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建立用于健康与慢性阻塞性肺疾病条件下研究的肺芯片上皮-内皮共培养模型

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DOI：

10.3791/70687

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2026年6月30日

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1Laboratory of Respiratory Diseases and Thoracic Surgery (BREATHE), Department of Chronic Diseases and Metabolism (CHROMETA), KU Leuven, 2Laboratory for Molecular Virology and Gene Therapy, KU Leuven, 3Clinical Department of Respiratory Diseases, University Hospital Leuven

本文内容

摘要

本方案建立了一种动态的肺芯片共培养系统，该系统结合了人原代气道上皮细胞和肺微血管内皮细胞，用于健康模型和慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型。该系统可在气液界面和流动条件下模拟气道-血管相互作用，并提供屏障功能评估、细胞表型分析和RNA分析。

摘要

开发了两种动态的肺芯片共培养模型，通过整合原代气道上皮细胞和肺微血管内皮细胞，重建气道-血管界面。一种模型使用来自健康供体的商业化细胞，另一种则采用慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者来源的细胞，从而能够在相同培养条件下直接比较健康与疾病状态。两种模型均支持在持续灌注和气液界面（ALI）条件下上皮细胞的分化，形成由下方内皮层支撑的生理相关上皮屏障。实验流程包括细胞外基质包被、细胞接种、ALI建立、屏障功能评估、细胞表型鉴定以及细胞类型特异性RNA提取。通透性实验显示两种系统均具有良好的屏障完整性，免疫荧光证实了闭合小环蛋白-1（Zonula Occludens-1, ZO-1）和血管内皮钙黏蛋白（vascular endothelial cadherin, VE-cadherin）在细胞连接处的连续定位。通过β-微管蛋白IV染色及纤毛摆动观察验证了上皮细胞的分化。从各个腔室分别获得了高质量RNA，支持细胞类型特异性的分子分析。COPD模型重现了该疾病的关键特征，特别是黏液分泌增加，同时未影响屏障功能或细胞活力。使用患者来源的上皮和内皮细胞可保留个体病理特征，有助于研究COPD中的细胞间作用机制。该方法为静态体外in vitro 模型和动物模型提供了生理相关性更高的替代方案，适用于吸入药物、病原体暴露以及上皮-内皮相互作用的临床前研究。重要的是，健康和COPD肺芯片模型既可联合使用以进行直接比较研究，也可独立用于机制探究、治疗测试和药物发现。该系统还可适配于其他涉及上皮或内皮腔室改变的呼吸系统疾病，为呼吸系统研究提供了一个多功能且具有转化潜力的研究平台。

引言

气道上皮细胞与肺微血管内皮细胞之间的相互作用对于维持肺部稳态以及协调对损伤、感染和炎症的反应至关重要。这些细胞类型共同形成一种功能性屏障，调控气体交换、免疫监视和血管通透性。它们之间的动态交互作用包括旁分泌信号传导、直接的细胞间相互作用以及对机械刺激的响应，这些过程对肺功能和结构完整性均具有关键意义1。

在慢性阻塞性肺疾病（COPD）中，该病是一种以慢性炎症、气道重塑以及肺泡-毛细血管界面破坏为特征的进行性肺部疾病，气道上皮和肺血管内皮的屏障功能均受到损害，并伴有异常的细胞因子释放及失调的组织修复机制。2,3然而，气道上皮细胞与肺微血管内皮细胞之间的相互作用仍知之甚少。这一局限性部分源于现有模型的不足 体外 和 体内 模型。尽管动物模型为呼吸生理学和病理学提供了重要的认识，但由于物种间在免疫功能、肺部结构、细胞信号传导和药物代谢方面存在差异，其在向人类生物学转化时的应用受到限制。

传统的体外 模型，例如永生化气道上皮细胞系的二维（2D）培养，无法重现气道上皮的关键特征，包括正常的分化状态和生物力学响应能力。尽管原代气道上皮细胞的三维（3D）气液界面（ALI）单细胞培养在生理相关性方面有所改善，但这些模型仍处于静态，缺乏与其他细胞类型的相互作用以及机械刺激4。肺是一个动态器官，持续暴露于气流、剪切应力、细胞外基质刚度以及呼吸所产生的周期性牵张。这些因素显著影响细胞行为和组织重塑过程5。因此，静态模型不足以模拟白细胞黏附、免疫细胞迁移以及对药物暴露的实时反应等生理过程。

为克服这些局限，器官芯片平台作为一种先进的系统应运而生，可用于模拟复杂的细胞相互作用。肺芯片模型结合微流控技术与人源细胞，重现肺微环境中关键的结构与力学特征。这些平台能够在动态的三维环境中共培养气道上皮细胞和肺血管内皮细胞，更接近体内in vivo 条件6。通过引入生理性的呼吸运动、流体流动以及实时监测，可进一步加强在正常与疾病状态下对上皮–内皮细胞间通讯的研究7–9。

尽管取得了这些进展，大多数现有的器官芯片肺模型仍依赖于来自健康供体的细胞10，这限制了其模拟疾病特异性相互作用的能力。此外，许多平台缺乏整合患者来源细胞或重建复杂慢性阻塞性肺疾病（COPD）微环境的灵活性。 Furthermore，关于使用细胞类型特异性的细胞外基质（ECM）包被，共培养原代气道上皮细胞和肺微血管内皮细胞的详细方案——无论细胞来源于商业渠道还是COPD患者——仍然十分有限。

本研究采用一种 commercially available 的双通道微流控肺芯片平台，建立了两种共培养模型，包含原代气道上皮细胞和肺微血管内皮细胞。健康模型使用来自不同供体的 commercially available 细胞构建，而慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型则采用来自同一患者的气道上皮细胞和内皮细胞建立。两种模型均使用细胞类型特异性的 ECM 涂层，以更好地模拟 in vivo 肺微环境。该系统可用于在生理和病理条件下研究上皮-内皮相互作用。健康模型与 COPD 模型既可联合使用以进行直接比较研究，也可独立用于机制探究和治疗测试。

