潜在抗结核候选物的鉴定：合成、最低抑菌浓度测定及哺乳动物细胞毒性评估的逐步指南

摘要

本文介绍了一种通过表型筛选鉴定潜在抗结核药物候选物的实验方案，包括4-氨基喹啉类化合物的化学合成、其对结核分枝杆菌最低抑菌浓度的测定，以及在哺乳动物细胞系中对其细胞毒性的评估。

摘要

结核病（TB）仍然是全球由单一传染性病原体导致死亡的主要原因之一，且耐药率不断上升，使得新型治疗药物的研发成为全球公共卫生的优先事项。本实验方案描述了一种通过三个整合阶段进行潜在抗结核药物候选物筛选的表型筛选方法。首先，通过三步合成法合成一种4-氨基喹啉类化合物，并利用高效液相色谱（HPLC）、核磁共振（NMR）波谱法和高分辨质谱（HRMS）对其进行全面表征。其次，采用比色法刃天青还原微孔板检测（REMA），通过简单的视觉颜色变化读数，评估该化合物对Mycobacterium tuberculosis的抗菌活性，以确定其最低抑菌浓度（MIC）。第三，利用MTT法（3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴盐）和中性红摄取（NRU）法，在两种哺乳动物细胞系Vero（非洲绿猴肾细胞）和HepG2（人肝细胞癌细胞）中评估该化合物的细胞毒性。这两种互补的检测方法可测量不同的细胞参数，从而实现细胞毒性结果的交叉验证。结合MIC和细胞毒性数据，可计算选择性指数（SI），以评估各化合物的治疗潜力。本方案为早期抗结核药物候选物的发现及临床前评价提供了可重复、逐步操作的框架。

引言

结核病（TB）主要由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）引起，是一种主要累及肺部的人类传染性呼吸道疾病，尽管也可能出现肺外型结核。结核病通过活动性结核患者释放到空气中的Mtb杆菌传播¹。根据疾病进展的不同，感染结核者可能立即发展为活动性结核病。但通常情况下，新感染者会发展为潜伏性结核感染，此时代谢活性较低的Mtb菌在肉芽肿内存活^1,2。潜伏性结核感染者最终可能发展为活动性结核病，并出现临床症状³。目前估计，全球约四分之一的人口存在潜伏性结核感染⁴。

尽管已取得诸多进展，结核病（TB）仍然是全球严重的公共卫生问题。根据最新发布的《全球结核病报告》数据，2024年有1070万人罹患该病。同年，全球共登记结核病死亡病例123万例，使其成为由单一传染病病原体导致死亡的首要原因⁵。除结核分枝杆菌（Mtb）本身的病理特征和复杂生物学特性外，贫困和营养不良等社会经济因素，以及吸烟、糖尿病和HIV共感染等健康相关因素，进一步加大了疾病防控的难度⁵。这些因素共同导致结核病长期持续成为全球健康领域的重大挑战。

此外，目前的结核病治疗方案存在一些局限性，使疾病防控工作更加复杂。针对结核分枝杆菌（Mtb）敏感菌株，标准治疗方案采用四种药物联合疗法：异烟肼（INH）、利福平（RIF）、乙胺丁醇（EMB）和吡嗪酰胺（PZA）。这些抗生素需至少使用6个月，且治疗期间必须严格遵从医嘱。尽管该治疗方案对大多数病例有效，治愈率约为85%，但仍面临诸多挑战^5,6。其中最主要的问题包括药物副作用和疗程过长，这常常导致患者提前中断治疗。这种中断行为，加上抗生素使用不当，容易促进耐药性Mtb菌株的筛选和传播，而这些耐药菌株需要毒性更强、费用更高且疗程更长的治疗方案^7,8。

鉴于这一情况，开发新型高效抗结核药物迫在眉睫。本实验方案概述了利用表型筛选方法研究新药候选物的早期阶段。为说明该方案的应用，我们选择了一种源自LABIO-17的4-氨基喹啉化合物进行评估。LABIO-17此前已被我们的研究团队鉴定为结核分枝杆菌（Mtb）烯酰基-ACP还原酶（InhA）的抑制剂，其作用靶点与异烟肼（INH）相同^9,10。InhA参与结核分枝杆菌（M. tuberculosis）的分枝菌酸生物合成，对该杆菌的存活至关重要，因此是一个极具前景的分子靶点¹¹

