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方法文章

利用OS-DCE OAI在癌症和伤口愈合的临床前模型中评估氧合与血管灌注

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DOI：

10.3791/70689

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2026年4月7日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Physics, University of Wisconsin, 2University of Texas MD Anderson Cancer Center

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于评估癌症和伤口愈合的临床前模型的氧敏感动态对比增强光声成像（OS-DCE OAI）方案。OS OAI 可对氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白进行成像，从而绘制组织氧合图；DCE-OAI 可对外源性对比剂的药代动力学进行成像，进而绘制血管灌注图。

摘要

氧敏感光声成像（OS OAI）与动态对比增强光声成像（DCE OAI）可提供互补的、非侵入性组织生理学检测信号。OS OAI 利用对内源性氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的多光谱检测，生成血氧饱和度（%sO₂）分布图，而 DCE OAI 则追踪对比剂在组织中的动力学过程 体内 近红外吸收剂的药代动力学用于量化血管灌注和通透性。本实验方案旨在介绍一种统一的光声-动态对比增强氧饱和度成像（OS-DCE OAI）工作流程，可在两种常用的临床前模型中同时评估氧合状态与灌注情况：原位乳腺癌肿瘤和全层皮肤伤口。

在本方案中，我们展示了乳腺癌或撕裂伤小鼠模型的光声成像（OAI）。对于氧饱和度（OS）OAI，需在700–875 nm范围内进行多层多光谱扫描，以实现光谱解混并估算血氧饱和度（%sO₂）。对于动态对比增强（DCE）OAI，则在静脉团注吲哚菁绿（ICG）前后，以≤5秒的时间分辨率进行重复采集，可采用700–875 nm的多光谱采样或800 nm的单波长采样，从而生成光声信号幅度随时间变化的曲线。本文详细描述了动物模型的建立、光声成像前的准备、OS OAI与DCE OAI的采集过程及分析方法，用以评估氧合状态和血管灌注特征，同时提供了针对运动伪影、表层吸收体干扰以及注射失败等问题的关键故障排除指导。

综上所述，该OS-DCE OAI方案可整合提供缺氧和血管运输的功能图谱，能够比传统的宏观解剖学指标更早地检测肿瘤和伤口中的生理变化。OS-DCE OAI可便捷地适用于其他疾病模型。

引言

光声成像（OAI），也称为光电声成像或多光谱光声断层成像，是一种相对较新的成像方式，它结合了光学激发与超声（US）检测，能够实现深层组织成像1,2。在OAI中，短促的纳秒级激光脉冲激发内源性发色团（如氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白），引起局部热弹性膨胀并产生宽带声波，这些声波由超声换能器检测。这些信号使OAI能够在体内实现厘米级的成像深度，同时以超声级的空间分辨率提供光学对比度的图像。in vivo。当在多个波长下采集数据并通过光谱解混分析时，氧敏感（OS）OAI可估算氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的相对浓度，从而推断组织氧饱和度（%sO₂）2。血液氧饱和度为微血管生理功能提供了一种功能性评估，而这种评估通过其他方法难以无创获取。

血管灌注还可用于微血管生理学的评估。血管灌注是血管血流、通透性和血管表面积三者共同作用的结果3。为了定量测量灌注，可使用外源性对比剂结合OAI技术进行动态对比增强OAI（DCE OAI）。该方法通过在对比剂注射前、注射中和注射后进行时间序列成像，以监测对比剂的药代动力学（PK）。这些结果可通过建模来量化对比剂从血浆隔室向肿瘤细胞外血管外隔室的流入速率（NKtrans），以及从肿瘤细胞外血管外隔室返回血浆隔室的流出速率（kep）。我们开发了一种PK建模方法，可避免光通量（即组织中的光散射和吸收导致组织内辐射能量分布不均）这一长期存在的难题4。我们的方法将动态OAI信号的变化归一化为从0%（注射前）到100%（最大增强）的范围，然后利用微分方程估算NKtrans流入速率和kep。其他DCE OAI研究采用的标准PK建模方法则存在一个主要假设缺陷，即认为光通量在组织内是均匀分布的5,6。

DCE OAI 结果还可用于评估流入速率，方法是通过经验测量最大信号增强（MSE）、达到 MSE 的时间（TTP）、斜率（通常从注射开始至 TTP）以及初始曲线下面积（IAUC；通常也指注射后从注射时刻至 TTP 期间）7。需要注意的是，如果 TTP 出现在药代动力学（PK）曲线的较晚阶段，斜率或 IAUC 可取自曲线的线性部分，或从注射时刻至注射后 1 分钟的时间段内。我们已证明，经验性测量在评估给予肿瘤模型的治疗效果或伤口愈合过程时同样具有应用价值8,9。其他研究也表明，使用经验性测量方法评估肿瘤血管通透性和肝纤维化具有重要意义10,11。此外，PK 曲线的形态还可用于定性地将肿瘤血管灌注分为高或低水平12,13,14。