该共培养系统反映了气道上皮和肺血管系统的解剖结构，二者作为一个整合的上皮-内皮功能单位共同发挥作用。气道上皮为假复层结构，由基底细胞、分泌细胞和纤毛细胞组成，位于富含血管的结缔组织层（固有层）上方，并通过基底膜与内皮层相分隔。在此模型中，细胞外基质涂层（I型胶原、纤连蛋白和层粘连蛋白）近似于上皮和内皮基底膜的组成成分。分隔两个通道的多孔膜模拟了上皮下结缔组织，尽管其缺乏血管系统的复杂性。上皮与内皮之间的通讯涉及多种机制，包括旁分泌信号传导、通透性的协同调控、免疫细胞募集，以及对呼吸引起的牵张等机械刺激的响应，这些因素均可影响血管阻力和机械转导通路。

本方法学研究概述了在气液界面（ALI）条件下培养具有底层肺微血管内皮层的完全分化气道上皮所需的操作步骤。该系统可对屏障完整性进行定性与功能评估，并获得可重复的表观通透性（Papp）值，≤ 1 × 10⁻6 cm/s。此外，本文还提供了各腔室细胞表型鉴定、RNA提取与定量的实验方案， consistently 获得高质量RNA（RNA完整性编号 > 7）。本方法不适用于定量mRNA分析或黏液分泌的详细评估，亦未研究机械牵张的影响，尽管该系统具备开展此类应用的可行性。

方案

所有原代人源细胞的使用均经鲁汶大学医院当地伦理委员会研究批准（S51577/S57114/S70453）。商品化的原代人支气管上皮细胞（HBEC）和肺微血管内皮细胞（HPMEC）来自两名非吸烟供体（补充表 1、2）。慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型所用原代细胞根据既定方案（伦理批准号 S51577）从三名有吸烟史的 COPD 患者肺组织移植样本中分离获得，并储存于 BREATHE 生物样本库中（补充表 3）。同一 COPD 患者同时提供了 HBEC 和 HPMEC 细胞。

为建立健康的肺芯片模型，使用了商业化的人支气管上皮细胞（HBEC）和人肺微血管内皮细胞（HPMEC）。对于慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型，则从肺移植术后同一患者的肺组织移植物中分离获得原代支气管上皮细胞和肺微血管内皮细胞。本研究中使用的肺芯片系统是一种微流控双通道平台，包含平行的气道（上方）和血管（下方）微通道，两者之间由一层带孔、涂有细胞外基质的膜隔开（图1）。健康模型和COPD模型均采用相同的构建方案。实验方案中所用的化学品、试剂和试剂盒列于材料表中。