方案

1. 化学合成与表征

注意：该化合物的合成与表征方法如前所述¹⁰。步骤1.1至1.4均应在通风良好的通风橱中操作，并佩戴腈类手套。

1. 试剂的配制
   1. 甲醇/乙腈（1:1）中含0.1%甲酸的溶液配制
      1. 量取等体积的甲醇（MeOH）和乙腈（CH₃CN），配制1:1（v/v）的混合液（HPLC级）。
      2. 将溶剂加入洁净干燥的容器中（例如容量瓶）。加入甲酸，使终浓度为0.1%（v/v）（例如，向1 L溶剂混合物中加入1 mL甲酸）。
      3. 轻轻涡旋或搅拌使其充分混匀。置于密闭容器中，室温避光保存。
   2. 超纯水中1%（v/v）乙酸溶液的配制
      1. 用超纯水冲洗容量瓶，然后将其放在实验台上。向瓶中加入约最终体积80%的超纯水（例如，100 mL容量瓶加80 mL；1 L容量瓶加800 mL）。
      2. 使用校准过的移液器加入冰醋酸，使其终浓度为1%（v/v）：终体积为100 mL时，加入1.0 mL冰醋酸；终体积为1 L时，加入10.0 mL冰醋酸。
      3. 通过旋转或搅拌充分混匀。用超纯水将容量瓶定容至最终刻度线，再混匀。
      4. 使用超声波清洗仪（槽式频率约40 kHz），在室温下设置为脱气模式超声处理20分钟，对溶液进行脱气。
      5. 转移至已标记的棕色瓶中（标签注明：内容物、浓度、溶剂等级、日期、配制人）。密闭保存于室温。
   3. 乙腈:甲醇（1:1，v/v），HPLC级
      1. 量取等体积的乙腈和甲醇：配制终体积为100 mL时，取50.0 mL乙腈和50.0 mL甲醇；配制终体积为1 L时，取500 mL乙腈和500 mL甲醇。
      2. 在洁净的容量瓶或瓶子中混合溶剂，通过倒置或搅拌混匀。使用0.45 µm滤膜将混合液过滤至洁净容器中，以去除颗粒物。
      3. 使用超声波清洗仪（槽式频率约40 kHz），在室温下设置为脱气模式超声处理20分钟，对溶液进行脱气。
      4. 转移至已标记的棕色瓶中（标签注明：成分、溶剂纯度、日期、配制人）。密闭保存于室温，避免受热和光照。
   4. 用于柱层析的正己烷/乙酸乙酯7:3（v/v）溶液的配制
      1. 量取最终体积的70%的正己烷。例如：配制100 mL最终体积时，加入70 mL正己烷。
      2. 量取最终体积的30%的乙酸乙酯。示例：最终体积为100 mL时 → 取30 mL乙酸乙酯。
      3. 将两种溶剂加入一个洁净、干燥的容器（如容量瓶或瓶子）中混合。
      4. 颠倒容器或搅拌直至充分混匀，形成均一溶液。在容器上贴标签，注明成分、日期、溶剂纯度等级及配制者。
   5. 用于柱层析的正己烷/乙酸乙酯1:1（v/v）溶液的配制
      1. 量取最终体积的50%的正己烷。例如：最终体积为100 mL时，取50 mL正己烷。
      2. 量取最终体积的50%的乙酸乙酯。示例：最终体积为100 mL时 → 取50 mL乙酸乙酯。
      3. 将两种溶剂加入一个洁净、干燥的容器（如容量瓶或瓶子）中，通过倒置或搅拌充分混合，直至形成均一溶液。
      4. 用成分、日期、溶剂纯度等级和配制人信息标记容器。
   6. 饱和碳酸氢钠（NaHCO₃）溶液的制备
      1. 称取过量的碳酸氢钠（NaHCO₃）（每100 mL水约15–20 g）。
      2. 将碳酸氢钠加入含有已知体积蒸馏水（例如100 mL）的洁净烧杯中。使用磁力搅拌器或玻璃棒在室温（20–25 °C）下持续搅拌混合物。
      3. 继续搅拌，直至不再有固体溶解，且底部残留少量未溶解的碳酸氢钠——这表明溶液已达到饱和。
      4. 让悬浊液静置10–15分钟，使未溶解的固体沉淀。通过滤纸或烧结玻璃漏斗过滤混合物，以除去多余的未溶解碳酸氢盐。
      5. 收集澄清的滤液，即饱和碳酸氢钠溶液。
      6. 将溶液储存于密封良好的瓶中，并用标签明确标注化合物名称、浓度（饱和）、配制日期及您的姓名首字母。
      7. 将溶液置于室温保存，并在需要时新鲜配制，因为 CO₂ 可能会缓慢逸出，导致浓度随时间发生变化。
2. 6-溴-2-甲基喹啉-4-醇（3）的合成
   1. 将4-溴苯胺（1.2 g，7.3 mmol）和无水硫酸镁（1.08 g，9.0 mmol）溶于乙醇（15 mL）中，配制成溶液。
   2. 加入冰醋酸（0.33 mL）和乙酰乙酸乙酯（1.8 mL，14.1 mmol）至溶液中。将反应混合物在90 °C下搅拌16小时。
   3. 通过孔径为11 µm的纤维素定性滤纸过滤反应混合物，以除去悬浮的硫酸镁。
   4. 使用旋转蒸发仪蒸发乙醇，得到丙烯酸酯中间体。
   5. 将中间产物置于含有高性能合成导热液（见材料表）（15 mL）的适当油浴中，在230–250 °C下加热15分钟，以完成反应。
   6. 将混合物冷却至室温。过滤生成的沉淀，并用正己烷和氯仿洗涤。