此外，单次注射后时间点的OAI信号可作为灌注的实证评估指标，称为非动态对比增强OAI（CE OAI）15。显示明亮肿瘤或伤口的CE OA图像具有直观且高度可视化的优点，但通常仅用于对高灌注与低灌注进行定性评估。一般而言，TTP后OAI信号的动态变化并未被用于对肿瘤血管灌注进行实证评估。然而，如下所示，伤口的流入速率极快，使得NKtrans、TTP、斜率和IAUC难以准确测量。因此，我们采用流出相的线性或指数斜率作为评估伤口血管灌注的实证指标9。

大多数有机光声成像剂在近红外（NIR）波长范围内吸收光，该波长可更深入地穿透组织16,17然而，波长大于900 nm时水的吸收作用限制了可利用的 体内 OAI 波长范围适用于大多数应用的 700–900 nm2吲哚菁绿（ICG）是一种典型的动态对比增强光声成像（DCE OAI）造影剂，因其在780–800 nm范围内具有强近红外吸收、可产生中等强度的光声成像（OAI）信号，且具备良好的生物相容性，已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于临床。这些特性使其能够实现血管内对比增强，并生成可解读的药代动力学（PK）曲线。

我们开发了一种结合了氧饱和度成像（OS）与动态对比增强光声成像（DCE OAI）的联合协议，用于评估实体瘤和伤口的临床前模型中的氧合状态及血管灌注情况8,9。该协议中的OS部分可对多个成像切片进行氧合评估，覆盖小鼠模型中整个肿瘤或伤口的体积。本协议的DCE部分可选择使用多个激光波长对肿瘤或伤口的单一切片进行成像（提高对比剂检测的准确性），或使用单一激光波长对多达5个切片进行成像（提高空间覆盖范围）。我们已将OS-DCE OAI用于监测放射治疗或使用血管破坏剂康布他斯他丁A4磷酸盐（combretastatin A4 phosphate）处理肿瘤模型后，其氧合状态和血管灌注的变化4,8。我们还应用OS-DCE OAI监测了伤口愈合过程9。DCE OAI使光声成像具备了通过血管灌注监测疾病进展的能力，可广泛应用于多种疾病的研究。

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方案

所有操作均须在机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的情况下进行。本方案中的所有操作均已获得本机构IACUC的批准。

1. 麻醉（用于后续操作）

  1. 诱导麻醉。最初使用5%异氟烷（溶于100%氧气载气）诱导并维持麻醉，直至小鼠失去意识。
  2. 维持麻醉。继续以1.5–2%异氟烷（溶于100%氧气载气）对小鼠进行麻醉，并确认足底反射消失。
  3. 维持正常体温。确保将动物置于温暖的表面上，并在整个麻醉期间持续监测体温。
    注意：（暂停点）待动物完全麻醉后，进行肿瘤植入或创口形成操作。

