FBS和1%青霉素-链霉素。任何含Earle's盐和L-谷氨酰胺的标准Eagle最低必需培养基配方均可替代。
青霉素-链霉素溶液（100×）	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	15140122	完全培养基中的抗生素补充剂；以1% v/v浓度使用（终浓度为100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素）。任何标准青霉素-链霉素溶液均可替代。
酚红-free成像培养基	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	A1896701	用于活细胞成像的酚红-free DMEM或HBSS，以降低采集过程中的背景荧光。FluoroBrite DMEM是常用选项之一；任何补充了10% FBS的酚红-free成像缓冲液均可替代。
磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4（1×）	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	10010023	用于细胞洗涤和试剂稀释的等渗缓冲液；任何无菌、pH 7.4的1× PBS均可替代。
SenTrackLite v0.5.0（软件）	开源（Estrada / Melendez实验室）	v0.5.0	用于溶酶体衰老图像分析的开源单文件Python / Tkinter应用程序。作为补充文件S1发布。归档于Zenodo，doi:10.5281/zenodo.19701255。MIT许可证。源代码地址：https://github.com/goldbader-hub/Sentrack
载物台环境培养箱	Thermo Fisher Scientific	AMC2000	用于显微镜载物台活细胞成像的环境控制培养箱，可调控温度（37 °C）和CO2（5%）。本研究使用了EVOS Onstage Incubator；任何功能相当的载物台培养箱均可替代。