   7. 使用旋转蒸发仪在减压条件下浓缩最终产物，直至完全除去所有残留溶剂（参见材料表）。
3. 6-溴-4-氯-2-甲基喹啉（4）的合成
   1. 将6-溴-2-甲基喹啉-4-醇（0.65 g，2.8 mmol）溶于甲苯（10 mL）中，制备成溶液。向该溶液中加入五氯化磷（0.65 mL，6.9 mmol）。
   2. 在110 °C下搅拌反应混合物2小时。使用旋转蒸发仪除去多余的五氧化二磷氯化物（phosphorus(V) oxychloride）。
   3. 将残留物置于冰浴中冷却。用饱和碳酸氢钠溶液中和反应混合物。
   4. 用乙酸乙酯萃取产物（3 × 50 mL）。合并有机相，并用无水硫酸钠干燥。
   5. 使用旋转蒸发仪蒸去溶剂，得到固体残留物。再用旋转蒸发仪干燥所得固体，得到粗产物。
   6. 使用硅胶（35–70 目）进行快速柱层析，以正己烷:乙酸乙酯（7:3）为洗脱剂，纯化该化合物。
4. 6-溴-2-甲基-N-(4-(哌啶-1-基)苯基)喹啉-4-胺（6）的合成
   1. 在20 mL异丙醇中加入6-溴-4-氯-2-甲基喹啉（0.53 g，2 mmol）、4-(哌啶-1-基)苯胺（0.57 g，3 mmol）、吡啶（0.24 mL）和37%盐酸（0.2 mL），配制反应混合物。
   2. 在 85 °C 下搅拌反应混合物 16 小时。使用旋转蒸发仪除去溶剂。
   3. 用饱和碳酸氢钠溶液处理残余物。
   4. 通过纤维素材质、截留粒径为11 µm的定性滤纸过滤所得固体，并将其溶解于氯仿（50 mL）中。
   5. 用蒸馏水洗涤氯仿溶液（3次，每次15 mL）。用无水硫酸钠干燥有机相。
   6. 使用旋转蒸发仪蒸发溶剂，得到绿色固体。用热正己烷（4 × 10 mL）分步洗涤产物以纯化。
   7. 使用硅胶（35–70目）进行快速柱层析纯化，以正己烷:乙酸乙酯（1:1）为洗脱剂。
5. 薄层色谱法（TLC）
   1. 使用TLC Silica gel 60 F254板通过薄层色谱法（TLC）监测反应进程。
   2. 以起始物料4作为参照物来监测反应并评估其消耗情况。
6. 熔点（m.p.）
   1. 用刮勺尖取少量该化合物加入熔点仪中，记录熔点范围。
   2. 不要对测得的数值进行任何校正。实验需设置三个重复。
7. 高效液相色谱法（HPLC）
   1. 称取1–2 mg化合物6。用乙腈/甲醇（1:1, v/v）配制该化合物的储备液，浓度为1.0 mg/mL。
   2. 将储备液稀释至0.5 mg/mL用于分析。使用配备双泵、自动进样器和紫外检测器的高效液相色谱系统（见材料表）分析样品。
   3. 使用色谱数据采集软件获取和处理数据（参见材料表）。
   4. 设定色谱条件如下：使用反相C18色谱柱，5 µm（250 x 4.6 mm）（见材料表）。流速设为1.5 mL/min，紫外检测波长为254 nm。0至7 min期间，流动相保持为100%水（含0.1%乙酸）；7至15 min期间，采用线性梯度从100%水（含0.1%乙酸）过渡至90%乙腈/甲醇（1:1, v/v）；随后在5 min内返回100%水（含0.1%乙酸），并保持10 min。
8. 核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，¹H, ¹³C)
   1. 称取15–20 mg化合物6至核磁管中。加入DMSO-d₆ 作为溶剂。
   2. 获取 ¹H 和 ¹³使用标准脉冲序列在核磁共振波谱仪上进行碳-13（13C）核磁共振波谱分析（参见材料表）。
   3. 在400 MHz下运行仪器 ¹氢核和100 MHz用于 ¹³C核。使用四甲基硅烷（TMS）作为内标。
   4. 以百万分之一（ppm）表示化学位移（δ）。使用实验获得的FID文件来可视化和处理核磁共振（NMR）数据。
9. 高分辨率质谱法（HRMS）
   1. 称取1–2 mg的化合物6。将样品用MeOH/CH₂Cl₂ 1:1的混合溶剂溶解₃含0.1%甲酸的CN。
   2. 在高分辨率Orbitrap质谱仪（见材料表）上进行分析，该仪器结合了线性离子阱质谱仪与Orbitrap质量分析器。
   3. 采用电喷雾电离（ESI）正离子模式，以10 µL/min的流速通过直接进样方式引入样品。
   4. 使用质谱数据分析软件中的元素组成分析工具确定元素组成（见材料表）。
10. 柱层析 – 化合物4
    1. 使用硅胶60 Å（70–230目，0.063–0.200 mm）制备硅胶柱，适当装填硅胶。
    2. 使用正己烷/乙酸乙酯（7:3，v/v）作为流动相。将粗产物4上样至柱中，洗脱并收集馏分。
    3. 通过薄层色谱监测各馏分，并合并含有纯产物的馏分。
11. 柱层析 – 化合物6
    1. 使用硅胶60 Å（70–230目，0.063–0.200 mm）制备硅胶柱，并用硅胶适当装填柱子。
    2. 使用正己烷/乙酸乙酯（1:1，v/v）作为流动相。将粗品化合物6上样至柱中，洗脱并收集馏分。
    3. 通过薄层色谱监测各馏分，并合并含有纯产物的馏分。

