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使用 FlyTrDT 流程对果蝇运动健康寿命与寿命分析进行半自动化整合 黑腹果蝇

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DOI：

10.3791/70697

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2026年10月30日

 ,  ,  ,  , 
1Amrita School of Biotechnology, Amrita Vishwa Vidyapeetham, Amrita University campus

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

Drosophila melanogaster 是研究衰老的有力模式生物。本方案详细介绍了进行可重复的、基于群体的寿命和功能性健康寿命测量所需的步骤。

摘要

衰老的特征是生理功能进行性衰退和寿命缩短；在实验研究中，这两个参数通常被独立评估。Drosophila melanogaster 中，寿命测定和基于负向趋地性的运动能力检测常用于研究衰老和神经退行性病变。然而，目前尚缺乏将早期运动功能与长期存活率进行定量整合的标准化框架。本文介绍了一种可重复、半自动化的实验流程，将寿命分析与对果蝇运动健康寿命的客观量化相结合。

该方案整合了可控的果蝇饲养条件、死亡率记录以及基于标准化MP4视频（最低分辨率为1280 × 720，30帧/秒）的负向趋地性行为检测。运动功能通过基于Python 3.12.1开发的自定义分析流程进行量化，该流程使用OpenCV 4.9.0、NumPy 1.26.4、Pandas 2.2.0和Matplotlib 3.5.2实现，采用逐帧质心检测方法，并提取主动攀爬斜率（像素/秒）作为运动功能的连续性指标。生存轨迹通过计算生存比例并采用梯形数值积分法获得生存曲线下面积（AUC）进行分析。通过对早期运动功能进行归一化处理，可实现功能衰退与总体寿命之间的直接比较。

通过比较半自动化的攀爬斜度测量与对照组及淀粉样蛋白病变模型中传统的手动终点评分，对工作流程进行了评估β表达该基因的果蝇中，两种方法均检测到随年龄增长而出现的运动能力下降。代表性数据集显示，Canton S对照组具有可重复的寿命轨迹，而神经退行性模型则表现出可测量的早期运动功能障碍。该方法可最大限度地减少观察者偏差，提高实验可重复性，并且兼容低成本视频采集系统。该工作流程可轻松适用于遗传模型、药理学干预及神经退行性研究范式，为整合性衰老表型分析提供一个可扩展的平台 果蝇.

引言

衰老的特征不仅包括寿命缩短，还包括生理功能和行为功能的进行性衰退1在神经退行性疾病中，运动协调能力的早期损害常发生在明显死亡率出现之前，并反映了潜在的神经元功能障碍2,3果蝇 Drosophila melanogasterr 因其短寿命、易于进行遗传操作以及成熟的行為检测方法，已成为研究衰老和神经退行性疾病的强大模型系统4. 寿命分析在 果蝇 可对生物体存活率提供可靠的评估，而负向趋地性实验则广泛用于评估运动功能及与年龄相关的运动能力衰退5,6然而，这两个指标通常被独立分析，限制了将早期功能损伤与长期生存轨迹进行定量关联的能力。对运动健康寿命与寿命进行整合分析，有助于揭示干预措施是否影响衰老速率、疾病进展或特定生理系统。该方法特别适用于那些早期运动功能障碍先于显著死亡率出现的遗传学、药理学及神经退行性疾病模型，可在生存差异显现之前敏感地检测出功能衰退。

传统的负向趋地性实验依赖于基于终点的评分方法，例如在固定时间间隔内达到特定高度的果蝇比例。尽管这种方法简单且成本低廉，但人工评分可能引入观察者偏差，并可能忽略运动动力学中的细微差异。与传统的基于终点的评分方法相比，基于连续轨迹的测量可能提高对细微运动功能障碍的检测敏感性。类似地，寿命实验需要严格记录死亡率并进行环境标准化，以确保结果的可重复性7。目前仍需要一种可及且可重复的方法，能够在同一实验群体中将功能性健康寿命指标与生存数据相结合。

本文介绍了一种半自动化的实验流程，该流程结合了标准化的寿命分析与基于视频的老年果蝇运动能力定量评估。利用开源计算工具，通过逐帧质心检测提取爬行斜率（像素/秒）作为运动功能的连续性指标。生存数据通过计算生存比例并进行梯形数值积分，获得生存曲线下面积（AUC）。通过标准化早期运动表现，并将其与生存AUC整合，本方案可实现功能衰退与整体寿命之间的直接比较。该方法为关联运动健康寿命与寿命结局提供了客观且经济高效的分析框架，能够对果蝇衰老轨迹进行全面的表型分析（图1）。