2. 准备模型 

注意：所有细胞操作均应在生物安全柜中进行，以避免暴露和潜在污染。

  1. 建立4T1原位肿瘤模型（图1）。
    1. 在冰上准备细胞：将4T1细胞重悬于预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中，终浓度为2 × 107 个细胞/mL。
    2. 混合细胞与基质：将细胞悬液与富含细胞外基质的预冷生物水凝胶按1:1（v/v）比例混合，最终获得含1 × 107 个细胞/mL的混合液。
    3. 装载注射器：将细胞混合液装入体积不超过1.0 mL的无菌实验用注射器中，每针注射体积限制为100 µL（含1 × 106 个细胞）。可选操作：将注射器轻轻加热至30 °C，使生物水凝胶略微增稠，从而在注射部位更集中地保留。
      警告：注意注射器针头锋利，避免回套针帽。
    4. 按照第1节所述方法对小鼠进行麻醉。
    5. 去除毛发（如有）：脱去乳腺区毛发。若使用裸鼠（athymic nude mice），可省略此步骤。
    6. 定位针头并注射：对第4对腹股沟乳腺脂肪垫进行消毒，针尖斜面向上插入脂肪垫，缓慢注射100 µL，避免反流。
    7. 从麻醉中恢复动物：将小鼠放回预热的笼盒中，并持续监测直至其能够自主活动。
    8. 允许肿瘤生长：接种后8–10天，使4T1肿瘤生长至最小直径0.3 cm后再进行成像。
      注：直径更大的肿瘤也可成像。肿瘤直径可使用校准的游标卡尺测量。若肿瘤直径超过IACUC（或相应机构伦理委员会）批准的最大限值，应实施安乐死。请遵循原位注射操作，并根据所需移植方案调整细胞数量或注射体积。
  2. 在小鼠中建立切除性伤口模型（图2）
    1. 准备手术区域：对手术区域及器械进行灭菌处理。
    2. 按照第1节所述方法对小鼠进行麻醉。
    3. 去除毛发（如有）：脱去背部区域毛发。若使用裸鼠（athymic nude mice），可省略此步骤。
    4. 给予镇痛处理：将小鼠固定于无菌手术台面上，于背部皮下（SC）注射0.05–0.1 mg/kg的丁丙诺啡。
    5. 消毒伤口区域：先用聚维酮碘对背部皮肤进行消毒，再用70%乙醇处理。
    6. 制造切除性伤口：使用6 mm活检打孔器标记创面范围，切除皮肤及肉膜层（panniculus carnosus），形成全层皮肤缺损。
    7. 安置硅胶环：
      1. 将环形硅胶环居中放置于伤口周围，确保环的内径比伤口直径大2–4 mm，环宽度约为5 mm。
      2. 从硅胶材料片上裁剪出环形硅胶环，使用透明缝线材料将环缝合固定。如有需要，可使用薄层粘性敷料辅助固定环状结构。
        注：有色缝线材料可能吸收近红外光（NIR），因此不应使用。
    8. 缝合固定硅胶环：采用八针等距间断缝合，将硅胶环牢固固定于周围皮肤，注意避免组织受压坏死。
    9. 应用闭塞性敷料：用闭塞性敷料覆盖伤口及硅胶环，以保护创面并标准化伤口微环境。
    10. 从麻醉中恢复动物：将小鼠放回预热的笼盒中，并持续监测直至其能够自主活动。
    11. 允许动物愈合：在初次造伤后6小时给予一次丁丙诺啡；次日再给予两次，间隔6小时。根据实验设计进行每日护理和评估，直至伤口完全愈合。
    12. 每日更换敷料：每日成像或拍照后应更换闭塞性敷料，以减少污染并维持无菌状态。
      注：（关键步骤）使用硅胶环固定伤口可抑制伤口收缩，促进再上皮化，提高与人类伤口愈合的转化相关性。（暂停点）敷料应用后，可暂停至下一次预定的评估或成像时间点。

