利用LysoTracker进行溶酶体示踪分析以定量评估人成纤维细胞的细胞衰老

摘要

本文介绍了一种活细胞LysoTracker实验方案，用于检测IMR-90人成纤维细胞衰老过程中溶酶体的重塑变化。

摘要

细胞衰老是一种稳定的细胞周期阻滞状态，伴随一系列特征性表型，包括细胞形态增大、分泌信号改变以及显著的溶酶体重塑。衰老细胞通常表现出酸性内体-溶酶体区室的扩张，并伴有腔内酸度和降解能力的变化，这为简单地通过活细胞成像检测与衰老相关的细胞器重塑提供了机会。本研究描述了一种活细胞成像方案，利用酸性示踪荧光染料LysoTracker Deep Red，以酸性细胞器区室的pH依赖性信号作为衰老负荷的间接指标。该方法在经历复制性衰老的IMR-90人肺成纤维细胞中进行了验证，通过连续传代进行观察。本方案详细说明了细胞培养与传代追踪、LysoTracker染色、荧光成像，以及基于图像的溶酶体信号强度和每个细胞中信号阳性区域的定量分析。平行培养物中的衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色作为可选的验证性标志物被纳入，而非作为参考标准。代表性结果表明，与早期传代对照组相比，晚期传代细胞中酸性示踪荧光染料信号更强，lyso阳性区域更大，这与衰老过程中酸性细胞器区室的扩张一致。由于检测信号依赖于区室体积、质子梯度及染料可及性，因此应将其解释为溶酶体重塑的间接相关指标，而非溶酶体数量或生物生成的直接测量。该方案易于实施，可适用于其他细胞类型或诱导衰老的应激条件，为传统的终点检测方法提供了一种实用且定量的补充手段。

引言

细胞衰老是一种由多种应激和衰老相关刺激因素激活的持久性细胞周期阻滞程序^1,2,3,4。由于没有单一标志物具有完全特异性，衰老细胞通常通过一组标志物的组合来鉴定。其典型特征包括细胞形态增大、扁平化，衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性增强，DNA损伤灶的形成，以及促炎性分泌表型（SASP）^2,4,5。在这些特征中，溶酶体重塑已被认为是衰老过程中一个显著且具有重要功能意义的特征^6,7。衰老细胞表现出显著的溶酶体改变，包括溶酶体大小和数量的显著增加，以及功能的改变（通常涉及溶酶体pH的部分中和及未降解物质的积累）^6,7,8,9

方案

IMR-90 细胞是一种公认的人成纤维细胞系，不涉及人类受试者研究，因此无需伦理审批或知情同意。所有操作均按照纽约州立大学奥尔巴尼分校的生物安全指南进行，适用于生物安全二级（BSL-2）条件下的人源细胞系实验。

1. 一般准备和工作流程概述

1. 将实验目标定义为利用LysoTracker Deep Red染色和活细胞核染料对IMR-90细胞进行活细胞溶酶体谱型分析，以量化溶酶体重塑，作为细胞衰老负荷的连续性读数。将主要生物学比较定义为以下设计之一：
   1. 衰老诱导与匹配的非诱导对照
   2. 高衰老与低衰老条件在剂量或时间序列中的比较
   3. 衰老细胞富集条件下经衰老细胞清除剂处理 与溶剂处理的衰老高水平对照
   4. 包括低衰老基线组和高衰老组的抗衰老治疗系列。
2. 为所有实验建立最低限度的对照结构。
   1. 包括一个与铺板密度、染色时间和成像设置相匹配的衰老水平低的对照组。
   2. 包括由明确的衰老诱导因素或晚期传代复制性衰老所生成的高衰老水平组。
   3. 每种条件下均应设置生物学重复，并在各条件下以相同的时序进行染色和成像。
3. 将检测读数定义为基于图像的溶酶体重塑直接测量指标：
   1. 使用一致的....

结果

将该方案应用于IMR-90成纤维细胞，在低衰老和高衰老条件下可获得定量的溶酶体读数，这些数据可在单细胞水平上进行总结，必要时也可在全视野水平上进行分析。

图中和表中所示的代表性数据来自一次单独的生物学实验，该实验比较了第13代（P13；衰老水平低，约PDL 26）和第23代（P23；衰老水平高，约PDL 46）的IMR-90细胞培养物。每种条件下成像了两个孔，每个孔采集44个视野（共176个视野；每种条件88个视野）。图2D中的每孔相关性是基于每个孔44个视野的平均值计算得出，总计n = 4个数据点（每种条件2个）。表 1 和 补充表 1 各报告了每种条件下的一个代表性20×视野；结合两个表格，覆盖了每种条件下的两个孔（P13为B01和A01；P23为C01和D01），可直接检查孔间一致性。补充图 1 报告了来自全部四个孔的单细胞分布数据，包含4,065个P13细胞和568个P23细.......