图1。 试剂与条件：i = MgSO₄，AcOH，EtOH，90 °C，16 h；ii = C₁₂H₁₀，C₁₂H₁₀O，230–250 °C，15 min；iii = POCl₃，甲苯，110 °C，2 h；iv = 吡啶，HCl，(CH₃)₂CHOH，85 °C，16 h。请点击此处查看此图的放大版本。

2. 最小抑菌浓度的测定

1. 实验设计与微孔板布局
   1. 采用比色法刃天青还原微孔板检测法（REMA），评估化合物对M. tuberculosis生长的抑制能力，以确定最低抑菌浓度（MIC），方法如前所述^11,12,13。
   2. 每种测试化合物进行三次独立实验（三个生物学重复），不设技术重复（每种化合物占一行，每次实验使用一块微孔板）。
   3. 同时检测作为阳性对照的化合物，以确保实验条件能够支持生长抑制的观察。
   4. 以异烟肼（INH）和利福平（RIF）作为阳性对照进行检测。
   5. 将A行和B行分别分配给对照化合物（分别为INH和RIF）。
   6. 后续行用于测试化合物（见图2中的化合物A至F）。
   7. 在第1至第10列中，对对照和测试化合物进行两倍系列稀释，每种化合物占据一行，高浓度位于第10列，低浓度位于第1列。
   8. 将第11列设为存活率对照，加入培养基和细菌，终浓度为2.5% DMSO，不添加任何对照或测试化合物。
   9. 将第12列设为无菌对照，向不含细菌细胞的培养基中加入对照或测试化合物，浓度为系列稀释中的最高浓度（与第10列相同）。
   10. 参见图2以了解MIC微孔板的代表性布局。
2. 试剂准备
   1. 含油酸、白蛋白、葡萄糖和过氧化氢酶（OADC）的Middlebrook 7H9肉汤的配制
      1. 向含有90 mL超纯水的200 mL玻璃瓶中加入0.47 g 7H9粉末、0.24 mL 85%甘油和0.5 mL 10%吐温-80。
      2. 在121 °C、98.07 kPa条件下高压灭菌10分钟。
      3. 让培养基冷却至手感微温（约45–50 °C）。
      4. 加入10 mL OADC（我们使用市售OADC；详见材料表）。
      5. 4 °C保存。
         注：根据试剂比例，准备实验所需的适当体积。
   2. 含ADC的Middlebrook 7H9肉汤的配制
      1. 向含有90 mL超纯水的200 mL玻璃瓶中加入0.47 g 7H9粉末，在121 °C、98.07 kPa条件下高压灭菌10分钟。
      2. 让培养基冷却至手感微温（约45–50 °C），加入10 mL ADC，4 °C保存。
         注：根据试剂比例，准备实验所需的适当体积。
   3. 化合物储备液的配制
      1. 将每种化合物用DMSO溶解，配制成2 mg/mL的储备液。
      2. –20 °C保存。
         注：实验前应基于溶解度评估确定最高测试浓度。为确定溶解度极限，需目视检查溶液中是否存在晶体。若观察到晶体，将等分试样进一步稀释至前一浓度的一半。此评估应使用5% DMSO进行。
   4. 化合物工作液的配制
      注：工作液应在实验时新鲜配制，将储备液用含10% ADC的7H9肉汤稀释。工作液中DMSO的终浓度应为5%，化合物浓度应为预期最高测试浓度的两倍。值得注意的是，加入菌悬液后总体积加倍，因此细菌在检测过程中接触的DMSO终浓度为2.5%（见第2.3节第2.3.8步）。
      注：本实验室使用的菌株（M. tuberculosis H37Ra、H37Rv及临床分离株）可耐受2.5% DMSO。若使用其他菌株或其他细菌种类，应以DMSO作为测试化合物进行初步MIC实验，以确定不会引起生长抑制的最高DMSO浓度。
   5. 刃天青溶液的配制
      1. 将1 mg刃天青溶于10 mL超纯水中，配制成0.01%刃天青溶液。
      2. 使用0.22 µm滤器对溶液进行除菌。
         注：滤膜除菌的刃天青溶液可在4 °C保存1周¹⁴。但作为标准操作，建议在使用前立即配制。
3. 分枝杆菌的准备
   1. 挑取单个M. tuberculosis菌落，接种至含10 mL 7H9肉汤（添加10% OADC、0.2%甘油和0.05%吐温-80）的50 mL离心管中。
   2. 在37 °C恒定振荡（100 rpm）条件下培养，直至菌液在600 nm处的光密度（OD₆₀₀）达到0.6至0.8（约需3至4周）。
      注意：M. tuberculosis H37Rv被归类为3级风险病原体，可通过空气传播，并可能在人类中引起致命性疾病。所有操作必须在生物安全三级（BSL-3）实验室的认证生物安全柜内进行，并穿戴适当的个人防护装备（PPE）。
   3. 使用无菌玻璃珠（1 mm）涡旋振荡3分钟，使菌液均质化。
   4. 静置15分钟，使菌团沉降。
   5. 测定上清液的OD₆₀₀，并将等分试样储存于−80 °C。
      注：实验时，将菌悬液用新鲜的含10% ADC的7H9肉汤稀释至理论OD₆₀₀为0.006。检测时每孔加入100 µL。
4. 96孔板的准备
   1. 向第12列每孔加入100 µL含10% ADC的7H9肉汤。
   2. 向第11列和第1至第9列每孔加入100 µL含10% ADC（含5% DMSO）的7H9肉汤。
   3. 向第10列每孔加入200 µL化合物溶液（浓度为最高测试浓度的两倍，每种化合物占一行）。
   4. 向第12列每孔加入100 µL化合物溶液。进行两倍系列稀释：从第10列取100 µL转移至第9列，用移液器充分混匀。
   5. 继续从第9列至第1列进行系列稀释，最后从第1列弃去100 µL。
   6. 向第1至第11列每孔加入100 µL菌悬液（理论OD₆₀₀为0.006）。
   7. 盖上盖子，用封口膜密封，37 °C孵育7天。
      注：图2为MIC微孔板的代表性布局。请参考该图理解第2.3.1至2.3.9步的操作。
5. 刃天青的添加与数据分析
   1. 向每孔加入60 µL 0.01%刃天青溶液。盖上盖子，用封口膜密封，37 °C孵育48小时。
   2. 观察颜色变化：由蓝色（抑制生长）变为粉红色（细菌生长）。
      注：某些实验中颜色变化不完全，导致孔呈紫色。此情况应解释为细菌生长。

图 2．用于测定最低抑菌浓度（MIC）的肉汤微量稀释板示意图。待测化合物的倍比连续稀释液分布于第1至第10列，稀释过程从第10列依次进行至第1列，其中第10列化合物浓度最高。A行和B行分别为含有参考药物异烟肼和利福平的阳性对照。C至H行对应待测化合物。第11列为活力对照（含2.5% DMSO和细菌接种物的培养基），第12列为无菌对照（含化合物但无细菌接种物的培养基）。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 哺乳动物细胞系中的细胞毒性评估