3. OS-DCE OAI 数据采集协议

  1. 准备小鼠和OAI扫描用的对比剂。
    1. 制备造影剂。
      1. 配制1.62 mM的ICG造影剂无菌水溶液。使用0.3 µm注射器滤器过滤该溶液。用无菌实验室注射器吸取100 μL该溶液。
        注意：根据吲哚菁绿（ICG）的分子量775 g/mol计算，该剂量相当于162 nmol或125.5 μg。按小鼠体重约20 g计算，剂量为每千克体重6.28 mg。动物等效剂量是人等效剂量的12.3倍。18因此，人体等效剂量为每千克体重0.51毫克。人体最大耐受剂量为每千克体重2毫克。19因此，本项临床前研究中使用的剂量约为人体最大耐受剂量的¼。
    2. 准备OAI扫描仪。
      1. 用去离子蒸馏水填充成像水箱。将水箱温度设置为 36 °C，适用于小鼠 <25 g 体重。
        注意：由于小鼠在托架中被塑料袋包裹，该水浴温度可使小鼠核心体温维持在约 37 °C。对于体型较大的小鼠，水浴温度应设置为 35 °C。 >25克体重，以避免小鼠过热，因为较大的小鼠具有更多的皮下脂肪组织，可起到隔热层的作用。
    3. 按照第1节所述方法对小鼠进行麻醉。在后续采集流程中，使用100%氧气作为载气，异氟烷浓度维持在1.5–2%，以确保小鼠持续处于麻醉状态。
    4. 若进行DCE OAI，需建立静脉通路。
      1. 用肝素化生理盐水冲洗27 G尾静脉导管。将导管插入侧尾静脉，并固定导管以防止其从尾静脉脱出（图3A）。确保无气泡存在。
        注意：（关键步骤）使用肝素化生理盐水以维持导管通畅。
      2. 此外，准备一支体积不超过 500 µL 的无菌实验室注射器，可与导管连接。确保注射器中含有 100 µL 的 2.14 mM ICG（约 322 nmol；对于 20 g 小鼠，约为 16 µmol/kg）。
    5. 用超声耦合剂覆盖小鼠和支架图3B).
      1. 在肿瘤或伤口区域涂抹一层薄薄的透明超声耦合剂（图3C同时，在托架上涂抹超声耦合剂，以在托架与肿瘤或伤口区域之间形成密封。
        注意：应消除气泡。可选步骤：使用超声耦合剂前可先进行离心处理，以去除其中的空气。此外，应使用最少剂量的超声耦合剂，避免在较厚的凝胶层中形成气泡。
    6. 将小鼠放入托架中（图3D）：请参考仪器制造商的使用说明。将小鼠放入固定装置中，使其鼻部紧贴鼻插管。使用护套固定小鼠的四肢。使用门齿钩固定头部。
      1. （可选）成像小鼠时可使用带大鼠鼻罩的固定架。大鼠鼻罩可从固定架底部托起小鼠头部，若少量水泄漏至固定架内，可避免小鼠意外溺水。
    7. 将小鼠和托架放入OAI仪器中。请参考仪器制造商提供的使用说明。
      1. 观察小鼠托架是否存在任何泄漏。如果发现泄漏，应立即将小鼠和托架从仪器中取出，重新密封小鼠于托架中，以避免意外溺水。
      2. 若需进行DCE OAI，将导管与含对比剂的注射器连接。
    8. 在成像前使小鼠达到平衡状态：将小鼠置于温水浴中（35–36 °C，根据动物体型调整，参见第3.1.2节），在开始图像采集前预留10分钟以稳定其生理状态。图3E).
    9. 将小鼠相对于OAI探头进行定位：
      1. 根据制造商的说明移动小鼠或OAI探头，使肿瘤或伤口位于多层面图像序列中。
      2. 优化图像集的声速。在小鼠进行成像前平衡期间（步骤 3.1.7）完成此步骤。
      3. （关键步骤）对所有小鼠在所有时间点均需保持一致的动物体位/切片位置，以确保结果的严谨性
  2. 设置OS OAI参数。
    1. 选择图像切片参数，以多个切片覆盖整个肿瘤或伤口区域，切片厚度为1 mm。
    2. 选择吸收波长。对于 OS OAI，选择 700、730、760、800、850 和 875 nm 吸收波长。