方案

所有实验均使用黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）进行，并遵循机构实验室 指南。由于本研究涉及无脊椎动物，无需伦理审批。所有操作均应遵循机构关于无脊椎动物研究的动物护理指南。

注意：实验用食物应储存在 4 °C 环境中，并在保持干燥的前提下于 1 周内使用。将果蝇置于 25 °C、12 小时光照与 12 小时黑暗循环、相对湿度约为 60% 的条件下培养，以维持标准的环境条件。

1. 标准果蝇培养基的制备

  1. 基础食物制备
    1. 在一个含有 100 mL 蒸馏水的容器中加入 6 g 玉米淀粉、5 g 酵母、4 g D-葡萄糖、3 g 蔗糖、1 g 酵母提取物、1 g 琼脂和 0.25 g 麦芽提取物。
    2. 使用刮刀充分搅拌内容物，直至形成均匀的悬浮液。
    3. 当制备体积 ≥500 mL 时，在电磁炉上将混合物加热至约 85–100 °C，持续 12–15 分钟；当制备体积为 100–400 mL 时，加热 5–10 分钟。加热过程中持续搅拌。
    4. 按照标准实验室灭菌程序对加热后的混合物进行高压灭菌。
    5. 让灭菌后的培养基冷却，使用温度计监测温度，直至降至 50–55 °C。
    6. 向冷却后的培养基中加入 600 µL 丙酸和 100 mg 苯甲酸溶于 1 mL 100% 乙醇中的溶液，并充分混合。
    7. 注意：丙酸和乙醇具有挥发性，吸入或接触皮肤可能引起刺激，操作时应在通风良好的区域并佩戴手套和护目镜。
    8. 将 5 mL 食物分装至每个尺寸为长 10 cm、直径 20 mm 的无菌小瓶中。
    9. 将小瓶在室温下敞口放置至少 5–6 小时，并用纸巾覆盖以防止外来果蝇进入。此步骤可减少因培养基制备和储存条件差异导致的寿命测量变异。
  2. 含药食物制备
    1. 按照步骤 1.1.1–1.1.5 所述方法制备少量成虫食物。
    2. 让食物冷却至 50–55 °C。
    3. 使用适当的溶剂（如蒸馏水或二甲基亚砜（DMSO））配制所需浓度的待测化合物储备液。将待测化合物溶解于选定溶剂中制成高浓度储备液，并将其加入已冷却的食物（50–55 °C）中，以达到所需的最终浓度，同时确保处理组与对照组之间的溶剂浓度一致。
    4. 充分混合以确保分布均匀。
    5. 将含药物的食物 2 mL 分层加至实验小瓶中已预先凝固的基础食物表面。
    6. 通过向基础食物表面添加等体积的溶剂（如蒸馏水或 DMSO，浓度与处理组最终浓度相同）制备对照小瓶。
    7. 待分层食物在室温下完全凝固后，再引入果蝇。
      注：食物处理与储存：若在晚间制备食物，可将小瓶用纸巾覆盖后在室温下过夜，并于次日早晨插入棉塞。使用前务必清洗、去污并高压灭菌小瓶。棉卷应单独高压灭菌后再用于封口。仅在食物完全凝固至少 5–6 小时后方可插入棉塞。

2. 表达淀粉样蛋白-β的D. melanogaster

  1. 处女雌性果蝇的收集与鉴定
    1. 保持驱动果蝇品系 25 °C 在12小时光照：12小时黑暗循环条件下饲养，然后收集未交配雌蝇。
    2. 每天两次收集驱动品系中新羽化的雌蝇，分别在上午和下午晚些时候进行，使用短暂的二氧化碳麻醉。
    3. 将收集的雌性果蝇在采集后立即转移至新鲜的单性培养瓶中，以防止交配。
    4. 将小瓶在指定条件下孵育 25 °C 再孵育48小时以进行初孵验证。
    5. 每天检查小瓶，观察是否有幼虫存在。
    6. 通过确认无卵或幼虫后代来验证处女状态。
    7. 仅保留未表现出产幼虫迹象的雌性个体，用于遗传杂交实验。
  2. 遗传杂交实验设置
    1. 使用短暂的二氧化碳麻醉法，在设置杂交的当天收集新羽化的 UAS-APPE693G 雄成虫。
    2. 将20只处女elav-GAL4雌蝇与10只UAS-APPE693G雄蝇放入新鲜培养管中进行杂交。
    3. 将交叉小瓶在指定条件下孵育 25 °C 在受控湿度及12小时光照-12小时黑暗循环条件下。
    4. 让果蝇交配并产卵48小时。
    5. 如果需要更多子代，可将成虫转移至新的培养管中。
    6. 产卵后移除亲代果蝇，以防止过度拥挤和世代重叠。
    7. 在标准条件下培养后代直至羽化为成虫。
    8. 使用表达淀粉样蛋白的F1代成年果蝇β 用于后续的寿命和健康寿命实验的神经元。
      注意：elav-GAL4 驱动子可在标准培养条件下实现人源淀粉样前体蛋白（携带 E693G 北极突变）的全神经元表达，该表达贯穿发育期与成年期。进行衰老实验时，应使用一致的遗传背景并设置适当的对照组。每个实验组内需保持恒定的温度条件
      实验。较低的孵育温度，例如 18 °C可在发育过程中用于
      在成年之前延缓转基因相关病理的发生。