注意：所有细胞培养操作均须在经认证的 II 级生物安全柜内的无菌条件下进行。

1. 哺乳动物细胞系的制备
   1. 在杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养人肝癌（HepG2）细胞系和非洲绿猴肾（Vero）细胞系。
   2. 向培养基中添加 1.8 g/L 碳酸氢钠、10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素/链霉素和 0.1% 两性霉素B（统称为完全培养基）。
   3. 将细胞培养物置于含 5% CO₂ 的湿润环境中，于 37 °C 培养。
   4. 使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液处理 5–10 分钟，收集未完全汇合的细胞（70%–80%）。
   5. 加入等体积的完全培养基以中和胰蛋白酶。将细胞悬液转移至 15 mL 圆锥形离心管中，在 200 x g 条件下离心 5 分钟。
   6. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 10 mL 新鲜完全培养基中。
   7. 使用自动细胞计数仪或台盼蓝染色排除法结合血细胞计数板测定细胞浓度和活力。
      注：对于台盼蓝染色排除法，取 10 µL 细胞悬液与 10 µL 0.4% 台盼蓝溶液混合，加载至血细胞计数板（或计数载片）。死亡或膜完整性受损的细胞呈蓝色，而活细胞不着色。活力计算公式为：活力百分比 =（未染色细胞数 / 总细胞数）× 100。仅当细胞活力 ≥ 90% 时方可进行后续接种。
   8. 将细胞悬液稀释至目标接种密度。向 96 孔平底板第 2 至第 12 列的每孔中加入 100 µL 细胞悬液。
      接种密度：Vero 细胞为 4,000 个细胞/孔；HepG2 细胞为 5,000 个细胞/孔。
      注：优化上述密度，以确保细胞在 48 小时检测终点前保持对数生长期，且未达到 100% 汇合。
   9. 向第 1 列各孔加入 100 µL 完全培养基（不含细胞），作为吸光度测定的空白对照。
   10. 为每种细胞系准备四块相同的培养板：两块用于 MTT 检测，两块用于 NRU 检测。
   11. 将培养板在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 24 小时，以促进细胞贴壁。
2. 化合物稀释与细胞处理
   1. 使用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）或合适的溶剂（如二甲基亚砜；DMSO）配制各测试化合物的储备液。
      注：在检测前需确认化合物在细胞培养基中可溶，且溶剂浓度无细胞毒性（例如，DMSO 的终浓度 <0.1% v/v）。
   2. 设计板图，包含空白孔、适当对照组和技术重复孔。用于在 8 个浓度下测试最多 9 种化合物的代表性板图见图3。
   3. 在完全培养基中对测试化合物进行系列稀释，覆盖目标浓度范围。确保所配体积足以满足所有重复板的需求。
      注：若使用溶剂（如 DMSO），需在稀释液中补充相应溶剂，使整个系列稀释过程中终溶剂浓度保持一致。
      注：溶剂处理孔（载体对照）作为功能性阴性对照，定义为 100% 细胞活力，用于归一化化合物处理孔的数据。为验证检测有效性，应加入已知可导致完全细胞死亡（0% 活力）的细胞毒性参考化合物（如 0.1% Triton X-100 或 1 mM 十二烷基硫酸钠）。这些阳性对照孔的吸光度值应与空白孔无显著差异，以确认其为 0% 活力。
   4. 在 24 小时细胞贴壁期后，使用倒置显微镜目视检查培养板，确认细胞已贴附、铺展，并均匀覆盖约 70%–80% 的孔底表面。弃去出现污染或贴壁不足的培养板。
   5. 使用移液枪头小心吸除培养基，枪头倾斜靠在孔壁一侧，避免破坏细胞单层。分区域处理培养板，防止干燥。
   6. 立即向相应孔中加入 100 µL 合适的测试化合物稀释液或对照培养基。
   7. 将处理后的培养板在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 48 小时。
3. MTT 检测方案
   1. 在无血清 DMEM 中配制 0.5 mg/mL 的 MTT 溶液，经 0.22 µm 注射式滤器过滤，并避光保存。
   2. 在 48 小时处理结束后，目视检查细胞，确认预期的处理效应。
   3. 小心吸除 MTT 检测板中的培养基，向每孔加入 50 µL 0.5 mg/mL MTT 工作液。
   4. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下避光孵育 3 小时。
      注：虽然通常孵育时间为 2–4 小时，但 Vero 和 HepG2 细胞通常 3 小时已足够。必要时可进行优化。
   5. 向每孔加入 100 µL 100% DMSO 以溶解甲臜晶体。将培养板置于摇床上，100 rpm 震荡 15 分钟，避光操作。检查对照孔，确保晶体完全溶解。使用酶标仪在 570 nm 波长读取吸光度。如有条件，设定参考波长为 630–690 nm。
4. 中性红摄取（NRU）检测方案
   1. 在无血清 DMEM 中配制 40 µg/mL 中性红（NR）溶液并过滤。配制 NR 脱吸附溶液：1%（v/v）冰醋酸、49%（v/v）乙醇和 50%（v/v）超纯水。
      警告：冰醋酸具有腐蚀性，应在通风橱中操作。
   2. 在 48 小时处理结束后，目视检查细胞状态。小心吸除 NRU 检测板中的培养基。
   3. 向每孔加入 100 µL 40 µg/mL NR 工作液，在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 2 小时。
      注：2 小时孵育时间足以使这些细胞系达到最大染料摄取量。
   4. 吸除 NR 工作液，用 150 µL 无菌 PBS 轻柔冲洗每孔一次。
   5. 向每孔加入 150 µL NR 脱吸附溶液，置于摇床上以 150 rpm 震荡 15 分钟以提取染料。
   6. 检查对照孔，确保染料完全提取。使用酶标仪在 540 nm 波长读取吸光度。
5. 数据分析
   1. 通过计算空白列的平均吸光度值，并从所有孔中减去该值，进行背景校正。
   2. 通过比较溶剂对照孔与未处理对照孔的吸光度值，检查溶剂毒性。若细胞活力低于预设阈值（如 80%），则提示存在溶剂细胞毒性。
   3. 相对于溶剂对照孔计算细胞活力百分比：
      % 活力 =（处理孔吸光度 / 溶剂对照孔平均吸光度）× 100。
   4. 以化合物浓度的 log₁₀ 值为横坐标（x 轴），% 活力为纵坐标（y 轴）作图。采用非线性回归模型（S 形剂量-反应曲线，可变斜率）确定 CC₅₀ 值。
   5. 通过将 CC₅₀ 除以 MIC 计算选择性指数（SI）。

图3． MTT/NRU细胞活力检测用于早期筛选最多9种化合物细胞毒性的微孔板设计示例。（A）微孔板设计示意图。第1列为“空白”组，不接种细胞，仅加入DPBS或完全培养基。第2列和第12列接种细胞，分别加入完全培养基（“未处理对照”）或含溶剂的完全培养基（“溶剂对照”）。第3至11列接种细胞，并加入待测化合物的系列稀释液，最多可检测9种化合物，每种化合物每个浓度设一个重复。（B） Vero细胞NRU检测板（上方）和Vero细胞MTT检测板（下方）在经48小时处理并完成最终检测步骤后的代表性照片。请点击此处查看该图的高清版本。