    3. 采用信号平均：在采集下一个波长以及移动到下一个成像层面之前，设置参数以对每个波长采集10次平均信号。每个波长采集10次平均可提高每个图像层面的信噪比。
    4. 设置重复次数：
      1. 设置重复次数，如图所示 表1 以保持总采集时间约为2分钟。对于使用重复频率为10 Hz仪器的用户，每幅图像切片的总采集时间为6.0 s。
      2. 将鼠标移至下一个成像切片并返回到第一个切片位置平均需要 0.2 秒，因此每个切片共需 6.2 秒。
      3. 至少重复3次以确保测量的稳定性。如果需要更多重复次数，总采集时间超过2分钟也是可接受的。
  3. 获取OS OA图像。
  4. 设置 DCE OAI 参数。
    1. 为单切面多波长成像方案设置DCE OAI采集参数。
      1. 定位成像层面。选择 ≤5 个以肿瘤或伤口区域为中心的成像层面，层厚为 1 mm。
      2. 选择对比剂的最佳吸收波长。对于吲哚菁绿（indocyanine green）而言，其在近红外光区具有最优吸收峰，通常在780至810 nm之间。 体内 环境，将波长设置为 800 nm。
      3. 设置平均次数和重复次数，如图所示 表2这些建议可使使用成像重复频率为10 Hz的OAI仪器的用户实现≤5秒的时间分辨率，总采集时间为11.0–11.2分钟。
        注意：使用成像重复频率不同的其他仪器的用户，应调整平均次数，以保持每组图像的时间分辨率≤ 5秒。
    2. 作为步骤3.4.1的替代方案，为采用单波长的多层面成像方案设置DCE OAI采集参数。
      1. 定位成像层面。选择 ≤ 5 个以肿瘤或伤口区域为中心的成像层面，层厚为 1 mm。
      2. 选择对比剂的最佳吸收波长。对于吲哚菁绿（indocyanine green）而言，其在水溶液中的最大吸收峰约为780 nm，因此推荐检测时选用780 nm左右的激发波长，以获得最强的光学信号响应。在实际成像过程中，应结合具体实验条件（如组织穿透深度、背景荧光水平及检测设备的灵敏度）对激发和发射波长进行优化调整。 在体 环境，将波长设置为 800 nm。
      3. 设置平均次数和重复次数，如图所示 表 2这些建议可使OAI仪器用户在成像重复频率为10 Hz时，保持时间分辨率≤5秒，总采集时间为11.0–11.2分钟。
        注意：使用成像重复频率不同的其他仪器的用户，应调整平均次数，以保持每组图像的时间分辨率≤ 5 s。
  5. 获取DCE OA图像。
    1. 记录基线图像：启动采集并收集12组图像（约1分钟）。
    2. 注射造影剂：通过导管给予100 µL，同时继续采集数据。
      注意：推注时间应保持在约10–15秒内，以避免在脆弱的尾静脉导管中产生压力积聚。手动注射时，可通过保持注射器推杆压力的一致性来控制推注速度，也可使用自动注射器实现。重要的是，10–15秒的注射速率可使药物向肿瘤的初始输送更加平稳，避免因注射过快而在药代动力学（PK）曲线上产生首过效应峰值，从而改善基于实验测量数据的PK建模与分析。
      1. （关键步骤）在注射部位避免造影剂从血管泄漏至周围组织，以确保准确的团注时序。
    3. 继续成像：在注射后10.2分钟内采集剩余的128组图像，以捕捉示踪剂的流入/流出动力学。
    4. 监测成像过程以确保图像的获取：监测小鼠呼吸频率，以确保扫描期间小鼠生理状态稳定。
    5. 将小鼠和托架从仪器中取出：将小鼠从托架中取出，使其从麻醉状态恢复。将小鼠放回预热的笼子中，并持续监测直至其能够自主活动。
      注意：请使用适当的软件，并参考OAI仪器制造商提供的使用说明。以下步骤描述了采用viewMSOT v4.0软件以及Matlab R2019b或更高版本Matlab软件的OAI仪器的重建与分析流程。