3. 果蝇采集

  1.  负向趋地性实验的果蝇收集
    1. 在实验设置前，将所有果蝇品系维持在标准果蝇培养基上，培养条件为25 °C、相对湿度约60%、12小时光照/12小时黑暗循环。
    2. 使用短暂的二氧化碳麻醉，在成虫羽化后2–3天内收集新生的雄性果蝇。
    3. 根据实验条件，将雄性果蝇转移至含有药物的培养管或对照培养管中。
    4. 每3天更换一次食物，若食物质量下降则需提前更换。
    5. 在此条件下维持果蝇培养，直至达到负向趋地性评估的指定年龄。
      注意：仅使用雄性果蝇进行负向趋地性实验，以避免因性别特异性差异在运动能力及衰老过程中带来的变异性。
  2. 寿命实验的果蝇收集
    1. 将少量果蝇短暂置于麻醉垫上进行麻醉。
    2. 使用软毛画笔识别雄性果蝇。
    3. 在分选过程中尽量减少二氧化碳暴露，以防止可能干扰寿命测量的持久生理效应。
    4. 根据实验设计，将10只雄性果蝇和10只雌性果蝇（按1:1性别比例）放入每支新鲜培养管中。
    5. 每批次的分选和分装应在3–4分钟内完成。
    6. 确保总麻醉时间不超过9–10分钟。
    7. 警告：使用二氧化碳麻醉时应配备适当的调节装置和充足的实验室通风，以最大限度减少操作人员暴露，并防止果蝇因长时间麻醉而产生生理应激。
    8. 重复步骤3.2.1–3.2.6，直至每个实验条件建立4–6个重复培养管。

4. 寿命实验

  1. 果蝇转移与维持
    1. 在标准条件下饲养果蝇。
    2. 定期将果蝇转移到新鲜食物小瓶中，以防止过度拥挤、幼虫污染和食物降解。
    3. 每3天将果蝇转移至新鲜食物中一次。
    4. 采用此转移频率，通过防止小瓶内幼虫生长，以最小化对摄食条件的干扰。
    5. 所有转移操作均无需麻醉。
      注意：在寿命实验中应避免使用麻醉，因其可能引发急性死亡，尤其是在老年果蝇中。
  2. 转移过程中的死亡率评估
    1. 在每次转移时记录群体的年龄（以天为单位）。
    2. 仔细检查旧的小瓶。
    3. 计数并记录残留在旧小瓶中的死亡果蝇数量。
    4. 计数并记录被带入新小瓶中的死亡果蝇数量。
    5. 将这两项数值分别记录，以避免重复计数。
    6. 使用以下公式计算每次转移的总死亡数：
      总死亡数 = 旧小瓶中的死亡果蝇数 + 被带入新小瓶的死亡果蝇数。
    7. 通过从本次转移的总死亡数中减去上一次转移时记录为“被带入”的果蝇数量，确定自上次转移以来新增的死亡果蝇数。
    8. 使用此计算方法确保在小瓶间被转移的果蝇不会被多次计数。
  3. 存活但无活动果蝇的识别
    1. 当老年果蝇表现不动或仰卧时，在判定其死亡前应轻轻敲击小瓶侧面。
    2. 观察是否有任何运动发生。
    3. 若果蝇在刺激后出现运动，则视为存活。
    4. 不得将刺激后出现运动的果蝇记录为死亡。
    5. 轻轻敲击小瓶，使附着在旧小瓶食物表面的存活果蝇脱落。
    6. 将脱落的存活果蝇转移至新小瓶中。
    7. 不得将脱落的存活果蝇记为死亡。
      注意：在生命晚期阶段，准确区分死亡与无活动状态的果蝇至关重要。在判定死亡前，应始终进行轻柔的机械刺激。
  4. 删失标准
    1. 若果蝇因从小瓶逃逸、意外受伤或操作问题而在自然死亡前退出实验，则视为右删失。
    2. 在果蝇退出实验的当天，在单独的列中记录删失果蝇。
    3. 不得将删失果蝇记录为死亡。
    4. 在生存分析中，删失果蝇不计入死亡数。
    5. 应保守使用删失处理，因为过度删失可能引入实验偏差。
      注意：在数据录入过程中将“死亡”与“被带入”的果蝇分开记录，可防止死亡数被高估，并确保生存曲线的正确重建。
  5. 实验的持续进行
    1. 在整个实验过程中重复步骤4.1–4.4。
    2. 持续进行实验，直至最后一只存活果蝇死亡。