结果

合成反应得到目标化合物6，为浅绿色固体（0.53 g，产率67%）。该化合物熔点为227–229 °C，UHPLC纯度为99%（t_R = 14.11 min）（图4）。通过核磁共振（NMR）波谱法和高分辨质谱（HRMS）确认了其化学结构。¹H NMR谱图（图5）显示，哌啶片段的信号出现在1.50–3.13 ppm之间。2位甲基在2.38 ppm处呈现典型的单峰。3位氢原子在6.56 ppm处表现为单峰。苯环在6.97 ppm和7.17 ppm处显示两个二重峰，耦合常数为8.9 Hz。7位和8位氢原子在7.63–7.75 ppm范围内产生多重峰，而喹啉核心5位氢原子在8.59 ppm处呈现二重峰（J = 2.0 Hz）。氨基氢原子在8.66 ppm处观察到单峰。¹³C NMR谱图（图6）在23.81 ppm处出现归属于2位甲基的信号，24.85–49.70 ppm之间的信号对应于哌啶片段。3位碳原子出现在100.52 ppm。其余去屏蔽区信号归属于喹啉核心和苯环上的碳原子。HRMS确认了化合物6的分子式，测得[M+H]⁺离子的m/z为396.1063（C₂₁H₂₃BrN₃的计算值：396.1070）。

图 4. 化合物 6 的高效液相色谱图及紫外吸收光谱。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5。 化合物6的¹H NMR（400 MHz，DMSO-d6）谱图。请点击此处查看此图的放大版本。

图6。 化合物6的¹³C NMR（101 MHz，DMSO-d6）谱图。请点击此处查看此图的放大版本。

通过测定最低抑菌浓度（MIC）来评估该化合物对M. tuberculosis的抑制活性，MIC定义为能够完全抑制细菌可见生长的最低化合物浓度。在REMA实验中，颜色无变化（保持蓝色）表明细菌生长被抑制，而颜色变为粉红色则表明细菌发生生长。异烟肼（INH）和利福平（RIF）作为药物对照。结果如图7所示。每块板均包含一个生长对照（第11列，不含药物）和一个无菌对照（第12列，不含分枝杆菌）。化合物从第10列（最高浓度）至第1列（最低浓度）进行倍比稀释。如图7所示，A行（异烟肼）化合物的MIC值出现在第4列，而B行（利福平）和C行（合成化合物）化合物的MIC值均出现在第5列。在本实验条件下，INH对H37Rv菌株的MIC为0.31 µg/mL，对H37Ra菌株为0.16 µg/mL；RIF对H37Rv菌株的MIC为0.08 µg/mL，对H37Ra菌株为0.01 µg/mL。

图7．采用刃天青微量滴定板法（REMA）测定结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的最低抑菌浓度（MIC）。A–C行，1–10列：异烟肼（A行）、利福平（B行）及合成化合物（C行）的两倍系列稀释液。第11列：存活率对照（含2.5% DMSO + 细菌的培养基）。第12列：无菌对照（培养基 + 化合物）。蓝色表示细菌生长被抑制，粉红色表示细菌具有活性，原因是刃天青被还原为试卤灵。 请点击此处查看该图的放大版本。

Vero细胞的NRU（上图）和MTT（下图）实验的代表性96孔板如图所示 图3B在MTT平板中，可观察到明显的颜色梯度变化，从高浓度化合物处的透明（无活细胞）逐渐变为低浓度处的深紫色（细胞活力高）。类似地，NRU平板显示出从透明到深粉色的梯度变化，表明中性红染料被活细胞的溶酶体所摄取。

显微镜观察可在孵育48小时后直观确认实验状态（图8）。图8A比较了健康未处理的对照细胞（Vero和HepG2）与经细胞毒性浓度化合物处理的细胞。处理后的细胞呈现圆形、脱落且无活性的形态。图8B在最终溶解步骤前提供了关键的视觉质控点，显示了两种细胞中活细胞内预期形成的深紫色甲臜晶体（MTT实验），以及溶酶体内红色染料的积累（NRU实验）。

原始吸光度数据经溶剂对照归一化后，通过非线性回归分析生成剂量-反应曲线，具体步骤详见方案3.5。对于目标化合物6（源自LABIO-17），在NRU实验中，其在Vero细胞中的CC₅₀为12.2 µM，在HepG2细胞中为18.3 µM；在MTT实验中，两种细胞系的CC₅₀均>20 µM。由此得到的选择性指数（SI）范围为30.5至>50，与先前报道结果一致¹⁰。

图8． Vero和HepG2细胞的细胞毒性检测代表性显微镜图像。所有图像均在100倍放大下拍摄。（A）处理48小时后细胞形态的比较。Vero细胞（上图）和HepG2细胞（下图）的未处理对照孔显示健康、融合的单层细胞。相比之下，经细胞毒性浓度化合物处理的细胞呈现圆形、皱缩，并从培养板表面脱落。（B）试剂添加后、溶解前的关键视觉检查点。在MTT检测中（每种细胞系的左侧面板），活细胞内可见深紫色的甲臜晶体。在NRU检测中（每种细胞系的右侧面板），活细胞中完整的溶酶体内有红色染料的积累。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

一种 表型筛选 方法，依赖于全细胞活性而非分离的酶，是鉴定抗M. tuberculosis活性化合物的有效策略。本文描述了该方法的初始步骤，包括候选化合物的化学合成、通过最低抑菌浓度（MIC）测定评估其抑制活性，以及利用MTT和NRU实验在哺乳动物细胞（Vero和HepG2）中评估其细胞毒性。

合成路线包含三个主要步骤（图1），通过操作简便的转化反应，可获得高纯度的目标化合物。已确定若干关键步骤对反应的可重复性和效率具有决定性作用。初始缩合反应需要精确的化学计量控制和持续回流，以确保中间体完全生成。在热环化反应前若溶剂去除不完全，可能对环合效率产生不利影响。环化步骤本身需要严格控制温度，因为加热不足会导致芳构化不完全，而过度或长时间加热则可能促进副产物的生成。在氯化过程中，建议严格控制反应温度并缓慢加入三氯氧磷，以尽量减少副反应并确保在4位点的选择性活化。在方法优化过程中，微小的实验操作调整提高了方法的稳健性。若环化后出现沉淀不完全的情况，采用逐步冷却而非快速淬灭可提高固体产物的回收率。若亲核取代步骤中观察到产率降低，延长反应时间或验证胺的纯度均被证明有益。