1. 在层流条件下建立肺芯片共培养模型

  1. 芯片准备
    1. 将芯片支架放入120 mm方形细胞培养皿中，确保其角朝上以保持正确方向，然后将芯片放入支架中。在进行活化步骤前，确保所有芯片均已正确放置（图2）。
    2. 将制造商提供的活化试剂粉末溶解于其对应的缓冲液中，配制活化溶液，最终浓度为0.5 mg/mL。
    3. 通过底部通道入口小心加入约35 µL活化溶液，以活化芯片通道的内表面，促进细胞外基质（ECM）的附着。用移液器加样直至溶液开始从底部通道出口流出。再通过顶部通道入口加入约50 µL溶液，重复该操作。
      注意：活化试剂粉末对光敏感。请在使用前立即配制溶液，并在复溶后1小时内丢弃任何剩余溶液。
    4. 轻轻抽吸去除芯片表面多余的活化溶液。注意仅去除芯片表面的溶液，切勿从通道内抽吸溶液。
      注意：在进行紫外（UV）活化前，应在显微镜下检查通道内是否存在气泡。如发现气泡，应使用活化溶液轻轻冲洗，直至完全去除。
    5. 将芯片暴露于紫外灯下照射10分钟，然后用200 µL对应缓冲液对每个通道清洗两次。
    6. 按照上述方法，向两个通道中加入新鲜活化溶液，并将芯片再暴露于紫外灯下5分钟。
    7. 完全抽吸两个通道中的溶液，每个通道用200 µL对应缓冲液清洗两次，再用200 µL无Ca2⁺和Mg2⁺的无菌冷磷酸盐缓冲液（DPBS -/-）清洗一次。
    8. 在DPBS（-/-）中配制含人I型胶原蛋白（100 µg/mL）、人纤连蛋白（50 µg/mL）和人层粘连蛋白（50 µg/mL）的ECM包被溶液。每片芯片以100 µL作为参考体积。
    9. 同时向顶部通道加入50 µL，向底部通道加入35 µL，并通过出口端口同步抽吸流出液。
      注意：在显微镜下检查通道内是否有气泡。如有，应使用ECM溶液轻轻冲洗以去除。
    10. 在两个通道的入口和出口端口保留少量ECM溶液液滴，以防止过夜（ON）孵育期间蒸发。
    11. 将芯片在37 °C、5% CO₂条件下过夜孵育。次日，抽吸ECM溶液，并用200 µL预热至37 °C的DPBS（-/-）清洗两个通道。
  2. 细胞接种与浸没式培养
    在涂有150 µg/mL人IV型胶原蛋白（溶于DPBS（-/-））的T25 cm2培养瓶中，使用气道上皮细胞扩增培养基培养HBEC，直至细胞融合度达到60%–70%。
    同时，在涂有明胶（2 mg/mL溶于DPBS（-/-））的T75 cm2培养瓶中，使用内皮细胞（EC）生长培养基培养HPMEC，直至细胞融合度达到90%–100%。
    关键试剂和培养基的组成请参见补充表4。
  3. HPMEC接种
    1. 抽吸培养基，用10 mL DPBS（-/-）清洗细胞。
    2. 加入3 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA（1X），室温（RT）孵育30秒。
    3. 加入12 mL EC生长培养基（胰酶体积的4倍）以终止胰酶反应。再加入5 mL EC生长培养基收集残留细胞（最终体积 = 20 mL）。
    4. 在显微镜下确认细胞完全脱落。
    5. 取约20 µL使用台盼蓝计数活细胞。
    6. 将剩余细胞悬液在50 mL锥形管中，室温下以900 × g离心5分钟。
    7. 将沉淀重悬于EC生长培养基中，调整细胞密度至7 × 106 cells/mL。
    8. 将第5代HPMEC接种至底部通道（约20 µL；每通道1.4 × 105 cells）。
    9. 立即翻转芯片，在37 °C、5% CO₂条件下孵育2小时（图3）。
    10. 将芯片恢复至原始方向。
    11. 用200 µL温热（37°C）的EC生长培养基清洗。
    12. 在显微镜下验证细胞贴壁情况，必要时延长孵育时间。
  4. HBEC接种
    1. 抽吸培养基，用5 mL温热DPBS（-/-）清洗。
    2. 加入1 mL胰蛋白酶，在37 °C、5% CO₂条件下孵育5分钟。
    3. 在显微镜下观察细胞脱落情况。
    4. 按1:1比例加入1 mL定义型胰蛋白酶抑制剂（DTI）以终止胰酶反应。
    5. 加入8 mL气道上皮细胞扩增培养基（最终体积 = 10 mL）。
    6. 转移至50 mL离心管中。
    7. 取约20 µL使用台盼蓝进行细胞计数。
    8. 将剩余细胞悬液在室温下以200 × g离心5分钟。
    9. 弃去上清液。
    10. 将沉淀重悬于气道上皮细胞扩增培养基中，调整细胞密度至3.5 × 106 cells/mL。
    11. 在气道上皮细胞扩增培养基中添加50 nM合成光稳定型维甲酸和10 ng/mL重组人表皮生长因子（rhEGF）。
    12. 将第2代HBEC接种至顶部通道（约35 µL；每通道1.2 × 105 cells）。
    13. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育4小时（图4）。
    14. 更换两个通道中的培养基。
    15. 在37 °C、5% CO₂条件下静置过夜（ON）孵育。
      注意：从本步骤开始，所有操作均须使用脱气培养基。脱气必须使用连接真空系统的Steriflip装置进行，以最大限度减少芯片内气泡形成的风险。
  5. 连接至流体系统
    1. 向顶部入口储液池中加入含合成光稳定型维甲酸和rhEGF的温热（37°C）气道上皮扩增培养基。
    2. 向底部入口储液池中加入温热（37°C）EC生长培养基。
    3. 向每个入口储液池加入3 mL培养基，每个出口储液池加入300 µL。
    4. 将便携式模块放入培养模块中（图5）。
    5. 旋转旋钮，选择“Prime”循环。
    6. 按下旋钮以启动该循环。
    7. 运行该循环（约1分钟）。
    8. 检查每个模块底部四个流体端口是否有液滴形成。
    9. 若未见液滴，重复“Prime”循环。
    10. 用相应培养基对两个芯片通道各清洗一次。
    11. 在每个入口和出口端口保留一滴液体，以防止气泡形成。
    12. 用惯用手握住芯片，另一只手握住便携式模块。
    13. 将芯片滑入导轨，直至完全就位。
    14. 将组装好的单元放入培养模块中。
    15. 使用旋钮将两个通道的流速设置为30 µL/h。
    16. 维持液-液界面（LLI）条件。
    17. 将芯片保留在模块中并维持液-液界面（LLI），以促进均匀的上皮层和内皮层形成。
    18. 每3天更换一次培养基。从出口储液池中抽吸旧培养基，向每个入口储液池加入3 mL新鲜培养基。
      注意：在显微镜下监测气泡。如发现气泡，应断开芯片，用培养基冲洗通道后重新连接。
  6. 上皮细胞分化与气液界面培养
    1. 每日在显微镜下观察细胞状态。
    2. 确认形成无间隙的均一上皮细胞层（通常需3–5天）。
    3. 建立气-液界面（ALI）。
    4. 抽吸顶部入口和出口储液池中的培养基。
    5. 通过旋钮将流速提高至600 µL/h，冲洗顶部通道中残留的培养基。
    6. 快速抽吸顶部出口储液池中的培养基。
    7. 抽吸底部入口储液池中的培养基。
    8. 加入3 mL含10 ng/mL血管内皮生长因子（VEGF）和1 µg/mL维生素C的上皮细胞分化培养基。
    9. 使用旋钮将顶部通道设置为“空气”模式。
    10. 将底部通道流速设置为30 µL/h。
    11. 维持气液界面（ALI）培养2周。
    12. 在显微镜下观察上皮细胞分化的进展。
    13. 确认形成假复层上皮，监测纤毛摆动和黏液分泌情况。
    14. 在入口和出口区域观察内皮细胞形态。

显示支气管细胞和微血管细胞、多孔膜、流体通道的器官芯片示意图
图1：微流控肺芯片平台。双通道微流控肺芯片装置的横截面图（左）和俯视图（右）。示意图仅用于说明目的。请点击此处查看此图的放大版本。

显示载玻片在培养皿中正确与错误放置位置的实验室托盘，配有图标标注。
图2：芯片在芯片托架中的位置。代表性图像，显示芯片托架的正确朝向及芯片的正确放置方式。请点击此处查看此图的放大版本。

微流控芯片细胞分布；显微镜图像；0小时与2小时接种过程比较；实验。
图3：微流控芯片中内皮细胞的接种。肺微血管内皮细胞在接种后立即拍摄的代表性明场图像（A）以及接种后2小时培养的图像（B）。比例尺：100 µm。请点击此处查看此图的放大版本。

微流控芯片实验示意图；0小时和4小时的细胞接种对比；显微分析。
图4：微流控芯片中气道上皮细胞的接种。
气道上皮细胞接种后立即拍摄的代表性明场图像（A）以及接种后4小时培养的图像（B）。比例尺：100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

用于细胞生物学研究的便携式实验室系统示意图，包含培养模块、培养箱和芯片装置。
图 5：微流控肺芯片系统的配置。
图的上部显示了带有四个储液池（两个入口和两个出口）的便携式模块，用于培养基供给和废液收集。微流控装置连接至一个调节流速的培养模块，以及一个提供气体、空气和电源的集线模块。该示意图仅用于说明目的。请点击此处查看此图的放大版本。