5. 负向重力性实验

  1. 果蝇准备
    1. 从实验用培养管中收集果蝇，避免使用 CO₂ 麻醉。
    2. 使用小漏斗将果蝇轻柔转移至洁净的攀爬管或负趋地性实验管中，防止逃逸。
    3. 让果蝇在测试装置中适应环境 5 分钟，再开始实验。
    4. 所有攀爬实验应在每天的同一时间进行（例如下午），以减少昼夜节律带来的变异性。
      注意：测试过程中应避免直射阳光，光照强度可能影响果蝇的运动行为。
  2. 攀爬管设置
    1. 使用一个透明圆柱形攀爬管，高度为 12 cm，直径为 2 cm。
    2. 在距管底 10 cm 处标记一条水平线。
    3. 将攀爬管垂直置于均匀的白色背景前，便于视频追踪。
    4. 将智能手机或数码相机固定在稳定的支架上。
    5. 确保整个攀爬管位于摄像画面内。
  3. 实验步骤
    1. 将攀爬管在置于坚固表面的泡沫垫或鼠标垫上用力敲击三次，使所有果蝇同时跌落至管底。
    2. 立即开始录制视频，持续 10–12 秒，帧率约为 30 帧/秒。
    3. 允许果蝇自由攀爬 10 秒。
    4. 每管至少进行三次独立重复实验。
    5. 每次实验之间留出 10 分钟的休息间隔。
    6. 对每种实验条件（如对照组、药物处理组和溶剂对照组）均进行实验。
    7. 统计在 10 秒内到达或越过 10 cm 标记线的果蝇数量。
    8. 记录 E 为到达 10 cm 的果蝇数量。
    9. 记录 T 为测试的活果蝇总数。
    10. 计算攀爬活动百分比：(E/T) × 100。
    11. 对三次重复实验的结果取平均值。
    12. 以均值 ± 标准差（mean ± SD）形式报告结果。
  4. 使用 Python 脚本进行半自动化攀爬分析
    1. 视频采集
      1. 使用智能手机摄像头记录负趋地性实验，摄像头应垂直于高 12 cm、直径 2 cm 的透明攀爬管。使用智能手机或数码相机以约 30 帧/秒的帧率和至少 1280 × 720 像素的分辨率进行录制。将摄像头固定在距攀爬管约 15–20 cm 的位置，并在所有录制中保持相同的采集几何构型。使用已知的管高（12 cm）作为基于像素测量的内部空间校准参考。
      2. 将攀爬管置于均匀的白色背景前。
      3. 录制时长为 10–12 秒的视频。
      4. 保持所有录制过程中的光照条件恒定。
      5. 保持所有录制过程中摄像头距离恒定。
      6. 保持所有录制过程中攀爬管位置恒定。
      7. 尽量减少质心检测的变异性。
      8. 将录制的视频保存为 .mp4 格式。
      9. 将视频传输至台式计算机进行分析。
    2. 基于 Python 的视频处理
      1. 使用作为补充文件 1提供的定制内部 Python 脚本分析视频。所有分析均在 Python 3.12.1 环境中进行，依赖库包括 OpenCV（cv2）4.9.0 版、NumPy 1.26.4 版、Pandas 2.2.0 版、Matplotlib 3.5.2 版和 Scikit-learn 1.4.2 版。
        1. 在从 Python 环境或命令行界面执行脚本前，需在补充文件 1中指定输入视频路径和输出目录。
        2. 编辑 VIDEO_PATH 和 OUTPUT_CSV 变量后，运行 python climbing_analysis.py 脚本。
      2. 使用 OpenCV（或 cv2）进行帧处理和目标检测。
      3. 使用 NumPy 进行数值计算。
      4. 使用 Pandas 进行数据导出。
      5. 使用 Matplotlib 进行可视化。
      6. 逐帧处理每个视频。
      7. 使用 OpenCV 的 VideoCapture 函数读取视频。
      8. 按顺序处理单个帧。
      9. 将帧转换为灰度图像。
      10. 应用高斯模糊以减少背景噪声。
      11. 采用 Otsu 阈值法在二值反向模式下分割果蝇与背景。
      12. 执行形态学开运算和闭运算，以去除小的伪影并填补轮廓间隙。
      13. 识别面积超过 60 像素2 的轮廓，以排除背景伪影和微小噪声颗粒。
      14. 计算每个有效轮廓的空间矩。
      15. 确定每个有效轮廓的质心坐标 x 和 y。
      16. 当单帧中检测到多只果蝇时，对质心坐标取平均值。
      17. 每帧获得一个代表群体的平均位置。
    3. 质量控制评估
      1. 通过确认检测到的轮廓在整个录制过程中与可见果蝇一致，验证果蝇分割的成功性。
      2. 使用均匀白色背景和稳定的照明条件，确保果蝇与背景之间具有足够的对比度。
      3. 排除包含过度反光、阴影、管体移动、果蝇严重重叠或攀爬管显示不全的视频。
      4. 若在录制的大部分时间内质心追踪失败，或阈值分割持续产生背景伪影，则认为该视频不适合分析。
    4. 攀爬参数提取
      1. 按照步骤 5.3.7 所述手动计算攀爬评分。
      2. 以像素为单位计算攀爬高度，即初始与最终垂直质心位置之差。
      3. 以像素/秒为单位计算平均速度，即总轨迹长度除以录制时长。
      4. 以像素/秒为单位计算峰值速度，即连续帧间最大瞬时位移。
      5. 以像素为单位计算轨迹长度，即跨帧累计移动距离。
      6. 以像素2 为单位计算轨迹面积，即包围所有质心位置的凸包面积。
      7. 计算转向次数，即水平方向改变的次数。
      8. 计算停止次数，即连续帧间质心位移低于 3 像素停止距离阈值的帧数。
      9. 绘制垂直位置随时间变化的曲线，以客观评估主动攀爬表现。
      10. 在录制的主动攀爬阶段，使用滚动的 1 秒线性回归窗口计算每秒像素的攀爬斜率。
      11. 将斜率值作为主要的运动表现指标，用于与生存分析整合。
      12. 将定量的运动参数（包括攀爬高度、平均速度、峰值速度、轨迹长度、轨迹面积、转向次数、停止次数和攀爬斜率）导出为 .csv 文件。将斜率可视化图表保存为 .png 图像文件，用于质量验证和后续分析。