4. OS-DCE OAI 结果分析

  1. 重建OA图像。
    1. 选择图像重建参数：设置图像重建采用滤波反投影法，使用50 kHz–6.5 MHz带通滤波器，并启用自动脉冲间能量校正。
    2. 重建所有图像：获取所有激光波长、所有图像切片位置和所有时间点的图像。此数据量可能需要较长时间进行图像重建。
  2. 分析OS OA图像。
    1. 解混色团：进行光谱解混以生成氧合血红蛋白（HbO）的参数图2)，脱氧血红蛋白（Hb），总血红蛋白（其中 HbT = HbO2 + Hb) 和 %sO2 （其中 %sO2 HbO2/HbT
    2. 定义感兴趣区域：
      1. 手动绘制每个图像切片中代表肿瘤或伤口的感兴趣区域（ROI）。绘制ROI时应保守，宁可排除肿瘤或伤口边缘的像素，也不应包含周围正常组织的像素。
      2. 作为替代方法，手动绘制一个代表肿瘤边缘的ROI和另一个代表肿瘤核心的ROI。肿瘤边缘的血管化程度可能高于肿瘤核心，从而为亚区域分析提供潜在价值。
        注意：尽管可以绘制更多肿瘤或伤口亚区域的感兴趣区域（ROI），或使用HbO的像素级数值2，Hb，HbT，或%sO2 可能被评估（无需感兴趣区域），但这些较小区域的信噪比较低，导致测量不精确。
      3. 在每个波长和时间点，保持所有图像中ROI位置的一致性。
    3. 计算整个肿瘤的平均参数。
      1. 计算 HbO 的平均值2Hb、HbT 和 %sO2 在每个成像切片和每个时间点的肿瘤ROI或伤口ROI内。
      2. 对于多层OS OAI，计算HbO的平均值2，Hb，HbT，和%sO2 从所有成像切片中获取每个参数在整个肿瘤或伤口范围内的单一平均值。
    4. 评估参数稳定性。绘制 %sO 的值2 每次重复时（见步骤 3.2.4）。评估 %sO2 扫描过程中数值变化超过10%，表明测量结果在时间上不稳定。
  3. 分析DCE OA图像。
    1. 在多波长DCE OA图像中分离染料：执行光谱解混以生成HbO的参数图2，血红蛋白（Hb）和对比剂。单波长DCE OAI无需此步骤。
    2. 定义感兴趣区域。
      1. 手动绘制每个图像切片中代表肿瘤或伤口的感兴趣区域（ROI）。绘制ROI时应保守，宁可排除肿瘤或伤口边缘的像素，也不包含周围正常组织的像素。
      2. 作为替代方法，手动绘制一个代表肿瘤边缘的ROI和另一个代表肿瘤核心的ROI。肿瘤边缘的血管化程度可能高于肿瘤核心，从而为亚区域分析提供潜在价值。
        注意：尽管可以绘制肿瘤亚区域的额外感兴趣区域（ROI），或评估对比剂的逐像素值（无需 ROI），但这些较小区域的信噪比较低，会导致测量结果不精确。
      3. 在每个波长和时间点，保持所有图像中ROI位置的一致性。
    3. 从DCE OA图像中提取PK曲线。
      1. 对于每张图像切片中的感兴趣区域（ROI），导出时间点与平均ICG信号（来自多波长DCE OAI）或单个选定波长下的OAI信号（用于单波长DCE OAI）的关系数据。
      2. 计算所有图像切片的平均信号。绘制肿瘤或伤口内平均信号随时间变化的曲线称为药代动力学曲线（PK曲线）。
      3. 将每个时间点所有图像切片的平均信号值导入能够评估下述经验参数的计算机程序中。例如，Microsoft Excel 和 Graphpad Prism 可用于对图表进行简单分析。
    4. 按照步骤 4.3.5–4.3.11 所述计算经验参数。
    5. 归一化药代动力学曲线：确定注射前时间点的平均值，即基线信号。将所有注射后信号值减去基线信号值。
    6. 确定最大信号增强值（MSE）：在药代动力学曲线中找出注射后信号的最高值。
    7. 确定达峰时间（TTP）：识别MSE的时间点值。
    8. 计算药代动力学曲线的初始斜率。
      1. 从初始注射时间到TTP（达峰时间）获取该初始斜率。如果曲线过于陡峭或TTP出现过晚，可改为计算注射后1分钟时的斜率。
      2. 在此情况下，采集注射前1分钟的图像，并从药代动力学曲线的第1.0分钟至第2.0分钟计算该斜率。
    9. 计算初始曲线下面积（IAUC）：根据药代动力学曲线，计算从初始注射时间至达峰时间（TTP）期间信号值的平均值。
    10. 计算冲洗阶段的经验速率。
      1. 从TTP后1分钟至最后一个时间点的药代动力学曲线部分，采用带恒定偏移项的直线或单指数衰减函数拟合该段曲线。
      2. 使用直线的斜率或指数衰减常数作为表征清除相药代动力学速率的经验性指标。
    11. 计算增强对比OAI。
      1. 选择一个长于TTP的时间点。将该时间点的信号值确定为对比增强的度量指标。
        注意：通常选择注射后10分钟的时间点，但可根据需要选择其他时间点。
      2. 作为替代方案，可根据需要计算从TTP到选定时间点的平均信号、从TTP到最后一个时间点的平均信号，或其他时间段内的平均信号。
      3. 请注意，平均信号相当于这两个时间点之间药代动力学曲线下的面积，该参数在技术上被称为信号强度的度量，而非信号幅度的度量。
    12. 按照步骤 4.3.13–4.3.20 所述进行药代动力学建模。
      注意：以下步骤用于分析使用inVision OAI仪器获取的DCE OA图像。其他OAI仪器可能生成不同数据格式的图像。若其他仪器的数据格式可转换为MatLab可读格式，并调整为与软件包中提供的示例数据文件一致的格式，则仍可参照以下步骤分析DCE OA图像。
    13. 下载软件。