2. 屏障完整性的评估

屏障完整性通过两种方式评估：首先，通过测定荧光标记的葡聚糖随时间的通透性（在气液界面形成前及形成后10天）进行功能性评估；其次，通过免疫检测支气管上皮中的闭锁小环蛋白-1（ZO-1）和肺血管内皮中的血管内皮-钙黏蛋白（VE-cadherin）进行定性评估。

  1. 屏障功能
    1. 在层流条件下，向气道通道的顶部入口储液池中加入 1 mL 含 VEGF 和维生素 C 的上皮细胞分化培养基，并加入 100 µg/mL 荧光标记的葡聚糖；同时，向血管通道的底部入口储液池中加入 1 mL 不含示踪剂的培养基。
    2. 将含示踪剂的培养基引入顶部通道。使用旋钮将两个通道的流速均设置为 600 µL/h，持续 3 分钟，随后从顶部和底部出口储液池中吸出培养基。
    3. 将连接便携模块的芯片重新放回培养模块中。使用旋钮将两个通道的流速均设置为 45 µL/h，并维持该流速 3 小时。
    4. 从顶部和底部出口储液池中各收集 100 µL 培养基，使用酶标仪测量荧光强度。
    5. 使用通透性公式计算表观通透系数（Papp）：
      用于扩散分析的通透性公式，包含浓度和流速等变量。
      其中 SA 表示共培养通道的表面积（0.17 cm2），QR 和 QD 分别表示接收通道和给药通道的流速（cm3/s），CR,0 与 CD,0 分别对应接收通道和给药通道中回收的浓度。
      注意：当 Papp 值低于 1 × 10-6 cm/s 时，表明屏障完整性良好，反映上皮层对示踪剂的通透性较低。该阈值由系统制造商设定，作为内部质量控制指标。
  2. 紧密连接与黏附连接的免疫检测
    1. 在气液界面培养 2 周后，小心地将芯片从便携模块中取出。
    2. 向两个通道中各加入 50 µL 4% 多聚甲醛（PFA），室温固定 20 分钟。
      注意：PFA 具有毒性，所有操作均应在经认证的化学通风橱中进行。
    3. 用 200 µL DPBS (-/-) 对两个通道各清洗两次，并将芯片在 4 °C 下保存至染色前。
    4. 向每个通道中加入含 0.1% Triton X-100 的 DPBS (-/-) 50 µL，室温孵育 5 分钟以进行细胞通透处理；随后在含 10% 山羊血清的 0.1% Triton X-100 DPBS (-/-) 溶液中，每通道加入 50 µL，室温封闭 1 小时。
    5. 向顶部（支气管上皮）通道加入 50 µL 小鼠单克隆抗人 ZO-1 一抗（1:100），向底部（肺血管内皮）通道加入 50 µL 兔单克隆抗人 VE-钙黏蛋白一抗（1:600）。
    6. 将两种抗体均用抗体稀释液（含 1% 山羊血清的 PBS (-/-) 加 0.1% Triton X-100）稀释，在 4°C 静置条件下过夜孵育。
    7. 用 200 µL DPBS (-/-) 清洗芯片三次，然后每通道加入 50 µL 对应的荧光标记二抗（按 1:500 稀释于抗体稀释液中），室温孵育 1 小时：顶部通道使用山羊抗小鼠二抗，底部通道使用山羊抗兔二抗。
    8. 用 200 µL DPBS (-/-) 对两个通道各清洗三次。每通道加入 50 µL DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚，1 µg/mL 溶于 DPBS (-/-)）进行核染色，室温孵育 10 分钟。
    9. 最后用 200 µL DPBS (-/-) 洗涤一次，将芯片置于 DPBS (-/-) 中，4°C 避光保存，直至成像。
    10. 将芯片置于盖玻片（20×60 mm，厚度 0.16–0.19 mm）上，使用配备转盘共聚焦模块、高灵敏度相机和 20X 物镜（NA 0.8）的倒置荧光显微镜进行成像。采用适当的图像采集与分析软件进行后期处理。

3. 表型分析

  1. 芯片切片的制备
    1. 按照第2.2.2节所述方法，使用4%多聚甲醛（PFA）固定芯片。
    2. 使用剃刀片切除芯片周围的聚二甲基硅氧烷（PDMS）。
    3. 向两个通道中各加入50 µL含2%低熔点琼脂糖的DPBS (-/-) 溶液，并在室温下使其凝固。
    4. 用剃刀片将芯片横向切成两半，将每半部分包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，并在−80 °C保存直至切片。
  2. 冷冻切片
    1. 准备冷冻切片机，从芯片的两半上切下厚度为200 µm的冷冻切片。
    2. 用镊子将芯片切片收集至盛有DPBS (-/-) 的48孔板的孔中，并在4 °C保存直至进行免疫荧光染色。
  3. 免疫荧光染色
    注意：所有步骤均在48孔板中进行，每步使用400 µL作为参考体积。
    1. 按照此前第2.2.4节所述方法对细胞进行通透处理并封闭非特异性结合位点。
    2. 将每张切片与针对上皮纤毛细胞（β-tubulin IV，1:2000）或内皮细胞（CD31，1:25）的一抗抗体在抗体稀释液（含1%山羊血清和0.1% Triton X-100的DPBS）中4°C孵育过夜。
    3. 用DPBS (-/-) 洗涤切片三次。
    4. 在避光条件下，室温下用合适的荧光标记山羊抗小鼠二抗（1:500稀释于抗体稀释液中）孵育切片1小时，用于检测β-tubulin IV和CD31。
    5. 用DPBS (-/-) 洗涤切片三次，然后在室温下用DAPI（1 µg/mL溶于DPBS (-/-)）染核10分钟。
    6. 封片前用DPBS (-/-) 洗涤切片一次。
    7. 使用镊子，在每张载玻片上放置一个间隔垫片，然后将一张切片置于中央；加入1–2滴封片剂，再盖上圆形盖玻片。
    8. 在室温避光条件下过夜干燥，然后用透明指甲油密封盖玻片边缘。
    9. 将载玻片在4°C避光保存，直至成像。
    10. 使用配备旋转盘模块、高灵敏度相机和40X物镜（NA 1.25）的倒置荧光显微镜对芯片切片进行成像，并使用适当的显微图像软件处理图像。