6. 早期运动健康与生存分析的整合

  1. 将生存数据导出为包含组别、天数和存活果蝇数量列的 .csv 文件。
  2. 通过将每个时间点各组的存活果蝇数量除以初始群体大小，计算每组在每个时间点的生存比例。
  3. 通过生存比例对时间进行梯形数值积分，计算生存曲线下面积（AUC）。
  4. 将运动表现数据导出为包含各组第7天攀爬斜率的 .csv 文件。
  5. 通过将每组第7天的斜率值除以对照组（Canton S）相应的斜率值，将第7天的运动表现标准化至对照组。
  6. 将各基因型的标准化第7天运动表现值与其对应的生存AUC值合并。
  7. 对标准化的第7天运动表现和生存AUC进行描述性比较，以评估早期运动功能下降与生存结果之间的关系。
  8. 生成标准化第7天运动表现和生存AUC值的图形可视化结果（补充文件 2）。
    注意：使用提供的自定义 Python 脚本（补充文件 2）执行所有生存–运动整合分析。使用 Pandas 进行数据处理和数据集合并，NumPy 进行梯形数值积分，Matplotlib 进行图形可视化。

7. 统计学分析

  1. 以生物学重复管获得的代表性数据集形式呈现运动能力和存活率的测量结果。
  2. 将运动能力的测量结果报告为各独立爬升实验的平均值。
  3. 通过爬升斜率（像素/秒）和存活率曲线下面积（AUC）值的图形化展示，说明运动表现与存活结果之间的代表性关系。

结果

标准化饲养条件下可重复的寿命特征谱
当果蝇在受控的环境条件下饲养时（25 °C，60% 湿度，12 小时光照：12 小时黑暗循环）条件下，使用新配制的标准食物饲养时，对照组在独立重复实验中表现出一致的生存曲线。Canton S 对照组果蝇的中位寿命约为 65–72 天，最长存活时间可达 75 天（图2）。每个条件下进行 2 次生物学重复实验，每次包含 20 只果蝇。在标准化的环境和食物条件下获得的代表性生存轨迹显示，对照组群具有可重复的寿命特征。

相比之下，泛神经元表达淀粉样蛋白β的果蝇相较于Canton S对照组表现出生存率降低，这与此前报道的果蝇阿尔茨海默病模型中的神经退行性表型一致4,5,6.