      1. 对于多波长DCE OAI，可从Github的CAMEL-MartyPagel仓库或以下网址下载OE-DCE_MSOT_Matlab：https://github.com/CAMEL-MartyPagel/OE-DCE_MSOT_Matlab。
      2. 对于单波长DCE OAI，可从Github的CAMEL-MartyPagel仓库下载DCE-MSOT_SingleWavelength_Matlab，或访问https://github.com/CAMEL-MartyPagel/DCE_MSOT_SingleWavelength_Matlab。
      3. 解压缩文件。打开SOP文件 文档 文件夹并按照软件安装与使用的标准操作程序进行操作。
    14. 将软件组件分类存放到不同的文件夹中。将以下软件文件存储在同一文件夹中：
      主代码：run_MSOT_nonneg.m
      子代码：run_DCE_MSOT_MSP.m；run_OE_MSOT_AK_nonneg.m
      其他代码：Negative_pixel_count.m；Voxel_count.m；ROI_modification.m
      文件夹名称：com.itheramedical.msotlib_beta_rev723_20221128_M2022b
      从ViewMSOT经重建和光谱解混后导出的数据
    15. 在 MATLAB 中启动程序。
      1. 双击 run_MSOT_nonneg.m 以在 Matlab 中启动程序。点击 "运行" 位于 Matlab 窗口顶部的按钮。代码可能会报告错误，提示在当前文件夹或 MATLAB 路径中未找到 run_OE_MSOT_AK_nonneg。
      2. 为修复此错误，在运行代码前输入 addpath，然后将文件路径用引号括起（例如 addpath 'C:\Users\yourname\Documents\Non negative analysis'）。
    16. 选择分析类型：输入 N 用于OE分析，以及 Y 用于DCE分析。
      注意：该程序能够分析氧增强（OE）OA图像，这类图像由%sO的组合构成2 使用21% O₂获取的图像2 呼吸气体（医用级空气）或100% O₂2 呼吸气体，本方案所述的OS-DCE OAI研究中未使用该气体。
    17. 选择数据：
      1. 选择包含 DCE OAI 文件的文件夹。请选择主扫描文件夹，而非 MSP 子文件夹。
      2. 然后验证扫描名称。最后，选择用于保存分析后数据的文件夹。
    18. 进入 3 对于发色团的数量。发色团为 Hb 和 HbO2, 和对比剂。
      注意：该程序设计用于在需要时对注射到小鼠模型中的多种共注射色素进行DCE OAI分析。然而，本方案中的DCE OAI方案仅使用一种色素。
    19. 按照步骤 4.3.19.1–4.3.19.4 中所述绘制 ROI。
      1. 绘制将作为分析的动脉输入函数的血管感兴趣区域：扫描的灰度图像将显示出来。手动勾画代表血管的感兴趣区域。
        注意：通过点击图像右上角带有加号的放大镜图标来放大图像。再次点击放大镜图标可返回绘制感兴趣区域（ROI）的模式。靠近脊柱的下腔静脉通常可被识别，并可用作动脉输入函数（AIF）。
      2. 绘制肿瘤的感兴趣区域（ROI）：扫描的灰度图像将显示出来。勾画代表整个肿瘤、肿瘤边缘或肿瘤核心的ROI。若需分析多个ROI，对额外的ROI重复本完整的药代动力学建模流程（步骤4.3.12）。
      3. 绘制肌肉区域的感兴趣区域（ROI）：请勿将此ROI用于DCE OAI的计算。在使用线性参考区域模型进行DCE OAI分析时，需采用肌肉ROI，但本报告中未使用该模型。尽管如此，为使程序继续运行，此步骤仍必须执行。
      4. 确认已绘制正确的感兴趣区域（ROI）。药代动力学（PK）曲线的建模将开始。
    20. 可视化分析后的DCE OAI结果。
      1. 要加载已分析的DCE数据，请转到浏览器栏并选择DCE_MSOT_MSP。
      2. 在命令窗口中输入 清除全部.
        注意：当前文件夹标签页现已载入已分析的DCE OAI数据，其中包括：
        Average_signal_Wavelength_ICG.mat：双击此文件以查看 NK 的表格数值转 和 kep 用于肿瘤感兴趣区域（ROI）。动力学参数以3种方式列表呈现：
        NK转_avg：NK细胞的平均值转 为每个像素计算。
        NK转 _avg_signal：单个NK细胞转 整个肿瘤信号取平均值后计算得到的数值
        NK转 _nz: NK转_avg 仅使用非零像素值进行计算。
        同样，kep 可以显示数值。
        NKtrans.fig：显示NK细胞转 平均图叠加在灰度图像上。
        kep.fig：显示 kep平均图叠加在灰度图像上。
        Maps_Wavelength_ICG.mat：需要加载此文件以可视化其他NK转 或 kep 地图。加载该矩阵后，使用 "重叠编码" （单独提供）以显示所需参数。
        Muscle_Average_signal_Wavelength_ICG.mat 和 Muscle_Maps_Wavelength_ICG.mat：用于显示肌肉感兴趣区域（ROI）的参数。
        ICG信号归一化图：表示三个ROI内ICG信号随时间变化的平均值，已归一化至最大信号值。
        ICG信号图：表示三个ROI内ICG信号随时间变化的平均值。