4. RNA 提取与定量

  1. 在层流条件下从芯片中收集细胞
    1. 气液界面（ALI）培养 2 周后，将芯片从便携式模块上断开，并用 200 µL 预热至 37 °C 的 DPBS (-/-) 溶液对两个通道各清洗两次。
    2. 向底部通道的内皮细胞中加入 35 µL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA (1X)，在室温下孵育约 30 秒。
    3. 在显微镜下观察细胞，确认细胞完全脱落。随后将细胞悬液收集至离心管中，在室温下以 900 × g 离心 5 分钟。
    4. 将细胞沉淀重悬于 50 µL 基于酚的 RNA 提取试剂中，于 -80 °C 保存，直至进行 RNA 提取。
    5. 向顶部通道直接加入 50 µL 基于酚的 RNA 提取试剂以裂解上皮细胞，用枪头密封端口，并在冰上孵育 3–4 分钟。
    6. 轻柔吹打以确保完全裂解，将裂解液收集至离心管中，于 -80 °C 保存，直至进行 RNA 提取。
    7. 在显微镜下检查两个通道，确认细胞已完全收集。
  2. RNA 提取
    1. 加入氯仿（每 1 体积裂解用酚基 RNA 提取试剂加入 0.2 体积，即每样本 10 µL），充分振荡混匀各管，并在冰上孵育 2–3 分钟。
    2. 在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 15 分钟以分离相层，小心将上层水相转移至新离心管中，避免扰动中间相。然后向水相中加入 5 µg 无 RNA 酶的糖原作为载体。
    3. 加入异丙醇（每 1 体积裂解试剂加入 0.5 体积，即每样本 25 µL），在 4 °C 下孵育 10 分钟，随后在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟。
    4. 弃去上清液，保留 RNA 沉淀。
  3. RNA 的洗涤与重悬
    1. 用 75% 乙醇（每 1 体积裂解试剂加入 1 体积，即每样本 50 µL）洗涤 RNA 沉淀，短暂涡旋振荡，并在 4 °C 下以 7,500 × g 离心 5 分钟。
    2. 弃去上清液，让沉淀在空气中干燥 5–10 分钟。
    3. 通过轻柔吹打将 RNA 重悬于 30 µL 无 RNA 酶的水中，并于 -80 °C 保存以备后续使用。
    4. 使用基于微流控芯片的核酸分离系统评估 RNA 的完整性及浓度。

结果

建立肺芯片共培养模型

明场成像显示了肺芯片共培养系统中细胞随时间的黏附与生长情况。支气管上皮细胞在液-液界面（LLI）的浸没培养条件下增殖，沿上层通道形成均匀的细胞层（图6A），而肺血管内皮细胞则扩展并覆盖整个下层通道，形成融合的单层细胞（图6B）。

共培养建立后，对底部通道的入口和出口区域的内皮细胞进行监测，这些区域是显微镜检查唯一可观察到的部位。如图7所示，内皮细胞保持活性，并呈现沿流动方向排列的伸长形态。在气液界面（ALI）培养14天后，健康模型和慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型的上皮层均显示出明显的纤毛搏动（补充视频）。与健康模型相比，COPD模型的黏液分泌显著增加，这与预期一致（图8），重现了COPD病理的关键特征。

器官芯片设计；带有细胞培养图像 A、B 的微流控装置；显微分析。
图 6：微流控装置中气道上皮细胞与内皮细胞的共培养。
在多孔膜上表面的原代支气管上皮细胞（A）和下表面的原代肺微血管内皮细胞（B）在液-液界面（LLI）条件下的代表性图像。比例尺：100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示流动方向和细胞通道的微流控装置示意图；详细展示流动的显微镜图像。
图 7：气液界面期间底部微流控通道中的内皮细胞。
代表性明场图像，显示气液界面（ALI）期间底部通道入口（上）和出口（下）处的肺微血管内皮细胞。比例尺：100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

微通道中的微观流动观察，显示流体方向，用于流体动力学研究的示意图。
图8：气道通道中的黏液积聚。
代表性图像显示健康（A）和慢性阻塞性肺疾病（COPD）（B）共培养模型在气液界面（ALI）培养14天后的黏液生成情况。气道腔室中的棕色层代表积聚的黏液。比例尺：100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

屏障完整性的定量评估

屏障完整性的功能评估显示，与阳性对照（包被ECM但无细胞的芯片）相比，健康模型和慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型的表观通透性（Papp）均较低（图9）。

在无细胞条件下，较高的Papp值表明屏障形成极少。相反，在存在上皮和内皮层的情况下，荧光标记的葡聚糖示踪剂无法穿过细胞外基质（ECM），导致通透性显著降低，表明形成了较强的屏障。该效应在气液界面（ALI）形成之前以及ALI培养10天后均能观察到，说明屏障功能在细胞分化早期即已建立。

如图10所示，在健康模型中，ALI培养前的平均Papp值已低于提示屏障完整性良好的阈值（1 × 10⁻6 cm/s），并在ALI培养期间进一步下降。在COPD模型中，ALI培养前的平均Papp值也处于强屏障范围内，尽管在ALI培养10天后略有升高，屏障完整性仍保持良好。

屏障功能检测图表；表观通透性（Papp cm/s）与不同条件的关系；阈值线位于 1×10⁻⁶；气液界面（ALI）分析。
图 9：肺芯片模型中屏障功能的评估。
在无细胞的细胞外基质（ECM）包被芯片（渗漏阳性对照；黑色）、健康（粉色）和慢性阻塞性肺疾病（COPD）（绿色）共培养模型中，分别于气液界面（ALI）培养前后10天测量表观通透性（Papp）。每个点代表一个独立的芯片。健康模型使用来自不同供体的细胞，而COPD模型使用来自单个患者的细胞。请点击此处查看该图的放大版本。

健康与慢性阻塞性肺病（COPD）模型的通透性比较图；数据分析结果，通透性评估。
图10：健康与慢性阻塞性肺病（COPD）模型中屏障功能的比较。
在健康（左）和慢性阻塞性肺病（COPD）（右）共培养模型中，于气液界面（ALI）培养10天前后测得的表观通透性（Papp）。每个点代表一个独立的芯片。数据以均值±标准差表示。COPD模型包含来自三名患者的细胞，而健康模型则整合了不同供体的细胞。请点击此处查看该图的高清版本。