当食物质量下降或操作条件不一致时，可能导致不理想的寿命结果。在这些条件下，前7–10天内会出现早期死亡率激增，并且瓶间变异度（>25%）增加，表明实验可重复性受损，生物学重复之间的一致性降低。

通过半自动攀爬分析检测到的年龄依赖性运动能力下降
传统的手动负向趋地性评分检测到，在表达淀粉样蛋白β（amyloid-β）的果蝇中，其运动能力随年龄增长而下降，与Canton S对照组相比存在差异（图3）。在第7天时，各组之间的攀爬表现总体相当；而在第28天时，表达淀粉样蛋白β的果蝇相较于对照组果蝇表现出攀爬活动减少。对照组群体在衰老过程中的各个时间点均保持相对稳定的攀爬表现。这些通过手动评分获得的行为趋势与半自动FlyTrDT分析流程所得的攀爬斜率值降低结果一致，显示出与传统终点评分法及计算追踪工作流程相似的年龄依赖性变化趋势（图4）。在表达淀粉样蛋白β的果蝇中观察到的运动能力下降，与已有研究中利用传统负向趋地性实验在果蝇神经退行性疾病模型中报道的年龄依赖性行为功能障碍一致6,7。

使用 FlyTrDT 进行半自动爬行分析显示，对照组果蝇的早期运动功能得以保留。在第 7 天，对照组果蝇的平均爬行斜率为 86.64 像素/秒，反映了在活跃爬行阶段持续的向上位移（图 4）。到第 28 天时，斜率接近零（−1.50 像素/秒），符合与年龄相关的运动减缓现象。

相比之下，表达淀粉样蛋白β的果蝇表现出早期运动功能障碍。在第7天，其攀爬速度下降至34.25像素/秒，经归一化处理后约为对照组的39%。到第28天时，攀爬速度显著下降至−72.25像素/秒，表明其向上运动能力严重受损。

基于斜率的度量方法可捕获主动攀爬阶段，并减少初始惊跳潜伏期、平台期以及随机运动伪迹的干扰。正斜率表示净向上运动，接近零的斜率表示垂直位移有限，负斜率则表示净向下位移。这些代表性轨迹显示，在表达淀粉样蛋白β的果蝇中，相较于同龄对照组，运动功能呈现进行性下降。

在最佳记录条件下，FlyTrDT 流程生成了具有稳定轮廓分割和一致垂直位移特征的连续质心轨迹（图 4A）。表达淀粉样蛋白β的果蝇运动能力下降，表现为向上的运动轨迹持续时间缩短，斜率值降低（图 4B–D). 在质量控制评估过程中，因反光过强、试管位置不稳定、光照不一致或背景对比度不足而导致质心轨迹不连续或出现间歇性追踪伪影的视频被排除。

早期运动表现与生存结局之间的关联
为检验早期运动表现与生存结局之间的关联，将标准化的第7天攀爬斜率值与不同基因型的生存曲线下面积（AUC）进行了比较图5对照果蝇在早期运动表现保持正常时（标准化运动指数 = 1.0），其生存曲线下面积（AUC）值较高（48.2）；而表达淀粉样蛋白β的果蝇在早期运动表现下降时（标准化运动指数 = 0.395），其生存AUC值较低（24.65）。每种条件下各取两个生物学重复样本管生成代表性运动行为数据集。这些代表性数据提示，在淀粉样蛋白β疾病模型中，早期运动能力下降与寿命缩短之间存在关联。由于仅分析了两种代表性基因型，因此这些结果以描述性方式呈现，而非具有统计学效力的预测性相关分析。