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结果

OAI 信号可生成肿瘤和伤口中的氧饱和度图谱
在获取并重建多光谱 OAI 数据集后，可在肿瘤或伤口床内定义感兴趣区域（ROI），以量化不同波长下的信号强度。随后应用光谱解混算法，从复合的光声信号中分离出氧合血红蛋白（HbO2）和脱氧血红蛋白（Hb）的贡献。该处理可生成 HbO2、Hb、总血红蛋白（HbT）以及血液氧饱和度（%sO2）的定量图谱（图 4）。

通过OAI获得的%sO2图可用于评估肿瘤和伤口组织中的氧合状态与缺氧情况。在肿瘤中，由于血管结构异常且扭曲，形成的血管网络较差，限制了氧气输送，因此常在肿瘤内部观察到缺氧区域。异常的血管结构加上较高的氧气代谢消耗，导致肿瘤内形成缺氧区。缺氧性肿瘤通常具有恶性特征，因此OS OAI可为肿瘤恶性程度的分类提供有价值的信息。在建立伤口模型后，伤口床初期因愈合过程中的充血和新生血管形成，表现出较高的HbT和%sO2水平；随着伤口愈...

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讨论

DCE OAI 药代动力学曲线可能受到多种伪影的影响，从而降低药代动力学分析的可靠性。一个常见的问题是成像区域内存在表浅伤口、结痂或干涸的血液，这些因素可在皮肤表面引入强烈的非特异性吸收信号，掩盖深层组织的信号（图8）。在肿瘤内绘制感兴趣区域（ROI）时，应避免包含这些表层结构，以确保所提取的曲线反映的是肿瘤内部的对比剂动力学特征，而非表面伪影。

血管通路和注射质量也至关重要。图8E 展示了对比剂注射失败或部分注射后出现的典型药代动力学曲线。如果导管未能维持静脉通路、注射发生外渗，或团注未能以相对快速且连贯的方式完成，则预期的信号急剧上升可能缺失或明显减弱。同样，注射速度过慢或不一致可导致早期相斜率降低和峰值变宽，从而增加对流入动力学解释的难度。注射前建立稳定的信号基线至关重要。若未进行基线成像，则信号变化可能难以解读。

其他误差来源包括在浅麻醉下由呼吸或动物突然运动引起的运...

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披露

作者们对本研究无任何利益冲突。

致谢

作者谨此感谢 iThera Medical, GmbH 的 Neal Burton 博士提供的咨询。本研究由威斯康星大学麦迪逊分校放射学 NRSA 资助（2T32CA009206-46）、ITPT 放射科学培训生试点资助、临床与转化科学奖（CTSA）项目、国家转化科学促进中心（NCATS）资助（编号 UL1TR002373 和 TL1TR002375）、NIH R43 CA265603、NIH R01 EB034261、NIH R21 EB037731 以及 Falk 医学研究信托基金的 Falk Catalyst 奖项资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
20 G 针头Exel INT26417皮下注射针头；20G × 1"，用于配制肝素溶液
4T1 细胞ATCCCRL-2539三阴性乳腺癌细胞系
Anti-Anti（100倍稀释）Gibco15240-062抗生素混合物
活检穿孔器Integra 33-366 mm 一次性活检穿孔器 
细胞培养级水康宁25-055-CV500 mL；已检测符合美国药典（USP）注射用无菌水标准 
胶原基质溶液康宁354262用于肿瘤形成与注射的胶原蛋白基质
乙醇迪肯实验室2701广谱消毒剂
眼用润滑剂 Optixcare 50-218-844220 克/0.70 盎司；仅限动物使用 
纱布 Fisherbrand22-415-468棉纱垫；3" × 3" （7.6 厘米 × 7.6 厘米）；12 层
手套VWR76457-130腈类检查手套
肝素梅特哈尔NDC71288-402-10每10 mL含10,000 USP单位，每mL含1,000 USP单位；10 mL多剂量小瓶
吲哚菁绿TCII0535光声对比剂
异氟烷异海星素17033-091-25一种用于马和狗的非易燃、非易爆吸入麻醉剂；250 mL 
实验室影像Parafilm PM-9922" x 250'; 1" 直径核心
Nair 脱毛膏 鳊鱼 脱毛器 NairLL4038脱毛霜；富含可可脂 &和维生素E
针 TerumoNN2732R27G × 1¼" （6.40 mm × 32 mm）；R.W. Reg. 斜面 
光声成像仪iTheraMedical MSOT inVision 512光声扫描仪
PBS，1×康宁 21-040-CV500 mL；不含钙和镁的磷酸盐缓冲液 
RPMI康宁 10-040-CV细胞培养基
生理盐水HospiraNDC0409-4888-0210 mL 单剂量；0.9% 氯化钠注射液，USP
秒表iTheraMedical 4135333用于记录分钟和秒 
注射器Cardinal Health11881280121 mL 胰岛素注射器；仅用于U-100胰岛素；27G × 1/2" (0.35 × 12.7 mm)
透明伤口敷料Tegaderm1624W透明薄膜敷料框式；2 3/8" 2 3/4" （6 cm × 7 cm）
镊子赛默飞世尔科技 7626用于将小鼠皮肤向后拉，以便注射细胞
超声耦合剂EcoVue28332 g 包装，不含丙二醇，水溶性，不含对羟基苯甲酸酯和染料
未染色缝线EthiconVR49318" 切割；P-3 3/8 13 mm；未染色编织合成可吸收缝线，非USP
加热垫Repti Therm UTH120VAC 60Hz 8W 用于在麻醉期间为动物保温； 
会使用夹板吗Grace Bio-Labs476684透明硅胶管，14 mm 外径 × 10 mm 内径，厚度 0.5 mm，带缝合位点 
伤口夹Reflex 7203-10007 mm 反射式皮肤闭合系统，不锈钢

参考文献

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利用OS-DCE OAI在癌症和伤口愈合的临床前模型中评估氧合与血管灌注
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