讨论

本方案描述了一种通过溶酶体重塑来检测细胞衰老的活细胞成像工作流程，可提供单细胞和单孔水平上衰老负荷的定量读数。多个步骤对于获得可靠的检测结果尤为关键。首先，生物模型本身必须得到良好控制。在IMR-90成纤维细胞中诱导复制性衰老时，需精确追踪群体倍增次数，并平行维持早期传代培养物作为非衰老对照^2,3,18。传代历史或汇合度的微小偏差均可能改变衰老细胞的比例，从而影响检测的动态范围。其次，溶酶体和细胞核染色条件必须严格标准化。LysoTracker的浓度、孵育时间与温度，以及细胞核染料的暴露条件，均会影响信号强度和分割质量。最后，成像参数和培养板操作应在不同实验批次间保持一致，以确保荧光差异反映的是生物学变化，而非焦距漂移或采集不一致所致。当这些步骤保持一致时，溶酶体测量结果能够清晰区分低衰老与高衰老状态，其结果与SA-β-Gal等传统衰老标志物一致，后者反映了复制性老化过程中溶酶体数量的增加^10,.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔组织培养板（平底，TC处理）	CellTreat Scientific Products	229124	任何适用于活细胞荧光成像的透明底多孔培养板（例如6、12或24孔TC处理聚苯乙烯板；对于更高分辨率成像，可优先选用玻璃底成像板）。
β-半乳糖苷酶染色试剂盒（衰老检测）	Cell Signaling Technology	9860	任何经验证、在pH 6.0染色缓冲液中可用的商用SA-β-半乳糖苷酶检测试剂盒。作为参考，固定液含有2%甲醛和0.2%戊二醛的PBS溶液，染色液含有1 mg/mL X-gal的DMF溶液、40 mM柠檬酸/磷酸盐缓冲液（pH 6.0）、5 mM亚铁氰化钾、5 mM铁氰化钾、150 mM NaCl和2 mM MgCl2。
BioRender（科学绘图软件）	BioRender	N/A — 网络应用程序	用于创建示意图（图1–3）。https://www.biorender.com
二氧化碳气体（CO2），压缩气瓶	Airgas（或类似供应商）	N/A	医用级CO2，用于维持细胞培养箱和显微镜载物台成像室中5%的气体环境。
胎牛血清（FBS），热灭活	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	10082147	任何细胞培养级FBS，在56 °C热灭活；在完全培养基中以10% v/v浓度使用。
具备活细胞成像功能的荧光显微镜	Thermo Fisher Scientific	AMF7000	任何具备活细胞温度和CO2控制功能的宽场或共聚焦荧光显微镜，配备远红光（激发~647 nm / 发射~670 nm）和DAPI/Hoechst（激发~405 nm / 发射~460 nm）滤光片组，以及20×-40×物镜，数值孔径（NA）足以分辨溶酶体结构。本研究使用了EVOS M7000成像系统。
Hoechst 33342细胞核染料	Thermo Fisher Scientific	H3570	一种可穿透细胞膜的DNA染料，用于活细胞核染色（蓝色荧光，激发~405 nm）。不可与DAPI互换，因DAPI在生理条件下不具备细胞膜通透性。
图像分析软件	Python Software Foundation	N/A	任何支持细胞核分割、由核向外扩展定义细胞区域、强度阈值设定及基础图像统计分析的科学计算环境（例如Python配合scikit-image、MATLAB、ImageJ/Fiji或CellProfiler）。本研究开发了SenTrack分析流程（见补充文件S1）。
IMR-90人肺成纤维细胞（细胞系）	ATCC	CCL-186	用于模拟复制性衰老的正常人胎儿肺二倍体成纤维细胞系；任何特征相似的人成纤维细胞系均可替代使用。
LysoTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	L12492	一种嗜酸性荧光染料，用于活细胞中酸性细胞器的染色；以1 mM DMSO储备液形式提供。工作浓度为75 nM，溶于配制好的细胞培养基中。  其远红光发射（激发647 nm / 发射668 nm）可最大程度减少与脂褐素自发荧光的重叠，但无法完全消除。
最低必需培养基（MEM）	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	11-095-080	IMR-90成纤维细胞的基础培养基；添加10% FBS和1%青霉素-链霉素。任何含Earle's盐和L-谷氨酰胺的标准Eagle最低必需培养基配方均可替代。
青霉素-链霉素溶液（100×）	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	15140122	完全培养基中的抗生素补充剂；以1% v/v浓度使用（终浓度为100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素）。任何标准青霉素-链霉素溶液均可替代。
酚红-free成像培养基	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	A1896701	用于活细胞成像的酚红-free DMEM或HBSS，以降低采集过程中的背景荧光。FluoroBrite DMEM是常用选项之一；任何补充了10% FBS的酚红-free成像缓冲液均可替代。
磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4（1×）	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	10010023	用于细胞洗涤和试剂稀释的等渗缓冲液；任何无菌、pH 7.4的1× PBS均可替代。
SenTrackLite v0.5.0（软件）	开源（Estrada / Melendez实验室）	v0.5.0	用于溶酶体衰老图像分析的开源单文件Python / Tkinter应用程序。作为补充文件S1发布。归档于Zenodo，doi:10.5281/zenodo.19701255。MIT许可证。源代码地址：https://github.com/goldbader-hub/Sentrack
载物台环境培养箱	Thermo Fisher Scientific	AMC2000	用于显微镜载物台活细胞成像的环境控制培养箱，可调控温度（37 °C）和CO2（5%）。本研究使用了EVOS Onstage Incubator；任何功能相当的载物台培养箱均可替代。