转基因果蝇攀爬实验；阿尔茨海默病研究的箱线图与Kaplan-Meier生存曲线。
图1：整合运动健康寿命指标与生存分析的半自动化FlyTrDT流程工作流示意图。 该工作流包括标准化的果蝇培养与寿命分析、手动及半自动负向趋地性评估、从攀爬视频中逐帧提取质心位置、计算攀爬斜率（像素/秒）、生存曲线下面积（AUC）分析，以及运动表现与生存结果的整合分析。请点击此处查看该图的放大版本。

CS对照组与Aβ组的生存分析图；随天数变化的生存概率。
图2：Canton S对照果蝇与表达淀粉样蛋白-β果蝇的Kaplan–Meier生存分析。生存曲线展示了在标准化环境和饮食条件下果蝇的寿命变化趋势。与全神经元表达淀粉样蛋白-β的果蝇相比，Canton S对照组果蝇表现出更长的生存期，后者在衰老过程中的各个时间点均显示出寿命缩短。数据来自每种条件下两个生物学重复瓶中的代表性生存轨迹。请点击此处查看该图的放大版本。

果蝇攀爬实验结果；箱线图比较了第7天和第28天CS与elav-Gal4/UAS-Aβ42的差异。
图3： 对照组与表达淀粉样蛋白β的果蝇在第7天和第28天的负向趋地性行为手动检测结果。箱线图显示了以10秒内越过10 cm阈值的果蝇百分比表示的代表性攀爬活动测量值。Canton S（CS）对照组果蝇在衰老过程中攀爬活动相对稳定，而表达淀粉样蛋白β的果蝇在第28天时攀爬能力显著下降。每个数据点代表一个独立的试管测量值。代表性数据来自每种条件下两个生物学重复试管。 请点击此处查看该图的放大版本。

爬高高度分析；图 A-D 显示像素/秒斜率；时间与高度曲线；数据趋势。
图 4：对照组与表达淀粉样蛋白β果蝇的爬行轨迹及主动爬行斜率的半自动提取。使用 FlyTrDT 跟踪流程从负向趋地性视频中提取代表性平均垂直位置轨迹。蓝色轨迹表示随时间变化的检测果蝇帧间平均垂直质心位置，红色片段表示通过滑动线性回归窗口识别出的代表性主动爬行阶段。斜率值以像素/秒表示。（A）第 7 天 Canton S 对照组果蝇。（B）第 7 天表达淀粉样蛋白β的果蝇。（C）第 28 天 Canton S 对照组果蝇。（D）第 28 天表达淀粉样蛋白β的果蝇。每种条件下各取两个生物学重复样品管生成代表性轨迹。请点击此处查看该图的放大版本。

早期运动健康与生存率关系图；坐标轴显示归一化的第7天运动健康值和生存率曲线下面积（AUC）。
图 5：果蝇淀粉样蛋白-β毒性模型中早期运动表现与生存结果的关联。 将对照组（Canton S，CS）果蝇与表达淀粉样蛋白-β（AD）果蝇的第7天归一化爬行斜率值与生存率曲线下面积（AUC）进行对比（n = 2）。与表达淀粉样蛋白-β的果蝇相比，对照组果蝇表现出更高的早期运动能力和更高的生存率AUC值。这些代表性数据集展示了早期运动能力与生存结果之间的关联。请点击此处查看该图的放大版本。

补充文件 1：基于 Python 的 FlyTrDT 爬升分析脚本，用于从负向趋地性视频中半自动量化运动行为。该脚本可进行逐帧图像处理、质心检测、轨迹提取，并计算爬升参数，包括爬升斜率、速度、轨迹长度、轨迹面积、停止次数和转向次数。请点击此处下载该文件。

补充文件 2：用于整合运动健康寿命与寿命数据的 Python 脚本。该脚本执行生存率计算、梯形曲线下面积（AUC）分析、第 7 天攀爬斜率值的归一化处理、数据集合并，以及运动表现和生存结果的图形化可视化。请点击此处下载该文件。

讨论

本文介绍了一种将果蝇（Drosophila melanogaster）寿命分析与半自动运动健康寿命定量相结合的实验方案。寿命与运动能力测量结果的可靠整合在很大程度上依赖于环境条件的一致性、食物质量以及在不同生物学重复之间标准化的操作流程7。若食物干湿度存在差异、转移操作延迟或死亡率统计不一致，可能引发早期死亡率激增及不同试剂瓶间的变异增大，从而影响生存曲线的准确重建以及对衰老表型的后续解读。