紧密连接和黏附连接的免疫检测

免疫荧光分析证实了连接蛋白的结构组织。ZO-1 沿支气管上皮细胞边界呈连续性定位，表明上皮屏障完整（图 11A）。同样，VE-钙黏蛋白染色显示其在内皮细胞连接处呈均匀分布，符合融合的内皮单层结构。内皮细胞呈现出沿流动方向排列的细长形态（图 11B）。

在紧密连接和黏附连接蛋白的定位方面，健康模型与慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型之间未观察到差异。这些发现与功能性屏障数据一致，表明两种模型均存在具有生理相关性的上皮-内皮界面，且连接完整性得以保持。

显示ZO-1、VE-钙黏蛋白和DAPI在细胞连接分析中的免疫荧光显微镜图像。
图11：肺芯片共培养模型中连接蛋白的表达。
在气液界面（ALI）培养14天后获得的顶视图免疫荧光图像，显示ZO-1在气道上皮区的定位（A）以及VE-钙黏蛋白在内皮区的定位（B）。细胞核经DAPI染色。箭头指示流动方向。比例尺：100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

表型分析

芯片冷冻切片的免疫荧光染色显示膜顶侧存在β-tubulin IV阳性细胞，表明气道上皮细胞已分化为纤毛细胞，这是成熟支气管上皮的一个典型特征（图12A）。CD31染色证实膜基底侧存在连续的内皮单层细胞（图12B）。这些结果表明，共培养系统能够支持两种模型中生理相关上皮和内皮表型的建立。

β-微管蛋白IV荧光显微镜成像，DAPI染色，CD31标记；细胞结构分析。
图12：肺芯片横截面的免疫荧光图像。在气液界面（ALI）培养14天后，芯片横截面的代表性免疫荧光染色结果显示气道上皮区表达β-tubulin IV（A），内皮区表达CD31（B）。细胞核经DAPI染色。比例尺：50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

RNA 提取与定量

从气道上皮细胞中分离的RNA浓度范围为59至135 ng/µL，RNA完整性数值（RIN）11为7.4–9.6；而在两种模型中，微血管内皮细胞的RNA浓度范围为12至46 ng/µL，RIN值为9.6–10。数据表明，两种模型均获得了足量的高质量RNA，适用于后续分子分析。

补充表 1：支气管气道上皮细胞的供体信息。 该表格列出了用于健康模型的支气管气道上皮细胞。请点击此处下载该文件。

补充表 2：肺微血管内皮细胞的供体信息。 用于健康模型的肺微血管内皮细胞的供体信息。请点击此处下载该文件。

补充表3：患者信息。 该表格列出了用于慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型中的气道上皮细胞和肺微血管内皮细胞的患者信息。请点击此处下载该文件。

补充表4：本方案中使用的关键试剂和培养基概述。请点击此处下载该文件。

补充视频 1：气道通道中的纤毛摆动（健康模型）。
代表性视频，显示气液界面（ALI）培养 14 天后的纤毛摆动。请点击此处下载该文件。

补充视频 2：气道通道中的纤毛搏动（慢性阻塞性肺疾病模型）。
代表性视频显示气液界面（ALI）培养 14 天后的纤毛搏动情况。请点击此处下载该文件。

讨论

本研究提供了一种建立肺芯片共培养系统的详细方案，可用于构建健康模型和慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型。健康模型采用市售支气管上皮细胞和肺微血管内皮细胞，COPD模型则使用来自移植肺患者的原代细胞。在两种模型中，两类细胞被一种多孔、可拉伸的膜隔开，该膜经细胞类型特异性的细胞外基质（ECM）包被，从而构建出更接近于体内生理状态的微环境 体内 肺。该方案还包括评估屏障完整性、细胞表型分析以及从各室提取RNA的方法。两种模型均在动态灌注和气液界面（ALI）条件下成功维持培养，形成了具有完全分化的假复层气道上皮的生理相关性上皮-内皮屏障。内皮细胞沿流动方向排列，如观察所示。 体内并且从两个区室中均获得了高质量的RNA。

成功建立该共培养系统需要几个关键步骤。必须精确接种上皮细胞以实现均匀覆盖，因为分布不均可能导致表面覆盖不完全以及屏障形成受损。若出现此类情况，应轻轻吸除上皮侧腔室中的培养基并重新接种上皮细胞。只有当上皮层和内皮层均形成连续的单层细胞后，方可建立气液界面（ALI）；过早暴露于气液界面可能导致血管侧培养基渗漏至气道腔室，并影响细胞分化。如果尚未达到汇合状态，应延迟建立气液界面。

顶端培养基去除不完全或气液界面暴露不一致可能导致上皮细胞成熟程度不均一。可通过将流速提高至600 µL/h持续3–4分钟，以清除上通道中的残留培养基。气泡形成会干扰灌注并影响细胞活力，通常由平衡不足引起。可通过暂时提高流速来清除气泡 以600 µL/h的速度持续3-4分钟，或若阻塞持续存在，则断开芯片并使用移液器手动清除阻塞物。在慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型中，过量的黏液分泌可能阻塞气道通道并影响灌注；此时建议用DPBS轻柔冲洗，随后重新建立气液界面（ALI）。

目前大多数结合气道上皮细胞和肺内皮细胞的共培养系统依赖于商业化的原代细胞以及胶原蛋白或纤连蛋白等通用的细胞外基质（ECM）涂层10,12。尽管这些涂层能够支持细胞黏附，但仅能部分重现气道–血管界面的生物化学和机械特性。相比之下，本系统采用细胞类型特异性的ECM涂层，提供了一个更接近人类肺组织的微环境13。

屏障功能通常通过跨上皮/跨内皮电阻（TEER）进行评估，但该方法可能受到上皮多层结构的影响14。在本研究中，采用葡聚糖通透性来评估功能完整性。所观察到的Papp值低于强屏障完整性的阈值（1 × 10⁻6 cm/s），表明上皮-内皮界面具有良好的完整性。气道上皮表现出分化特征，包括纤毛搏动和黏液分泌，同时ZO-1和VE-钙黏蛋白在细胞连接处持续定位。此外，从两个区室中均稳定获得了高质量的RNA，可用于细胞类型特异性的下游分析。