该方法的主要局限性在于需要高温环化以及使用三氯氧磷等腐蚀性氯化试剂，因而对实验室基础设施和安全防护有特定要求。取代基的电子效应可能需要针对不同的苯胺或胺类化合物重新优化反应条件，从而限制了在不进行调整的情况下实现广泛骨架多样化的能力。然而，与使用强氧化剂的Skraup类合成法或依赖过渡金属催化的反应（需专用催化剂和惰性气氛）相比，Conrad–Limpach方法在操作上更为简便。这种无金属策略能够高效地生成适用于药物化学的官能团化喹啉中间体。

用于测定 MIC 的方案是一种依赖目视检查的比色法。该方法可能存在的一个挑战是颜色变化不完全，导致孔中呈现紫色，而非明确的蓝色（抑制）或粉色（生长）。若出现此情况，应解释为未能抑制分枝杆菌的生长。此外，由于化合物通过连续稀释进行评估，最高可测试浓度受限于化合物的溶解度。因此，在某些情况下，若在最高可溶浓度下未观察到抑制作用，则结果可能无法得出明确结论。另外，需要认识到其他实验室可能会根据其特定条件对方案中的某些步骤进行调整，这可能导致所得结果存在差异。为了提高通量，该方案可进行自动化改造。采用液体处理系统进行 96 孔板的制备将减少移液误差，从而提高准确性和可重复性。

细胞毒性评价方案采用两种不同的哺乳动物细胞系（Vero 和 HepG2）以及两种互补的活力检测方法（MTT 和 NRU）。该方案中的多个步骤对于确保数据的可重复性和准确性至关重要，各实验室应自行进行验证。例如，初始细胞接种密度必须仔细优化，因为细胞过度融合可能导致接触抑制和代谢状态改变，从而干扰实验结果；而接种密度过低则可能使细胞更容易受到轻微损伤的影响，导致毒性被高估¹⁵。此外，最高测试浓度通常受限于化合物的溶解度，沉淀的产生可能导致结果不准确。同时，建议的板式布局（图 3A）适用于初筛，通过省略技术重复并忽略边缘效应，以增加可检测化合物的数量，后续则通过独立的生物学重复进行验证。

本方案的一个关键优势在于同时平行实施 MTT 和 NRU 两种检测方法。尽管这两种方法均已得到广泛认可，但它们测量的是不同的细胞参数。MTT 检测通过定量线粒体脱氢酶的代谢活性来反映细胞活力，通常与细胞存活率相关¹⁶。然而，该检测易受到具有还原性或氧化性化合物的干扰，或受干扰线粒体呼吸过程的物质影响，可能导致假阳性或假阴性结果¹⁵。平行进行 NRU 检测有助于识别和排除此类干扰因素。NRU 检测评估的是活细胞维持溶酶体完整性和染料摄取所需 pH 梯度的能力¹⁷。MTT 与 NRU 结果之间的差异可揭示特定的毒性机制，例如线粒体功能障碍，提示需要进一步研究。