在进行负向趋地性实验时，必须保持一致的光照条件、相机位置和试管排列，以确保视频处理过程中能够可靠地检测到质心。在分选过程中应尽量减少果蝇暴露于过量的CO₂，因为麻醉可能会影响其寿命和运动能力。当对同一群体进行多次行为测量时，实验应在每天的相同时间进行，以减少昼夜节律带来的变异性。背景对比度不足或光照不均匀可能会影响自动分析过程中的阈值分割和轮廓检测。如果在视频处理过程中观察到轮廓断裂或质心轨迹不稳定，应改善背景对比度、减少反光、稳定相机位置，并确保各次记录中的光照均匀一致。通过调整拍摄角度、减少阴影或确保整个攀爬试管始终完全处于画面内，可尽量减少持续存在的阈值分割伪影。试管内果蝇过度聚集可能影响质心定位的准确性，应通过在不同实验中保持一致的群体数量来尽量减少该问题。

传统的负向趋地性实验通常通过量化在固定时间间隔内达到预设高度的果蝇比例，广泛用于评估衰老和神经退行过程中的运动能力下降5,6。相比之下，本研究中的半自动化工作流程提取了向上运动的主动攀爬阶段，并基于逐帧质心轨迹计算主动攀爬斜率（像素/秒）。由于每帧中的质心位置是对该帧内所有被检测果蝇进行平均所得，因此无法解析个体的运动轨迹以及果蝇之间的行为异质性。该方法减少了惊跳反应潜伏期、短暂停顿和聚集行为对基于终点的人工评分结果的影响。与传统的基于终点的评分方法不同，本工作流程还可提供连续的、上升斜率（像素/秒）测量值，从而实现对不同年龄和基因型之间运动功能衰退的定量比较。近年来，类似的计算追踪方法 increasingly 被应用于果蝇行为分析中，借助自动化的运动量化平台，以提高分析的客观性和一致性8,9,10,11,12。

还应考虑若干其他局限性。基于像素的爬升斜率测量（像素/秒）依赖于实验间一致的相机校准和录制几何条件。相机距离或分辨率的差异可能影响斜率的绝对值，因此需要以内部对照进行归一化处理。此外，尽管在此展示的淀粉样蛋白-β模型中，早期运动功能下降在定性上与生存期缩短相关，但在更多基因型、干预措施或药物治疗条件下进行更广泛的验证，将有助于加强运动表现与生存结果之间关系的解读。本文展示的代表性数据集旨在演示工作流程的实施与解释方法，而非建立适用于不同疾病背景的通用预测模型。

尽管存在这些局限性，本方案仍为在衰老研究中将功能性健康寿命指标与生存结果关联提供了一个可重复且成本效益高的框架。该方法可轻松适用于功能衰退先于死亡的遗传操作、药物筛选范式及神经退行性疾病模型。通过将爬行斜率（像素/秒）的客观量化与标准化生存分析相结合，该方法有助于对果蝇衰老轨迹进行全面的表型分析。未来若将更多神经退行性遗传背景、药理学干预措施以及纵向行为数据集纳入研究，可能进一步增强该工作流程在整合性健康寿命分析中的应用价值13,14。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由阿姆里塔生物技术学院、阿姆里塔大学阿姆里塔普里校区提供资金支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂Himedia GRM666凝固剂
苯甲酸HimediaGRM488抗菌防腐剂
Canton-SBloomington Drosophila Stock CenterBDSC #1野生型参考品系
攀爬管定制N/A透明圆柱形管，高 12 cm × 直径 2 cm，由透明塑料或玻璃制成
玉米粉本地供应商 N/A果蝇饲料制备
台式/笔记本电脑任意厂商用户自定义最低双核处理器，≥8 GB 内存，支持 Python 3.x 的操作系统
D-葡萄糖HimediaMB037果蝇饲料组分
elav-GAL4Bloomington Drosophila Stock CenterBDSC #458泛神经元 GAL4 驱动子
Matplotlib开源库版本 3.5.2绘图与可视化
NumPy开源库版本 1.26.4数值计算
OpenCV开源库版本 4.9.0视频处理
Pandas开源库版本 2.2.0数据处理
丙酸HimediaGRM3658抗真菌防腐剂
PythonPython Software Foundation 版本 3.12.1分析环境
Scikit-learn开源库版本 1.4.2线性回归分析
智能手机相机 / 数码相机任意厂商用户自定义最低 30 帧/秒录制，对焦稳定，垂直定位，最低分辨率为 1280 × 720
蔗糖HimediaGRM601果蝇饲料组分
UAS-APP.Aβ.E693GBloomington Drosophila Stock CenterBDSC #33774人源 APP Arctic 突变模型
酵母HimediaRM027营养补充剂

参考文献

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