本研究的一项重要进展是开发出一种慢性阻塞性肺疾病（COPD）肺芯片模型，其中上皮细胞和内皮细胞均来源于同一患者。据目前所知，此类患者匹配的共培养模型此前尚未见报道。以往的研究已引入COPD来源的上皮细胞7,8，但依赖于商业来源的内皮细胞，限制了对疾病特异性上皮-内皮相互作用的探究。本模型通过保留患者特异性的细胞间相互作用，克服了这一局限性。

慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型重现了关键的疾病特征，包括黏液分泌增加3，同时在流动条件下维持了内皮细胞的排列和连接完整性。重要的是，尽管黏液分泌增加，来源于患者的上皮细胞与内皮细胞共培养并未影响屏障功能或细胞活力。该系统在气液界面（ALI）条件和持续灌注下保持稳定，适用于长期研究。此外，该平台可实现机械拉伸，进一步提高了其生理相关性。

该工作流程的一个重要优势在于，能够在相同平台和可比较的实验条件下评估健康状态与慢性阻塞性肺疾病（COPD）状态。这使得能够直接评估疾病相关差异，包括上皮细胞分化、内皮功能以及屏障完整性。这些模型也可根据具体研究问题独立使用。健康模型适用于机制性研究和信号通路调控，而COPD模型则为治疗评估和药物测试提供了平台。能够从各个独立区室中分别提取高质量RNA，进一步实现了细胞类型特异性的分子谱分析。在COPD模型中使用患者匹配的细胞，可保留与疾病相关的细胞间相互作用，而若使用非匹配来源的细胞，则这些相互作用将可能丢失。

尽管具有上述优势，但仍需考虑一些局限性。肺芯片系统的使用需要专门的设备和技术专业知识，这可能会限制其可及性。此外，该模型目前尚未包含其他相关的肺部细胞类型，例如免疫细胞或基质细胞，而这些细胞可能会影响对病原体和药物的反应。然而，该平台可以进行改造以引入循环免疫细胞，从而能够研究它们与上皮和内皮区室之间的相互作用。获取患者来源的慢性阻塞性肺疾病（COPD）样本也可能受限，且患者间的个体差异可能影响实验的可重复性。此外，过量的黏液分泌可能干扰灌注过程。

本研究未探讨周期性机械拉伸的影响，但这代表了一个重要的未来研究方向。可拉伸膜能够模拟与呼吸相关的机械力，而这些机械力已知会影响细胞功能、修复及稳态15,16。既往研究表明，机械应变可增强纳米颗粒穿过上皮屏障的摄取与转运10。

综上所述，本文介绍的健康与慢性阻塞性肺疾病（COPD）肺芯片模型为研究生理和病理状态下上皮-内皮相互作用提供了一个具有生理相关性的平台。该系统的动态特性可精确控制流动条件，支持药物测试和病原体暴露研究等应用。本方案为传统的体外（in vitro ）和动物模型提供了可靠的替代方法，是推动转化呼吸系统研究的重要工具。