总之，本方案概述了鉴定潜在抗结核药物候选物的基本步骤。对于表现出良好选择性和效力的化合物，可进一步推进至更复杂的感染模型，例如 在体 研究。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞系
HepG2（人肝细胞癌）	ATCC	HB-8065	人肝癌细胞系
结核分枝杆菌 H37Ra	ATCC	25177
结核分枝杆菌 H37Rv	ATCC	27294
Vero（非洲绿猴肾）	ATCC	CCL-81	灵长类动物肾上皮细胞系
化学品 – 合成
4-(哌啶-1-基)苯胺	Sigma-Aldrich	TCI：P0887	化合物5/6的胺类前体
4-溴苯胺	Sigma-Aldrich	108-67-8	喹啉合成的起始原料
乙酸（冰醋酸）	Sigma-Aldrich	695092	合成与流动相制备中的试剂
乙腈（HPLC 级）	Sigma-Aldrich	34967	高效液相色谱流动相组分及核磁共振溶剂
氯仿	Sigma-Aldrich	C2432	产品提取用溶剂
DMSO-d6（氘代）	Sigma-Aldrich	175641	核磁共振溶剂
Dowtherm A（传热流体）	Sigma-Aldrich / Solutia	待定	用于热环化的高沸点溶剂（230–250 °C）；曾用名Dowtherm® A
乙醇（纯）	Sigma-Aldrich	459836	康拉德反应溶剂–林帕赫步法
乙酸乙酯（HPLC 级）	Sigma-Aldrich	270989	柱洗脱液组分
乙酰乙酸乙酯	Sigma-Aldrich	E12806	β用于喹啉环形成的β-酮酯试剂
甲酸（HPLC 级）	Sigma-Aldrich	F0507	高效液相色谱和高分辨质谱流动相中0.1%的添加剂
玻璃珠（1 mm，无菌）	Sigma-Aldrich	G8772	用于结核分枝杆菌培养物的匀浆处理
HCl（盐酸，37%）	Sigma-Aldrich	320331	亲核取代反应中的酸催化剂
正己烷（HPLC 级）	Sigma-Aldrich	34859	柱层析用非极性洗脱剂
异丙醇	Sigma-Aldrich	278475	合成化合物6的反应溶剂
硫酸镁（MgSO4，无水）	Sigma-Aldrich	M7506	干燥剂和反应催化剂
甲醇（HPLC 级）	Sigma-Aldrich	34860	高效液相色谱流动相及核磁共振溶剂组分
三氯氧磷（POCl₃）	Sigma-Aldrich	201170	中间体4的氯化试剂
吡啶	Sigma-Aldrich	270970	亲核取代反应中的碱性催化剂
硅胶（35–用于快速柱层析的70目筛	Macherey-Nagel	815349	快速色谱步骤中的固定相
硅胶 60 Å (70–230目）用于柱层析	Macherey-Nagel	815381	柱层析固定相
硫酸钠（Na2SO4，无水）	Sigma-Aldrich	239313	有机相干燥剂
TLC 硅胶 60 F254 板	默克	1.05554	薄层色谱监测
甲苯	Sigma-Aldrich	244511	氯化步骤用溶剂
超纯水	Millipore / 等效产品	N/A	用于流动相配制；此前在文中称为 Milli-Q 水
仪器设备 &和仪器
0.22 µm 注射器滤器	默克密理博 / 任意	SLGP033RS	刃天青溶液的灭菌（2.1.4）；MTT工作液的过滤（3.3）；中性红工作液的过滤（3.4）
0.45 µm 注射器滤器	默克密理博 / 任意	SLHA033SS	流动相溶液的过滤
15 mL 圆锥形管（无菌）	Falcon / 任意	352097 或同等产品	胰酶消化后细胞悬液的收集与离心
96孔板（平底，组织培养处理）	康宁 / 任意	3596	用于细胞毒性和最小抑菌浓度（MIC）测定
铝箔	任何	—	MTT 和 NRU 孵育及振荡步骤中对培养板的避光保护
高压灭菌	任何	—	培养基灭菌（121 °C，98.07 kPa，10 min
生物安全柜（II级，经认证）	任何（BSL-3 认证的）	—	结核分枝杆菌操作所需（生物安全等级3级）
细胞计数仪（自动）或血细胞计数板	例如，Bio-Rad TC20 / 计数板	待定	用于细胞浓度与活力测定
离心机（可达到 200 × g)	任何	—	细胞沉淀步骤
CO2 培养箱（37 °C，5% CO₂，湿润环境）	任何	—	细胞培养与处理孵育
加热套	Fisotom	12M	带道和油（Dowtherm）的温控加热套® A
高效液相色谱系统（Dionex UltiMate 3000）	赛默飞世尔科技	5035.9200	双泵，自动进样器，紫外检测器；用于化合物6的纯度分析
倒置显微镜（或同等设备）	任何	—	在细胞贴壁时（3.2）、处理过程中的检查点（3.3、3.4）以及检测状态确认时进行细胞的目视观察
磁力搅拌器/加热板	任何	—	溶液配制与反应混合
质谱仪（LTQ Orbitrap Discovery）	赛默飞世尔科技	—	高分辨率轨道阱质谱仪与LTQ XL联用；用于化合物6的高分辨质谱分析
熔点测定仪	任意（例如 Stuart SMP10）	—	化合物6的熔点测定
酶标仪（吸光度）	任意（例如 BioTek Epoch）	—	在570 nm（MTT法）和540 nm（NRU法）处读取吸光度
核磁共振波谱仪（Avance III HD，400 MHz）	布鲁克公司	N/A	1H 和 13C NMR 数据采集；位于 PUCRS 设施
轨道摇床	任何	—	100 转/分钟（MTT 晶体溶解）；150 转/分钟（NRU 提取）
Parafilm M	Bemis / Sigma-Aldrich	P7793	孵育过程中96孔板的密封
定性滤纸	联合国驻黎巴嫩临时部队	50,11,250	沃特曼滤纸等级，纤维素；11 µm 保留；约 80 g/m²
反相C18 HPLC色谱柱（250 × 4.6 毫米，5 µm)	Macherey-Nagel（Nucleodur C18）	760201.46	用于高效液相色谱纯度分析的分析柱
旋转蒸发仪	IKA	—	减压下蒸发溶剂
超声波清洗机	布拉松	Model 2510	用于溶液脱气的超声波清洗槽
涡旋混合器	任何	—	使用玻璃珠均质化细菌培养物
培养基 &和补充剂
ADC（白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶）增菌液	BD 生物科学	212352	7H9肉汤培养基10%补充剂（检测孔）
两性霉素B溶液（250 µg/mL	Gibco/Thermo Fisher	15290026	完全培养基中的抗真菌添加剂，0.1%
DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）低糖	Gibco/Thermo Fisher	31600034	HepG2 和 Vero 细胞的基础培养基
FBS（胎牛血清）	Gibco/Thermo Fisher	12657029	完全培养基中10%的添加剂
Middlebrook 7H9 肉汤粉末	BD 生物科学	271310	结核分枝杆菌培养的基础培养基
OADC（油酸-白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶）增菌液	BD 生物科学	212240	7H9肉汤（培养）用10%添加剂
青霉素/链霉素溶液（10,000 U/mL）	Gibco/Thermo Fisher	15140122	完全培养基中1%
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S5761	DMEM 中每升添加 1.8 克的补充剂；也用于 NaHCO3 饱和溶液
0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液	Gibco/Thermo Fisher	25200072	用于细胞从培养瓶中脱离
Tween-80（聚山梨酯80），10% 溶液	Sigma-Aldrich	P4780	7H9-OADC 肉汤中 0.05% 的补充剂
试剂 &和检测组分
DMSO（二甲基亚砜）	Sigma-Aldrich	D8418	化合物储备液溶剂
DPBS（Dulbecco 磷酸盐缓冲液）	Gibco/Thermo Fisher	D565210X1L	用于NRU实验中的化合物稀释（3.2）和PBS洗涤（3.4）
MTT（3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴盐）	Sigma-Aldrich	M2128	MTT实验用细胞活力检测试剂
中性红（NR）染料	Sigma-Aldrich	N2889	NRU实验用细胞活力试剂
刃天青钠盐	Sigma-Aldrich	R7017	REMA实验比色指示剂
0.4% 台盼蓝溶液	Gibco/Thermo Fisher	15250061	通过排除法测定细胞活力
软件
Chromeleon 6.80 SR11（色谱数据采集）	赛默飞世尔科技	Build 3160 (183147)	高效液相色谱数据采集与处理
Xcalibur 2.0.7（质谱数据分析）	赛默飞世尔科技	发布版本 2.0.7	元素组成测定（Qual Browser 模块）