披露

所有作者均无利益冲突。

致谢

本工作由弗兰德斯研究基金会的研究资助（G065221N）提供支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTA (1X) （用于内皮细胞）Gibco25200-056用于肺微血管内皮细胞的酶法解离。
120 mm x 120 mm 方形细胞培养皿VWR688161用于芯片制备和操作过程中固定芯片支架。
2100 生物分析仪AgilentG2939A用于评估 RNA 的质量和完整性。
2-丙醇Sigma-AldrichI9516用于 RNA 提取过程中的 RNA 沉淀。
4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI)InvitrogenD1306用于免疫荧光过程中细胞核的染色。
50 mL 圆锥形离心管Cellstar227261用于细胞收集、离心及细胞悬液的制备。 
Agilent RNA 6000 Nano 试剂盒Agilent5067-1511用于使用生物分析仪进行 RNA 质量分析。
两性霉素 BGibco15290-026用于防止细胞培养过程中的真菌污染。
自动细胞计数仪NanoEntekEVE PLUS用于接种前测定细胞浓度和活力。
细胞培养多孔板，48 孔，无菌Falcon353078用于染色过程中固定组织切片。
离心机Hettich320R用于接种前细胞沉淀。
芯片支架Emulatesupport@emulatebio.com用于在表面活化、包被和细胞接种过程中支撑和固定芯片。
氯仿Sigma-Aldrich366927用于 RNA 提取过程中的相分离。
Cicero 旋转盘模块CrestOptics S.p.A.用于执行高速共聚焦荧光成像。
盖玻片EprediaBB02400600AC13MNZ0用于共聚焦成像过程中支撑芯片。规格：24 x 60 mm，#1.5
冷冻切片机Thermo Fisher ScientificNX70用于切片 OCT 包埋的样本。
培养模块 (Zoë-CM)Emulatesupport@emulatebio.com用于控制微流控系统内细胞培养的环境条件。
定义胰蛋白酶抑制剂 (DTI)Thermo FisherR007100用于上皮细胞解离后中和胰蛋白酶活性。
级联蓝 3KDa 右旋糖酐Thermo FisherD7132作为荧光示踪剂用于评估屏障通透性。
内皮细胞生长培养基 MV2 试剂盒PromoCellC-22022用于肺微血管内皮细胞的维持和扩增。
ER-1  表面活化试剂（光敏活化试剂粉末）Emulatesupport@emulatebio.com用于活化芯片表面以进行后续包被。
ER-2  表面活化试剂（缓冲液）Emulatesupport@emulatebio.com在芯片表面活化过程中作为缓冲液使用。
无水乙醇Thermo Fisher Scientific437433T用于 RNA 提取过程中洗涤 RNA 沉淀。
荧光酶标仪AgilentBioTek Sinergy H1 微孔板读取仪用于测量通透性实验中的荧光强度。
牛皮明胶Sigma-AldrichG9391用于包被培养表面以促进内皮细胞黏附。
山羊抗小鼠 Alexa Fluor 488（用于 ZO-1 和 β-微管蛋白 IV）Thermo FisherA11001用于以绿色荧光检测小鼠一抗。
山羊抗小鼠 Alexa Fluor 594（用于 CD31）Thermo FisherA11005用于以红色荧光检测小鼠一抗。
山羊抗兔 Alexa Fluor 555（用于 VE-钙黏蛋白）Thermo FisherA21429用于以橙红色荧光检测兔一抗。
集线模块 (Orb-HM)Emulatesupport@emulatebio.com用于向培养模块供应气体和电力。
人支气管上皮细胞 (HBEC)LonzaCC-2540S作为气道上皮细胞用于建立健康的共培养模型。
人胶原蛋白 IVSigmaC5533用于包被 T25 培养瓶以促进上皮细胞附着。
人 I 型胶原蛋白Advanced Biomatrix5007作为芯片包被用细胞外基质溶液的组分。
人纤连蛋白Sigma-AldrichF0895作为芯片包被用细胞外基质溶液的组分。
人层粘连蛋白Sigma -AldrichL4544 作为芯片包被用细胞外基质溶液的组分。
人肺微血管内皮细胞 (HPMEC)PromoCellC-12281作为肺微血管内皮细胞用于建立健康的共培养模型。
人重组表皮生长因子 (hrEGF)PromoCellC-60182用于促进上皮细胞增殖。
氢化可的松储备液StemCell Technologies7925作为培养基补充剂用于支持气道上皮细胞的分化。
ImageJFiji 软件版本 ImageJ 1.54p用于处理和分析获取的图像。
用于细胞培养的倒置显微镜 Leica MicrosystemsDMi1用于培养过程中监测细胞形态和融合度。
iSpacer SUNJin LabIS307用于成像过程中样本安装时创建定义的腔室。厚度：0.3 mm。
Kinetix 相机Teledyne Photometrics用于捕获高分辨率荧光图像。
显微镜相机Leica MicrosystemsFLEXA CAM C1用于在培养和实验过程中捕获细胞图像。
圆形显微镜盖玻片Marienfeld0111620用于覆盖载玻片上的芯片切片。描述：22 mm figure-materials-1
单克隆小鼠抗人 CD31 - 克隆 JC70AAgilentM082329-2用于检测内皮细胞标志物 CD31。
单克隆小鼠抗 ZO-1 - 克隆 ZO1-1A12Invitrogen33-9100 (100µg)用于检测紧密连接蛋白 ZO-1。
单克隆小鼠抗 β-微管蛋白 IV 抗体 - 克隆 ONS.1A6Sigma-AldrichT7941  (0.2 mL)用于检测纤毛上皮细胞。
单克隆兔抗 VE-钙黏蛋白Cell Signaling Tech.D87F2用于检测内皮连接蛋白 VE-钙黏蛋白。
封片剂Ibidi50001用于样本封片并在成像过程中保持荧光信号。
Nikon Ti2 倒置显微镜Nikon用于在荧光条件下对芯片样本进行成像。
NIS-ElementsNikon Instruments Europe B.V.版本 6.10.01 / 6.20.01用于控制显微镜实验中的图像采集。
正常山羊血清Abcamab7481用于免疫染色过程中阻断非特异性抗体结合。
最佳切割温度 (OCT) 包埋剂VWR361603E用于包埋样本以进行冷冻切片。
多聚甲醛 (PFA)Sigma-Aldrich1.04003用于染色前固定细胞。
青霉素/链霉素Gibco15140-122用于防止细胞培养过程中的细菌污染。
灌注模块 (Pod)Emulatesupport@emulatebio.com用于驱动微流控芯片中的受控流体流动。
磷酸盐缓冲液 (DPBS -/-)Gibco14190-094用于洗涤细胞、配制细胞外基质溶液以及染色过程中的洗涤步骤。
Pic 21 微型离心机Thermo Fisher Scientific75002415用于在提取过程中沉淀 RNA 并分离相。
PneumaCult ALI 培养基（上皮细胞分化培养基）试剂盒StemCell Technologies5002用于支持气道上皮细胞在气液界面的分化。
PneumaCult ExPlus 培养基（气道上皮细胞扩增培养基）试剂盒StemCell Technologies5041用于气道上皮细胞的扩增。
剃刀刀片Thermo Fisher Scientific11904325用于切割 芯片。
无 RNA 酶的糖原Thermo Fisher ScientificR0551作为载体以增强 RNA 沉淀。
RNA酶清除剂 (RNAse ZAP)InvitrogenAM9780用于清除表面的 RNase 污染。
无 RNase 水Thermo Fisher ScientificR0551用于重悬纯化的 RNA。
Steriflip-HV，0.45 µm，PVDF，已灭菌EMD Millipore SE1M003M00用于使用前过滤和脱气培养基。
可拉伸芯片 (Chip-S1)Emulatesupport@emulatebio.com用于在微流控环境中对细胞进行动态机械刺激下的培养。
Superfrost TMPlus 黏附载玻片 EprediaJ1800AMNZ用于染色过程中固定和保留芯片切片。
合成光稳定视黄酸 (EC-23)Tocris4011用于促进气道上皮细胞的分化。
T25 培养瓶Falcon353108用于气道上皮细胞的培养和扩增。
T75 培养瓶Falcon353136用于肺微血管内皮细胞的培养和扩增。
吐温 X-100Sigma-AldrichT8787用于免疫染色过程中细胞的通透化处理。
TRIzol（基于苯酚的 RNA 分离试剂）Invitrogen15596026用于裂解细胞并分离 RNA。
台盼蓝InvitrogenT10282用于评估细胞活力。
TrypLE Express（用于上皮细胞）Thermo Fisher12604013用于气道上皮细胞的酶法解离。
紫外灯nailstar professionalNS-01-EU用于活化芯片表面。
真空装置//用于使用前对培养基进行脱气。
血管内皮生长因子 (VEGF)GibcoPHC9394用于支持内皮细胞的生长和维持。
维生素 CLonzaCC-4398用于支持内皮细胞的生长和维持。
涡旋振荡器VWR444-0996用于 RNA 提取过程中混合样本。

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